一种新型便携式甲霜灵胶体金试纸条显色分析....pdf

第3 0 卷第1 0 期 2 0 0 9 年l O 月 仪器仪表学报 C h i n e s eJ o u r n a lo fS c i e n t i f i cI n s t r u m e n t V 0 1 3 0 N o 1 0 O c t 2 0 0 9 一种新型便携式甲霜灵胶体金试纸条 显色分析仪的研制 赵友全1 杨成文1 陈峰2 肖松山1 1 天津大学精密仪器与光电子工程学院天津3 0 0 0 7 2 2 国家生物防护装备工程技术中心天津3 0 0 1 6 1 摘要 甲霜灵胶体金试纸条用于现场快速检测进出口蔬菜甲霜灵农药残留量 在对试纸条光谱测量分析的基础上 研制出 一种基于图像测量的便携式甲霜灵试纸条显色分析仪器 该仪器集成了样品滴定 定时检测 显色度分析 身份认证等多种 功能 实现了试纸条的自动检测 显色度数值分析和数据存储 实验测定了浓度为2 5 0r i g m E 的标准浓度甲霜灵农药滴定 的试纸条 结果表明 浓度 4 0n g m L 时 显色度差异不明显 关键词 农药残留 胶体金试纸条 显色度 光谱分析 中图分类号 T P 2 1 6 3文献标识码 A国家标准学科分类代码 5 2 0 6 0 4 0 D e v e l o p m e n to fan o v e lp o r t a b l ec o l o ra n a l y t i c a lr e a d e rf o r c o l l o i d a lm e t a l a x y ig o l dt e s ts t r i p s Z h a oY o u q u a n l Y a n gC h e n g w e n l C h e nF e n 9 2 X i a oS o n g s h a n l lC o l l e g eo f P r e c i s i o nI n s t r u m e n ta n dO p t o e l e c t r o n i c sE n g i n e e r i n g T a n f i nU n i v e r s i t y l t a n j i n3 0 0 0 7 2 C h i n a 2N a t i o n a lB i o P r o t e c t i o nE n g i n e e r i n gC e n t e r T u m j i n3 0 0 1 6 1 C h i n a A b s t r a c hA tp r e s e n t o n ek i n do fc o l l o i d a lg o l ds t r i pi si n t e n s i v e l ya p p l i e dt or a p i d l yd e t e c tt h em e t a l a x y lp e s t i c i d er e s i d u e s B a s e do nt h em e a s u r e ds p e c t r a lp r o p e r t yo ft h ec o l l o i d a lg o l ds t r i p s t h i sp a p e rp r e s e n t san o v e l p o r t a b l ec o l o ra n a l y t i c a lr e a d e r w h i c hi n t e g r a t e ss a m p l et i t r a t i o n r e g u l a rt i m e r c o l o r a t i o na n a l y s i sa n dm o d e l i d e n t i f i c a t i o ni n t oo n ei n s t r u m e n t i tC a na c h i e v ea u t o m a t i cr e a d i n gt h es t r i p s a n a l y z i n gc o l o rv a l u ea n ds a v i n g d a t a M o r e o v e r s o m ep r a c t i c a lm e t a l a x y ld i p s t i c kt e s t sh a db e e nc a r r i e do u tw i t hag i v e nc o n c e n t r a t i o nr a n g e f r o m2 5 0n g n 1 L t h er e s u l t si n d i c a t et h a tt h es t r i pc o l o ri sl i n e a rw i t ht h ec o n c e n t r a t i o nw h e nt h et i t r a t i o ns o l u t i o ni sl e s st h a n4 0n g m L b u ti th a sn om u c hd i f f e r e n c ew h e ni ti sg r e a t e rt h a n4 0n g n 1 L K e yw o r d s p e s t i c i d er e s i d u e c o l l o i d a lg o l ds t r i p c o l o ra n a l y s i s s p e c t r a la n a l y s i s 1 引言 甲霜灵是一种广泛应用于蔬菜 瓜类 水果等作物的 病害防治的广谱杀菌剂 具有内吸附性强 残效期长的特 点 进出口果蔬中常能检测出甲霜灵残留 世界各国对甲 霜灵的残留量都有明确的规定l l J 目前国内普遍采用色谱 法来测定甲霜灵残留量 2 此类方法只局限于实验室环境 而且所需仪器设备复杂 样品处理程序繁琐 不适合对大 量样品快速筛选 胶体金检测技术是一种低成本 方便快 捷 灵敏高效 稳定性强的快速检测技术 广泛应用于食 收稿日期 2 0 0 9 0 2R e c e i v e dD a t c 2 0 0 9 4 3 2 品药品 水质 生化防护 医疗卫生领域1 3 l 甲霜灵胶体 金试纸条结合免疫反应技术和胶体金检测技术 4 J 采用竞 争法进行检测 可快速检测果蔬中甲霜灵残留情况 甲霜灵胶体金试纸条通过试纸条上测试线的颜色变 化直观显示检测结果f 5 J 胶体金标记物随着溶液流向测试 线 若样品液中无甲霜灵 胶体金标记物与测试线上蛋白 特异性结合形成线条 标记为阴性 若样品液中存在甲霜 灵 则与测试线上甲霜灵抗体结合 使得金标记物不能和 测试线上物质结合 不显色 标记为阳性 通过对比标准 比色卡 目测即可得到定性检测结果 目测判读方法 在 万方数据 2 1 7 6 仪器仪表学报 第3 0 卷 长期的应用中暴露出很多问题 1 检测人应具备一定专业 知识 当照明条件不好 或者有大量试纸条需要判读时 易产生人为误差 2 当待检测物质处于临界浓度范围内 时 试纸条测试线显色浅而且不规则 难以目测判读 3 目测判读得到的是定性结果 检测人员的主观性可能影响 结果判定 4 缺乏电子数据记录 研制一种具备信息检测 信息处理 信息记忆 逻辑思维与判断功能的智能化胶体 金试纸条分析仪替代人眼目测显色结果变得尤为必要 国内外已开始试纸条检测仪的相关研究 采用光纤怕1 或者线阵C C D l 7 1 光电传感器 检测仪机械结构复杂 局 限于室内应用 本文采用商阵C M O S 图像传感芯片研制 基于图像测鼍的胶体金试纸条检测器 系统集成样品滴 定 定时检测 显色度分析 身份认证等多种功能 实 现了试纸条的自动检测 显色度数值分析和数据存储 配备甲霜灵胶体金试纸条 可对进出口蔬菜中甲霜灵农 药残留进行现场快速分析检测 2 胶体金试纸条显色和检测原理 胶体金试纸条应用的金纳米颗粒大小在2 0n m 至 1 2 0n m 之间 此大小金颗粒能有效地反射可见光 对绿 光效果最理想 8 l 本文设计胶体金试纸条显色分析仪检测 对象是胶体金试纸条 由吸光原理知 颜色深浅与光吸 收和反射程度有关 颜色越浅 吸收光强越小 反射光 强越大 当试纸条测试线卜抗体或抗原与甲霜灵匹配时 测试线显色浅 当抗体或抗原不匹配时 测试线显色深 因此试纸条显色深浅反应甲霜灾溶液浓度信息 如图l 所示 试纸条被划分为控制线搜索区 虚线范围 参照背景区和测试线 剩余均为背景区 控制线处于控制线 搜寻区内 不同试纸条 控制线位置可能不同 必须动态搜 寻来确定控制线在搜寻区的确切位置 控制线 参照背景区 测试线三者中心距离恒定不变 因此 控制线位置确定后 即可计算出参照背景区和测试线位置 测量过程中 镜头与 试纸条距离 图像传感芯片成像参数不变 参照背景区和两 条线在图像上成像大小基本不变 因此得到控制线后 即可 推算出参照背景区和测试线显色特征 图1 胶体金试纸条结构 F i g 1C o l l o i d a lg o l dt e s ts t r i ps t r u c t u r e 3 基于视觉测量的检测系统 3 1 系统组成和功能 胶体金试纸条显色分析仪系统组成如图2 所示 组成 模块有 主控制器 电源管理 恒流源控制 C M O S 图像 采集模块 热敏打印机 实时时钟 R F I D 射频模块 L C D 显示 按键 F l a s h 存储器等 研制得到样机见图3 图2 分析仪器系统框图 F i g 2S y s t e mb l o c kd i a g r a m 图3 试纸条分析仪实物幽 F i g 3T h eu t i l i t yo ft h es t r i pr e a d e r 本文研制的便携式甲霜灵胶体金试纸条显色分析仪 具有以下特点 单个L E D 电源照明 简化硬件设计 面 阵C M O S 图像传感芯片采集试纸条图像 省略线阵器件 的机械扫描结构 硬件设计简单 采集图像所需时间短 系统中添加R F I D 射频模块 当试纸条中嵌入I C 存储卡 时 通过R F I 读写模块町实时读取试纸条相关信息 如 生产日期 检测物质类型等 胶体金显色为动态过程 超 过一定时间范围显色结果无意义 写入I c 卡的检测结果 具有长期存档作用 系统为便携式手持仪器 热敏打印机 集成于系统内部 优化电源管理模块 电池和交流适配器 双通道供电切换 可自动进入省电模式 切断所有外设供 电 主控制器进入休眠状态 主控制器选用美国硅实验室 公司生产C 8 0 5 1 F 1 2 0 高速芯片 芯片内核兼容标准8 0 5 1 内核 最高主频达9 0k H z 峰值性能能够达到1 0 0M I P S 能满足大量图像数据传输与分析处理工作 万方数据 第1 0 期赵友全等 一种新型便携式甲霜灵胶体金试纸条显色分析仪的研究 2 1 7 7 3 2 照明光源发射光强空间不均匀度影响与去除 图像采集子系统是甲霜灵胶体金显色分析仪的关键 部分 原始图像数据的获取决定着整个系统分析结果的 准确性 系统中C M O S 摄像头处于像场的正上方 L E D 光源处于边缘 L E D 光源倾斜照明整个视场 试纸条上 入射光强与试纸条到L E D 光源的距离有关 距离越远 入射光强越弱 入射光强存在空间不均匀度 采集得到 图像光强也是不均匀的 胶体金试纸条显色分析仪中设计了专用试纸条限位 匣 胶体金试纸条在图像采集系统中的位置固定 而且 不同试纸条在匣中位置基本一致 已知L E D 光源光强随 时间变化可忽略 不同试纸条背景光强在空间上分布是 一致的 因此可利用标准图像与检测图像光强时间分布 相似性 来校准检测图像背景空间的不均匀性 算法原 理是采集空白条图像 作为参考图像G 统计参考图像 典型特征 如强度最值肘 计算参考图像每个像素点 系数 得到系数矩阵y 保存到系统内存中 检测时 先利用系数矩阵y 对试纸条显色图像P 进行修正 来校 正图像P 空间不均匀性 见式 1 P P y M P G 1 3 3 图像预处理 图像系统采集试纸条图像主要存在加性高斯噪声和随 机噪声以及高频噪声 图像处理过程中 采集多幅连续图像 求均值来抑制高斯噪声 提高信噪比 利用3 x 3 小平滑模板 对图像进行多次线性滤波 来抑制随机噪声和高频噪声 3 4 控制线 测试线的识别和试纸条显色度分析 由于生产和摆位误差影响 控制线在控制线搜寻区内 位置不定 图像识别过程中必须采用算法动态搜控制线位 置 然后推算背景参考区和测试线的位置 甲霜灵胶体金 试纸条显色分析仪系统工作以及图像处理流程图见图4 图4 系统工作流程图 F i g 4S y s t e mf l o wc h a r t 3 4 1 控制线识别与显色特征 控制线在控制线搜寻区中位置不固定 在图像处理 过程中动态搜寻控制线的位置 为了减少图像处理数据 量 首先对控制线位置粗略定位 然后采用模板匹配算 法精确匹配控制线 识别出控制线 第1 步 控制线定位 算法原理是 在控制条搜寻 区 图l 中虚线框区域 内 对每一行像素点灰度值求 和得到行总和S 以行序号为轴 得到行总和S 分布 见图5 逆时针旋转9 0 已知控制线显色灰度值比 周围背景区灰度值小 图像中点P l P 2 之间波谷标定为 控制线中心的可能区域 行序号 图5 行灰度总和S 分布 F i g 5C o n t r o ll i n es u m f u n c t i o nS 第2 步 控制线精确匹配 选取与控制线大小相同 模板M 假设模板长L 宽w 点 f 为模板中心点 见 式 2 V 表示以点 f 为中心点的理论控制线的显色 强度值 见式 3 在P l P 2 决定子区域中 y 最小值 的中心坐标点P r 即为控制线实际中心点 y 最小值记 为倪 表示控制线显色强度值 喀L W 泛I 1 V j f G 工 M y 工 3 y j L 1 2x i W 1 2 3 4 2 参照背景区和测试线中心位置 已知控制线 参照背景区 测试线三者中心距离恒 定不变 尸c 为控制线中心 参照背景区中心P 测试线 中心P f 由式 4 计算得到 参照背景区在图像上成像 大小基本不变 以只中心点参照背景区所有像素点求均 值G 为参照背景强度 C P o d 2 C 只 d 4 3 4 3 测试线显色特征以及显色度定义 测试线是甲霜灵与胶体金标记物发生生化反应的区 域 测试线是否显色 显色深浅反应出带检测溶液中甲 万方数据 2 1 7 8仪器仪表学报 第3 0 卷 霜灵含量 对测试线的准确识别是整个分析仪的核心 决定了分析仪准确性 当甲霜灵处于临界浓度值范围是 测试线显色不规则而且较浅 不易与背景区分开 在测 量中 通过综合测试线全局强度和局部强度信息来准确 识别测试线 避免漏检 全局强度G 为测试线内所有点灰度均值 局部强度G 2 计算 将测试线划分为大小相同 个子 圳们 G 表示第f 个子域内所有像素点强度均值 设定阈 值丁 通过多次实验确定最佳值 个子域中 强度均值 G 小于阈值丁的子区域集和 1 表示发生显色反应区域 n 表示发生显色反应子区域个数 剩余子区域全归入无 显色反应集和 2 对集合 中所有子域求均值得到r 线局部强度G 2 见式 5 G 2 G n G j 丁 5 测试线显色强度G 由测试题的全局显色强度和局部 显色强度加权得到 见式 6 G f 毛 G I 七 G 2 6 k 如分别为全局强度和局部强度的权值 且满足 毛 k s l 胶体金试纸条测试线显色深浅对应的是待检测溶液 中甲霜灵浓度信息 测试线显色深浅用显色度G r a d 来表 示 定义见式 7 配置甲霜灵标准溶液 测量标准曲 线 建立测试线显色度与浓度之间关系式 测量中 根 据测试线显色度计算出甲霜灵浓度值 G r a d I G 一G f l G r 7 4 实验及其结果 实验中采用纯度为9 7 5 甲霜灵农药标准品 稀释 配制2 g m L 5n g m L 1 0 n g m L 2 0n g m L 4 0n g m L 5 0n g m L 等6 个不同浓度甲霜灵标准液 胶体金试纸条 显色为动态反应 从滴定开始定时4m i n 检测此时甲霜 灵胶体金试纸条显色度 一般试剂从滴定到与测试线完 全反应需要2 3m i l l 时间 实验中 采集滴定后3 分4 5 秒 4 分 4 分1 5 秒时间点的3 幅图像 作为后续图像 处理原始数据 图6 是试纸条与不同标准液作用后显色图像 图中 处于上面的黑线是质控线 控制线 与质控线对齐处于 下部的是样本显色线 又称测试线 从图中可以看出 质控线显色深而且边缘规则 与背景区分度大 样本线 显色深度随着标准溶液浓度增大逐渐变小 当浓度大于 等于2 0n g m L 时 测试线与背景已无明显区分度 而且 边缘界限模糊 a J b c d e o 图6 a 一 f 分别是2 5 1 0 2 0 4 0 5 0 n g m L 标准液试纸条显色图像 F i g 6 a 一 f S t r i pi m a g e so f2 5 1 0 2 0 4 0a n d5 0 n g m L s t a n d a r dm e t a l a x y ls o l u t i o n s 对不同浓度的样本重复测量1 5 次 分析所得到试纸 条测试线显色度数据结果见表l 表1 试纸条重复性实验数据 T a b l elE x p e r m e n t a ld a t ao fs t a p e s n g m L 从表1 可以看出 显色度值和浓度值之间存在较好的 对应关系 对显色度c v 与浓度G 线性拟合得一次曲线为 C 0 0 0 5 5 q 0 3 9 2 8 萨 0 8 7 说明二者有明显的线性关系 显色度值可 以较好地用于定量分析农药残留 而在浓度大于等于 4 0n g m L 时 试纸条显色不明显 人眼很难分辨 仪器 读出值小于0 1 5 可定性判断此时为阳性条 仪器重复性测试表明对不同浓度其显色值有较好一 致性 但仍有一定的重复性误差 产生误差的原因 一 方面胶体金显色是动态生化反应 而且胶体金颗粒大小 和均匀度 反应时间长短 温度以及抗原 抗体活性 以及试样条的生产工艺都会影响胶体金显色结果 另一 方面图像检测本身有背景噪声 当显色明显 浓度较低 条纹与背景对比度较大时 对结果影响不大 反之 当 图像对比度不大时的影响较大 因此对甲霜灵进行完全 定量检测还是存在一定困难的 5 结 论 本文设计了一种基图像测量甲霜灵胶体金试纸条分 析仪 仪器采用高亮L E D 进行照明 通过C M O S 图像 传感器获取试纸条图像 综合运用计算机技术和数据统 计技术理解 分析和判断图像 获取试纸条检测结果 能够实现大爱检测结果存储和数据的分析 并且具备小 型便携特征 本文通过甲霜灵实验说明 本分析仪能够 对甲霜灵农药残留实现定性分析和半定量检测 可广泛 万方数据 第1 0 期赵友全等 一种新型便携式甲霜灵胶体金试纸条显色分析仪的研究 2 1 7 9 应用于现场快速检测 参考文献 l 庄无忌 各国食品和饲料中农药兽药残留限量大全 M 北京 对外经济贸易出版社 1 9 9 5 Z H U A N GWJ T h ec o m p r e h e n s i v ec o m p i l a t i o no f n a t i o n a lm a x i m u mr e s i d u el i m i t sf o rp e s t i c i d e sv e t e r i n a r y d r u g si nf o o d s t u f fs a n df e e d ss t u f f s i nt h ew o r l d M B e i j i n g F o r e i g n E c o n o m i cR e l a t i o n sa n dT r a d e P u b l i s h i n gH o u s e 1 9 9 5 2 吕保英 史书声 戴立贤 等 食品分析大全 M 北京 高 等教育出版社 1 9 9 7 5 5 8 5 6 1 L VBY S H IS HS H D A ILX e ta 1 E n c y c l o p e d i ao f f o o da n a l y s i s M 1 B e i j i n g H i g h e rE d u c a t i o nP r e s s 1 9 9 7 5 5 8 5 6 1 3 何小维 赵喜红 刘晓云 等 胶体金快速检测技术的研 究进展 J 中国人兽共患病学报 2 0 0 7 2 3 1 8 6 8 8 H EXW Z H A OXH L I UXY e ta 1 C o l l o i d a lg o l d r a p i dd e t e c t i o nt e c h n o l o g yr e s e a r c h J C h i n e s eJ o u r n a lo f Z o o n o s e s 2 0 0 7 2 3 1 8 6 8 8 4 周洪斌 徐文久 朱金连 等 进出口植物产品中甲霜灵 残留昔酶连免疫检测试剂盒的研究 J 免疫学杂志 2 0 0 5 2 l 3 S 1 3 8 一S 1 4 1 Z H O U H B X U WJ Z H UJ L e ta 1 R e s e a r c h o f E L I S A k i tf o rs c r e e n i n gm e t a l a x y lr e s i d u e si ni m p o r t i n ga n d e x p o r t i n gp l a n t s J I m m u n o l o g i c a lJ o u r n a l 2 0 0 5 2 l 3 S 1 3 8 一S 1 4 1 5 赵海锋 甘一如 胶体金免疫层析法检测小分子物质 J 农药 2 0 0 7 4 6 7 4 3 9 4 4 1 Z H A oHF G A NYR C o l l o i d a lg o l di m m u n e c h r o m a t a g r a p h i ca s s a yf o rt h ed e t e c t i o no fs m a l lM o l e c u l e J A g r o c h e m i c a l s 2 0 0 7 4 6 7 4 3 9 4 4 1 6 杜民 杨富文 费鸿俊 光电传感器在金免疫层析试条定 量测定中的应用 J 仪器仪表学报 2 0 0 5 2 6 7 6 7 1 6 7 3 D UM Y A N GFW F E IHJ A p p l i c a t i o no fp h o t o e l e c t r i c s e n s o rt oq u a n t i t a t i v ed e t e r m i n a t i o no fi m m u n o c h r o m a t o g r a p h i ca s s a ys t r i p J C h i n e s e J o u r n a lo fS c i e n t i f i c I n s t r u m e n t 2 0 0 5 2 6 7 6 7 1 6 7 3 7 1 汪噤 白玉洁 张艳超 基于C C D 的胶体金试纸条光电 检测仪器设计及实验研究 J 传感技术学报 2 0 0 8 2 l 8 1 3 7 m 1 3 7 3 W A N GY B A IYJ Z H A N GY C H D e s i g na n dr e s e a r c h o fap h o t o e l e c t r i c a la p p a r a t u sf o rl a t e r a l f l o wb a s e do n C C D I J C h i n e s eJ o u r n a lo fS e n s o r sa n dA c t u a t o r s 2 0 0 8 2 l 8 1 3 7 0 1 3 7 3 8 J 舢 璐C H E L E NB J O A N N AS e ta 1 P r e s e n ta n d f u t u r e a p p l i c a t i o n so fg o l d i nr a p i da s s a y s E B O L h t t p w w w c m d m c o r n a r t i c l e s p h p 9 李强 张钹 一种基于图像灰度的快速匹配算法 J 软 件学报 2 0 0 6 1 7 2 2 1 6 2 2 2 UQ Z H A N GB Af a s tm a t c h i n ga l g o r i t h mb a s e d