枯草芽孢杆菌菌株A 抗菌蛋白的分离纯化及抗真菌机理.pdf

中国农业科学 2011 44 1 67 74 Scientia Agricultura Sinica doi 10 3864 j issn 0578 1752 2011 01 008 收稿日期 2010 04 21 接受日期 2010 08 05 基金项目 河北省农业科技成果转化项目 10820304D 联系方式 彭 兵 E mail通信作者王立安 Tel 0311 86268425 E mail wlian1965 枯草芽孢杆菌菌株 A 抗菌蛋白的分离纯化及抗真菌机理 彭 兵 张树斌 贾 宇 王立安 河北师范大学生命科学学院 石家庄 050016 摘要 目的 揭示生防菌枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis 菌株 A 产生的抗真菌蛋白的性质及作用机理 方法 采用硫酸铵沉淀菌株 A 发酵液获粗蛋白 采用 DE52 离子交换层析技术对粗蛋白进行分离纯化 对具抗真 菌活性的纯化组分采用 MALDI TOF MS 进行结构分析 以玉米小斑病菌 Bipolaris maydis 为材料 对纯化活性蛋 白的抗真菌机理进行研究 结果 从粗蛋白中分离到一种抗真菌活性蛋白 FV 与 RNA 结合蛋白 Hfq Bacillus subtilis subsp subtilis gi 16078797 的匹配率为 86 484 相对分子质量为 8 508 5 Da 等电点为 8 04 FV 对玉米小斑病菌孢子萌发的半数抑制浓度 IC50 为 138 32 g mL 1 附着胞形成的 IC 50为 22 23 g mL 1 经 FV 处 理后 玉米小斑病菌菌丝顶端 中部出现膨大泡囊 呈 念珠状 扫描电镜观察发现泡囊状菌丝表面凹凸不平 并残留有碎片 透射电镜观察发现在部分菌丝细胞原生质出现 空泡 的菌丝里有 子菌丝 结论 枯草芽孢 杆菌菌株 A 产生的抗真菌蛋白与 RNA 结合蛋白 Hfq 高度同源 可抑制致病真菌孢子萌发 附着胞形成 并影响菌 丝细胞的形态和结构 关键词 抗真菌蛋白 RNA 结合蛋白 Hfq 孢子萌发 附着胞形成 菌丝形态结构 Purification and Antifungal Mechanism of a Kind of Antifungal Protein from Strain A of Bacillus subtilis PENG Bing ZHANG Shu bin JIA Yu WANG Li an Life Science College of Hebei Normal University Shijiazhuang 050016 Abstract Objective The objective of this study is to separate and purify a kind of antifungal protein from Bacillus subtilis strain A CGMCC No 1982 and study the antifungal mechanism using Bipolaris maydis as a indicator Method The crude protein was subjected to precipitation with ammonium sulfate and then a DE52 anion exchange chromatography column was employed for further purification of the protein with antifungal properties The active fraction was identified by matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry MALDI TOF MS The mechanism of antifungal protein on the conidium germination and appressorium formation on the mycelium morphology and intracellular structure of B maydis was studied Result The analysis of the antifungal protein FV by MALDI TOF MS suggested that it might be a kind of RNA binding protein Hfq gi 16078797 with a relative molecular mass of 8 508 5 Da and isoelectric point pI of 8 04 The similarity of amino acid sequence between the antifungal protein from the strain A and a kind of RNA binding protein Hfq was 86 484 The IC50 for inhibiting spore germination was 138 32 g mL 1 while the IC50 for inhibiting appressorium formation was 22 23 g mL 1 The mycelia treated by FV with a concentration of 34 58 g mL 1 exhibited misshapen and existing intumescentia vesicles in top or middle Under scanning electron microscope the surface of the deformed mycelia became rough and the swollen vesicle appearance exhibited sags and crests and had some chips Under transmission electron microscope the protoplasm of the treated mycelia cell became vacuolization and in some mycelia existing daughter mycelia Conclusion The amino acid sequence between the antifungal protein FV and a kind of RNA binded protein Hfq was of higher homology This protein could inhibit mycelial growth by changing the morphological 68 中 国 农 业 科 学 44 卷 structure of mycelial cells and affect conidium germination and appressorium formation Key words antifungal protein RNA binding protein Hfq conidium germination appressorium formation mycelial morpha and structure 0 引言 研究意义 研究生防菌枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis 菌株 A 产生的抗真菌蛋白的性质及作用机理 深化对生防菌抗菌机制的认识 对开发新型生防菌剂 解决目前在农业生产病害防治领域中施用大量化学杀 菌剂带来的病原菌抗药性 生态环境 农产品质量安 全等问题具重要意义 前人研究进展 枯草芽孢杆 菌种类多 功能各不相同 是一类广泛存在于自然界 的腐生细菌 具有生长快 营养简单 易分离培养等 优点 因此 枯草芽孢杆菌制剂已成为最具开发潜力 的生防菌剂 美国迄今已有 4 株枯草芽孢杆菌生防菌 株获得环保局 EPA 商品化或有限商品化生产应用 许可 分别为 GBO3 MBI600 QST713 和解淀粉枯 草芽孢杆菌变种 1 4 在抗菌机理方面 枯草芽孢杆菌 可以产生多种抗生素 如杆菌抗霉素 bacillomycin 伊枯草菌素 iturins 抗霉枯草菌素 mycosubtilin 溶杆菌素 bacilysin 分枝菌素 mycobacillin 表面活性肽 surfactin 芬枯草菌素 fengycin 等 5 6 这些抗生素分属于 3 个杆菌脂肽家族 表面活性肽 surfactins 伊枯草菌素 iturins 和芬枯草菌素 fengymycin 它们奠定了枯草芽孢杆菌抗多种细 菌 真菌和卵菌的物质基础 7 最近的研究明确显示 脂肽类物质不仅有助于产生菌在根际定植环境中的健 康存在 还可刺激植物的寄主防御反应 7 产生的抗 真菌物质还可增强菌体表面的疏水特性 8 本研究 切入点 不同枯草芽孢杆菌 其分泌抗菌物质 抗菌 机理 拮抗对象 开发前景等方面均存在差异 在前 期的研究中 笔者曾报道菌株 A CGMCC No 1982 为一种枯草芽孢杆菌 并产生对环境较稳定的抗菌蛋 白 9 同时对其培养条件及发酵工艺进行了报道 10 拟解决的关键问题 本研究进一步明确该菌分泌的 抗真菌蛋白的特性及抗真菌机理 明确枯草芽孢杆菌 菌株 A 抗菌蛋白的氨基酸序列特点及生物化学特性 以玉米小斑病菌 Bipolaris maydis 做靶标真菌 探 讨纯化抗菌蛋白的作用机理 1 材料与方法 1 1 材料 枯草芽孢杆菌菌株 A CGMCC No 1982 玉 米小斑病菌菌株均由河北师范大学生命科学学院真菌 生物化学实验室分离保存 1 2 方法 1 2 1 抗菌蛋白的分离纯化及鉴定 从 LB 平板上 用牙签挑取菌株 A 单菌落 接种至盛有 5 mL LB 液体 培养基的试管中 35 300 r min 振荡培养 12 h 后 将试管菌液接种到盛有200 mL LB液体培养基的三角 瓶中 规格 500 mL 于 35 200 r min 振荡培养 24 h 5 000 r min 离心 5 min 后收集上清液 采用饱和 硫酸铵沉淀法 相对饱和度 60 获得粗蛋白 透析 脱盐后采用 DE52 阴离子交换柱 pH 8 0 的 0 02 mol L 1 Tris HCl 缓冲液平衡 进行分离纯化 柱床体 积为 16 mm 400 mm 上样体积为 9 mL NaCl 线 性梯度洗脱浓度分别为 0 2 0 3 0 3 0 4 mol L 1 对收集到的各组分采用与玉米小斑病菌对峙培养法检 测抗真菌活性 合并抗菌活性强的组分 装入透析袋 8 14 kD 中 4 脱盐 脱盐溶液采用 0 02 mol L 1 的 Tris HCl 溶液 pH 8 0 8 h 后 将透析袋包埋在 PEG 4000 中浓缩 待透析袋内抗菌蛋白溶液约为 1mL 时停止 用超微量紫外可见分光光度计 ND 1000 定 量抗菌蛋白的浓度 用0 02 mol L 1的 Tris HCl 溶液 pH 8 0 调整浓度至5 53 mg mL 1作为抗菌蛋白的母液 采用 SDS PAGE 上样量 10 g 分离胶 15 CBB R250 染色 检测分析后 将单一条带委托北京 蛋白质组研究中心进行 MALDI TOF MS MS MS 结 构鉴定分析 MALDI 4800 1 2 2 抗菌蛋白对玉米小斑病菌孢子萌发的影响 将玉米小斑病菌接种到玉米粉培养基 玉米粉 20 g 葡萄糖 20 g 磷酸氢二钾 1 g 硫酸镁 0 5 g 蛋白胨 1 g 琼脂 20 g 水 1 000 mL 平板上 25 培养 10 d 后 用无菌水冲洗收集孢子 经无菌纱布过滤后 离 心 2 500 r min 5 min 弃上清 孢子沉淀用 Fries 培养基 蔗糖 20 g 酒石酸铵 5 g 磷酸二氢钾 1 g 硝酸铵 1 g 硫酸镁 0 5 g 氯化钠 0 1 g 氯化钙 0 098 g 酵母粉 0 5 g 水 1 000 mL pH 4 5 悬浮获得 孢子悬液 用血细胞计数器计量孢子浓度至 106个 mL 取 1 mL 孢子悬液至 1 5 mL 小试管中 分别加 入终浓度为 553 28 276 64 138 32 69 16 34 58 和 1 期 彭 兵等 枯草芽孢杆菌菌株 A 抗菌蛋白的分离纯化及抗真菌机理 69 17 29 g mL 1的纯化抗菌蛋白 采用 75 百菌清可湿 性粉剂 800 倍稀释液 作为杀菌剂处理对照 混匀 后每一处理取 200 L 分别滴在投影胶片上 放置铺有 湿滤纸的培养皿中 25 培养 12 h 光学显微镜下 100 观察统计孢子的萌发率 每一处理 3 次重复 每 一重复观察 55 87 个孢子 孢子萌发率 孢子萌发数 孢子总数 100 1 2 3 抗菌蛋白对玉米小斑病菌附着胞形成的影 响 具体操作同 1 2 2 1 mL 孢子悬液中含 0 1 的吐 温 80 纯化抗菌蛋白的终浓度分别为 276 64 138 32 69 16 34 58 17 29 和 8 15 g mL 1 每个处理 3 次重 复 光学显微镜下 100 观察统计附着胞形成率 附着胞形成率 附着胞数 萌发孢子芽管 末端总数 100 1 2 4 抗菌蛋白对玉米小斑病菌菌丝形态的影响 取 1 mL 孢子悬液 浓度为 104 个 mL 至 2 mL 离心 管中 25 200 r min 培养 5 h 后 取抗菌蛋白母液 7 L 加入离心管中 终浓度为 34 58 g mL 1 继续 培养 加入抗菌蛋白后 0 10 和 20 h 时取样 做成临 时装片 用 Nikon 光学显微镜观察菌丝形态的变化并 照相 相同时间取样 样品离心 3 000 r min 3 min 后弃上清 加入 2 5 戊二醛固定 5 min 离心弃戊二 醛 用 PBS 缓液洗 2 次 乙醇梯度脱水 50 70 80 90 和 100 各 5 min 75 叔丁醇脱水 1 次 100 叔丁醇脱水 2 次 每次 10 min 4 二甲苯 二氯胺脘脱水干燥后 将菌丝块粘到双面胶上 采用 离子镀膜仪 IB 3 镀金 委托河北医科大学电镜中心扫 描电子显微镜 日立 S 3500N 观察并照相 1 2 5 抗菌蛋白对玉米小斑病菌菌丝内部结构的影 响 试验方法参照 1 2 4 处理后样品离心 戊二醛固 定后 委托河北医科大学电镜中心进行样品处理 采 用透射电子显微镜 日立 H 7500 观察菌丝细胞内部 结构变化并照相 2 结果 2 1 抗菌蛋白的纯化及结构鉴定 沉淀后的粗蛋白经离子交换层析 共收集到 5 种 组分 分别为组分 和 其中 只有 组分 对玉米小斑病菌表现出较高的抗真菌活性 图 1 命名为 FV 对 FV 进行 SDS PAGE 检测表明 FV 呈单一条 带 分子量小于10 kD 图2 对FV进行MALDI TOF MS 分析结果见表 表所列的 3 种蛋白均为 RNA 结合蛋白 Hfq 与 FV 的 MALDI TOF MS 分析结果序列匹配率均为 86 484 尽管 3 种蛋白的分值存在差异 考虑到本 研究采用的菌株为一种枯草芽孢杆菌 5 认为 FV 为 第 3 种蛋白 是一种 RNA 结合蛋白 Hfq 其相对分子 质量为 8 508 5 Da 等电点 pI 为 8 04 2 2 抗菌蛋白 FV 对玉米小斑病菌孢子萌发及附着胞 形成的影响 由图 3 图 4 可知 随着拮抗蛋白处理浓度的增 加 玉米小斑病菌孢子萌发率和附着胞形成率均降低 FV 抑制玉米小斑病菌孢子萌发的半数抑制浓度 IC50 图1 粗蛋白经层析分离后的5种组分对玉米小斑病菌的拮 抗活性检测 Fig 1 Antagonism activity of five portions from chromatographic separation of crude proteins to Bipolaris maydis 图 2 FV 的 SDS PAGE 检测 Fig 2 Detection of FV by SDS PAGE 70 中 国 农 业 科 学 44 卷 表 FV 的 MALDI TOF MS 鉴定 Table Identification of FV by MS MS MS 与 FV 同源的蛋白登录号及细菌名 The name of bacterium and homologous protein NCBI no of FV 匹配肽段序列 Matched peptides sequence 覆盖率 Cov a 理论分子量 实际分子量 MW c MW o 蛋白分值 Protein score MKPINIQDQFLNQIR 20 55 1 874 1 874 Bacillus pumilus gi 157692405 HAISTFAPQK 13 70 1 100 1 100 280 MKPINIQDQFLNQIRK 21 92 2 002 2 002 Bacillus amyloliquefaciens gi 154686147 HAISTFAPQK 13 70 1 100 1 100 265 MKPINIQDQFLNQIRK 21 92 2 002 2 002 Bacillus subtilis gi 16078797 HAISTFAPQK 13 70 1 100 1 100 179 为阳性对照 75 百菌清可湿性粉剂 800 倍稀释液 图 4 同 means positive control Chlorothalonil wetter 800 times diluent The same as Fig 4 图 3 FV 对玉米小斑病菌孢子萌发的影响 Fig 3 Effects of FV on spore germination of B maydis 为 138 32 g mL 1 抑制附着胞形成的 IC50为 22 23 g mL 1 FV 除了对附着胞形成率有影响外 在低浓度抗菌 蛋白处理条件下 也观察到畸形附着胞 畸形的主要 表现为附着胞明显增大 随着抗菌蛋白处理浓度的增 大 有的孢子只萌发成芽管 不形成附着胞 并且芽 管中间菌丝细胞开始膨大 有的萌发后 芽管末端即 膨大成球形 不能继续生长 在形成附着胞统计时 前两种情况为可形成附着 胞 后两种情况统计为不能形成附着胞 由此可见 抗菌蛋白 FV 不仅可影响孢子萌发 还能影响附着胞 的形成 图 4 FV 对玉米小斑病菌附着胞形成的影响 Fig 4 Effects of FV on appressorium formation of B maydis 2 3 抗菌蛋白 FV 对玉米小斑病菌菌丝形态的影响 光学显微镜观察发现 未经 FV 处理的菌丝长且 多 粗细均匀 菌丝内部折光一致 图 5 A 经浓 度为 34 58 g mL 1 的 FV 处理 10 h 后 菌丝中间多处 出现膨大 变得粗细不均 偶有菌丝末端膨大的现象 图 5 B 随着处理时间的延长 菌丝末端膨大变 得非常明显 处理 20 h 后 末端菌丝细胞多处膨大成 泡囊状 部分呈 念珠状 图 5 C 由于丝状真 菌的生长表现为顶端生长 末端菌丝膨大变形会阻碍 菌丝继续生长 从而形成了对峙培养时的拮抗带 图 1 对浓度为34 58 g mL 1 的FV处理后菌丝的扫描 电子显微镜观察结果见图 6 图 6 A 显示未经 FV 处 理的菌丝 表面光滑 经 FV 处理 10 h 后的菌丝 细 1 期 彭 兵等 枯草芽孢杆菌菌株 A 抗菌蛋白的分离纯化及抗真菌机理 71 A 未经 FV 处理的菌丝 B FV 处理 10 h 后的菌丝 C FV 处理 20 h 后的菌丝 A The mycelia untreated by FV B The mycelia treated by FV for 10 h C The mycelia treated by FV for 20 h 图 5 FV 34 58 g mL 1 对玉米小斑病菌菌丝形态的影响 Fig 5 Effects of FV at a concentration of 34 58 g mL 1 on the mycelium growth of B maydis 胞壁不规则加厚 表面粗糙 仍可见菌丝中间 图 6 B 或末端细胞 图 6 C 膨大 处理 20 h 后 这种现象 更加明显 图 6 D 菌丝顶端仍可见呈 念珠状 的 膨大囊泡 膨大细胞表面除凹凸不平外 可见一些细 胞壁碎片 图 6 E 2 4 抗菌蛋白 FV 对玉米小斑病菌菌丝细胞结构的影 响 对浓度为34 58 g mL 1 的FV处理后菌丝的透射 电子显微镜观察结果见图 7 未经处理的玉米小斑病 菌菌丝细胞 细胞壁厚度一致 细胞轮廓清晰 原生 质致密 细胞器清晰可见并有序分布 图 7 A 经 FV 处理 10 h 后 带有细胞壁碎片的膨大菌丝细胞原 生质内出现 空泡 部分细胞器结构受到破坏 图 7 B 处理 20 h 后 在一些菌丝内部出现 子菌丝 样结构 图 7 C 3 讨论 枯草芽孢杆菌种类很多 防治对象也各不相同 培养过程中产生的胞外抗菌物质种类 化学特性也不 尽相同 国内外已报道的产生抗生素并具不同防治对 象的菌株有 QST 713 11 20B 12 13 B11 14 SN 02 15 TG26 16 B034 17 GEB3 18 JA 19 B29 20 Bs 916 21 B9601 Y2 22 355 23 等 枯草芽孢杆菌的细胞膜上有 3 种类型的蛋白泌出通道 可允许各种大小的蛋白泌 出 24 其产生抗真菌物质还与所处的环境和培养条件 有关 23 在抗菌物质研究方面 除了脂肽类抗生素外 还不断有新物质被发现 Liu 等 25 从 B 916 菌株中分 离到一种 41 9 kD 的抗真菌蛋白 bacisubin 该蛋 白 具 核 糖 核 酸 酶 和 使 红 血 球 凝 集 的 活 性 Leelasuphakul 等 26 在分离纯化 Bacillus subtilis NSRS A 未经 FV 处理的菌丝 表面光滑 B C FV 处理 10 h 后的菌丝 菌丝表面不规则肿胀 箭头 D E FV 处理 20 h 后的菌丝 菌丝膨大 粗 糙表面有细胞壁碎片 A The mycelial untreated by FV with a smooth surface B C The mycelia treated by FV for 10 h appeared swollen irregularly arrows D E The mycelia treated by FV for 20 h exhibited swelling and appendages 图 6 FV 处理 34 58 g mL 1 后玉米小斑病菌菌丝形态的扫描电镜观察 Fig 6 The observation of mycelial morpha of B maydis treated by FV at a concentration of 34 58 g mL 1 by scanning electron microscope 72 中 国 农 业 科 学 44 卷 A 未经抗菌蛋白 FV 处理的菌丝 细胞原生质致密 细胞器结构正常 B 抗菌蛋白 FV 处理 10 h 后的膨大菌丝 细胞原生质 空泡化 C 抗菌蛋 白 FV 处理 20 h 后见到的子菌丝 CW 细胞壁 M 线粒体 DH 子菌丝 A The mycelia untreated by FV had integral cell structure with compact protoplasm and clear organelles B The mycelial protoplasm became vacuolization treated by FV for 10 h C The mycelial cells exhibit daughter mycelia treated by FV for 20 h CW cell wall M mitochondrion DM daughter mycelia 图 7 FV 处理 34 58 g mL 1 后玉米小斑病菌菌丝结构的透射电镜观察 Fig 7 The observation of mycelial structure of B maydis treated by FV at a concentration of 34 58 g mL 1 by transmission electron microscope 89 24 菌株的抗菌素时发现 一种 1 3 葡聚糖酶的存 在可增强抗菌素的抗菌活性 Lee 等 27 从 Bacillus subtilis SC 8 菌株的培养物中分析检测到一种对腊状 芽孢杆菌有明显拮抗活性的物质 本研究报道的从枯草芽孢杆菌菌株A纯化的抗真 菌蛋白 在 NCBI 数据库中共搜索到 3 种蛋白匹配率 较高的蛋白 86 484 同属芽孢杆菌属 但种有 所不同 分别为 Bacillus pumilus gi 157692405 Bacillus amyloliquefaciens gi 154686147 Bacillus subtilis gi 16078797 蛋白性质均为 RNA 结合蛋白 Hfq 尽管数据分析给出的蛋白质分值枯草芽孢杆菌 略低些 考虑到以前对菌株 A 的鉴定结果 认为抗菌 蛋白 FV 与 gi 16078797 高度同源 其相对分子质量为 8 508 5 Da 与 SDS PAGE 小于 10 kD 的判断也相吻 合 抗菌蛋白具 RNA 结合蛋白 Hfq 性质在国内外文 献中均未见报道 Hfq a host factor of RNA phage Q 作为 RNA 噬菌体 Q 的寄主因子 最早在大肠杆菌中被发现 目前 这种蛋白已形成一个家族 Hfq 蛋白家族 由 70 110 个氨基酸组成 并具有热稳定性 其中 80 90 存在于细胞质中并与核糖体结合 Hfq 在转录 后期的调节中起着重要作用 它有两个 RNA 结合位 点 一个可与 sRNA 和 mRNA 结合 一个可结合 poly A 尾巴 28 Chao 等 29 报道 RNA 结合蛋白 Hfq 对增加病原细菌的毒力是必须的 Hfq 突变后的突变 体表现为对寄主防卫机制敏感和致病性衰减 其可能 原因是 Hfq 突变可影响基因组 20 左右的基因表达 其中包括 型分泌系统 根据蛋白类型及可使致病真 菌细胞形态结构改变这一事实 推测该抗菌蛋白可以 结合到病原真菌的 RNA 上并影响转录 进一步引起 病原真菌细胞代谢紊乱 并抑制其生长 菌株 A 的抗菌蛋白可抑制孢子萌发 类似的结果 与李晶等报道B29菌株上清液可抑制尖孢镰刀菌孢子 的萌发结果类似 20 菌株 A 的抗菌蛋白可造成病原真 菌菌丝出现畸形 内部亚细胞结构出现异常的现象 在刘永锋等 21 对 Bs 916 菌株 汪澈等 22 对 B9601 Y2 菌株的研究报告中均有体现 尽管有如此多的抗菌物质被阐明 但在实际应用 过程中 目前 国内外多采用含有菌体的发酵液来做 生防菌剂 在开发生防菌剂的过程中 面对枯草芽孢 杆菌种类多 分泌物质多 抗菌机制复杂等因素 应 重点解决好以下几方面问题 第一 明确各枯草芽孢 杆菌菌株之间的亲缘关系 抗菌对象及抗菌能力强弱 第二 按在自然界中菌株存活率高 分泌的抗菌物质 稳定为条件 筛选优势菌株 第三 解决优势菌株的 发酵工艺 应用剂型及防治对象 第四 阐明其抗菌 1 期 彭 兵等 枯草芽孢杆菌菌株 A 抗菌蛋白的分离纯化及抗真菌机理 73 机制 这些问题的解决必然会加速生防菌剂在农业生 产中的应用 对保护环境 促进农业生产 提高农产 品质量安全等均具重要意义 当然 枯草芽孢杆菌作 为模式细菌 其基因组测序工作已经完成 克隆应用 前景好的抗菌蛋白基因 采用基因工程技术生产抗菌 蛋白质制剂作为微生物农药已成为可能 但采用抗菌 蛋白质直接用作生物农药仍存在两个障碍 一是成本 问题 二是抗菌蛋白在田间的稳定性问题 尽管分离 到的抗菌蛋白多具有耐热 抗紫外线等特性 但田间 是一个复杂的生态系统 抗菌蛋白在这个复杂生态系 统中能否稳定 持续地发挥作用仍需进一步研究 4 结论 本研究从枯草芽孢杆菌菌株A发酵液中分离到一 种抗真菌活性蛋白 命名为 FV 其与 RNA 结合蛋白 Hfq Bacillus subtilis subsp subtilis gi16078797 的匹 配率为 86 484 相对分子质量为 8 508 5 Da 等电点 为 8 04 FV 可抑制玉米小斑病菌孢子萌发和附着胞形 成 并影响菌丝细胞的形态结构 经 FV 处理后 玉 米小斑病菌菌丝顶端 中部出现膨大泡囊 呈 念珠 状 进一步观察表明 菌丝膨大泡囊表面凹凸不平 并残留有碎片 膨大菌丝细胞内存在 子菌丝 References 1 刘 雪 穆常青 蒋细良 郭 萍 田云龙 朱昌雄 枯草芽孢杆 菌代谢物质的研究进展及其在植病生防中的应用 中国生物防治 2006 22 增刊 179 194 Liu X Mu C Q Jiang X L Guo P Tian Y L Zhu C X Research progress of the metabolic substances produced by Bacillus subtillis and their application on biocontrol of plant disease Chinese Journal of Biological Control 2006 22 Suppl 179 194 in Chinese 2 黄 曦 许兰兰 黄荣韶 黄庶识 枯草芽孢杆菌在抑制植物病原 菌中的研究进展 生物技术通报 2010 1 24 29 Huang X Xu L L Huang R S Huang S S Research advance in controlling plant diseases by Bacillus subtilis Biotechnology Bulletin 2010 1 24 29 in Chinese 3 李 晶 杨 谦 生防枯草芽孢杆菌的研究进展 安徽农业科学 2008 36 1 106 111 132 Li J Yang Q Research progress on biocontrol Bacillus subtilis Journal of Anhui Agricultural Sciences 2008 36 1 106 111 132 in Chinese 4 程洪斌 刘晓桥 陈红漫 枯草芽孢杆菌防治植物真菌病害研究进 展 上海农业学报 2006 22 1 109 112 Cheng H B Liu X Q Chen H M Research advance in controlling plant fungous diseases by Bacillus subtilis Acta Agriculturae Shanghai 2006 22 1 109 112 in Chinese 5 Shoda M Bacterial control of plant diseases Journal of Bioscience and Bioengineering 2000 89 6 515 521 6 Noriyasu I Shahedur R M Takashi A Production of iturin A homologues under different culture conditions Journal of Environmental Sciences 2009 Suppl S28 S32 7 Ongena M Jacques P Bacillus lipopeptides versatile weapons for plant disease biocontrol Trends in Microbiology 2007 16 3 115 125 8 Ahimou F Jacques P Deleu M Surfactin and iturin A effects on Bacillus subtilis surface hydrophobicity Enzyme and Microbial Technology 2000 27 749 754 9 成丽霞 彭 兵 李天金 王立安 一株具广谱抗真菌活性细菌菌 株的分离鉴定及拮抗物的理化特性 微生物学通报 2009 36 3 365 370 Cheng L X Peng B Li T J Wang L A Isolation identification and characteristics of a bacterium with extensive antifungal activity from a corn leaf spot Microbiology 2009 36 3 365 370 in Chinese 10 李小俊 陈 颖 贾 宇 王立安 生防菌株 A 的摇瓶培养条件及 发酵工艺 安徽农业科学 2009 37 4 1614 1617 Li X J Chen Y Jia Y Wang L A Studies on the culture condition and fermentation crafts of A strain of Bacillus subtilis Journal of Anhui Agricultural Sciences 2009 37 4 1614 1617 in Chinese 11 Kinsella K Schulthess C P Morris T F Stuart J D Rapid quantification of Bacillus subtilis antibiotics in the rhizosphere Soil Biology and Biochemistry 2009 41 374 379 12 Joshi S Bharucha C Desai A J Production of biosurfactant and antifungal compound by fermented food isolate Bacillus subtilis 20B Bioresource Technology 2008 99 4603 4608 13 Joshi S Bharucha C Desa A J Production of biosurfactant and antifungal compound by fermented food isolate Bacillus subtilis 20B Bioresource Technology 2008 99 11 4603 4608 14 Li Q Q Meng X Y Wu X Lin W Duan C J Feng J X Tang J L Purification of two antimicrobial substances produced by Bacillus subtilis strain B11 and their properties Agricultural Sciences in China 2006 5 5 363 369 15 赵秀香 赵柏霞 马 镝 魏颖颖 吴元华 枯草芽孢杆菌 SN 02 抑菌物质的分离 纯化及结构测定 植物保护学报 2008 35 4 322 326 Zhao X X Zhao B X Ma Z Wei Y Y Wu Y H Isolation purification and structure analysis of the antagonistic substance produced by Bacillus subtilis SN 02 Acta Phytophylacica Sinica 2008 35 4 74 中 国 农 业 科 学 44 卷 322 326 in Chinese 16 刘伊强 王雅平 潘乃穟 陈章良 拮抗菌 TG26 的鉴定及其抗菌 蛋白 BI 的纯化和部分特性 植物学报 1994 36 3 197 203 Liu Y Q Wang Y P Pan N S Chen Z L Identification of antagonistic strain TG26 and purification of its antifungal protein B1 Acta Botanica Sinica 1994 36 3 197 203 in Chinese 17 童有仁 马志超 陈卫良 李德葆 枯草芽抱杆菌 B034 拮抗蛋白 的分离纯化及特性分析 微生物学报 1999 39 4 339 403 Tong Y R Ma Z C Chen W L Li D B Purification and partial characterization of antagonistic proteins from Bacillus Subtilis B034 Acta Microbiologica Sinica 1999 39 4 339 403 in Chinese 18 高学文 姚仕义 Huong Pham Joachim Vater 王金生 基因工程菌 枯草芽孢杆菌 GEB3 产生的脂肽类抗生素及其生物活性研究 中 国农业科学 2003 36 12 1496 1501 Gao X W Yao S Y Huong P Joachim V Wang J S Lipopeptide antibiotics produced by the engineered strain Bacillus subtilis GEB3 and detection of its bioactivity Scientia Agricultura Sinica 2003 36 12 1496 1501 in Chinese 19 刘 静 王 军 姚建铭 潘仁瑞 余增亮 枯草芽孢杆菌 JA 抗菌 物特性的研究及抗菌肽的分离纯化 微生物学报 2004 44 4 511 514 Liu J Wang J Yao J M Pan R R Yu Z L Properties of the crude extract of Bacillus subtilis and purification of antimicrobial peptides Acta Microbiologica Sinica 2004 44 4 511 514 in Chinese 20 李 晶 杨 谦 赵丽华 王玉霞 生防枯草芽孢杆菌 B29 菌株抗 菌物质的初步研究 中国生物工程杂志 2008 28 2 59 65 Li J Yang Q Zhao L H Wang Y X Antifungal substance from biocontrol Bacillus subtilis B29 strain China Biotechnology 2008 28 2 59 65 in Chinese 21 刘永锋 张 杰 陈志谊 周明国 宋福平 刘邮洲 聂亚锋 罗楚 平 枯草芽孢杆菌 Bs 916 胞外抗菌蛋白质的生物功能分析 江苏 农业学报 2008 24 3 269 273 Liu Y F Zhang J Chen Z Y