分子生物学--凋亡.ppt

细胞凋亡Apoptosis 一 概述二 细胞凋亡的生物学特征三 细胞凋亡的过程及机理四 细胞凋亡与生理五 细胞凋亡与疾病六 细胞凋亡的检测 一 概述 基本概念 PCD apoptosis研究发展史 Howisthisappliedtohumanconditions Certaincancers uncontrolledcelldivisionversusuncontrolledcelldestructionMyocardialinfarction 心肌梗塞 CerebrovascularaccidentAlzheimer sdiseaseEmbryologicaldevelopment 细胞死亡的方式 programmedcelldeath PCDAgingPhysiologicalKillingmicroorganismsToxic nonphysiological cellnecrosis 原因 血供中断 感染 中毒 强烈的理化因素等 导致胞膜的损伤 引起细胞内外环境的失衡 病理变化 细胞器肿胀变性 细胞溶解 由于质膜的裂解 细胞的内容物包括线粒体酶等释放入细胞间质 因此坏死常伴有扩大的组织损伤和严重的炎症反应 诱导细胞死亡的先存基因的定时 定空间的激活而导致的细胞自杀现象 PCD最初是1956年发育生物学中提出的概念 是个功能性概念 强调的是其分子生物学和生理功能 一般指生理性细胞死亡 描述在一个多细胞生物体中某些细胞死亡是个体发育中的一个预定的 并受到严格程序控制的正常组成部分 如蝌蚪尾巴的消失 细胞程序性死亡 programmedcelldeath PCD 定义 机体细胞在正常生理或病理状态下发生的一种自发的 程序化的死亡过程 它的发生受到机体的严密调控 不一定都是先存基因可以是生理性的也可以是病理性的形态术语调亡是细胞的一种自杀方式 临终细胞 dyingcell 通过激活一个内在编码的 进化上非常保守的死亡程序来启动自身的死亡 对凋亡的生理性调控提供了消除多余的发育不正常的以及存在遗传损伤的细胞的一种机制 apoptosis 凋亡分为两类 1 需合成新的RNA和蛋白质 激素 射线 热力 祛除生长因子等诱导的细胞凋亡 2 不需合成新的RNA和蛋白质 CTL NK淋巴细胞等诱导的细胞凋亡 ResearchHistory 1 Glucksman 1951 描述了脊椎动物在正常胚胎发育过程中细胞存在着非病理性死亡 Saunder 1966 从蛾 moth 的变态现象首次提出PCD 并认为PCD即细胞生理性死亡 Kerr 1972 澳大利亚学者进行结扎门静脉分支诱导肝萎缩时 通过光镜和电镜的观察 在超微结构水平观察到细胞非坏死性死亡的形态 细胞质固缩 染色质碎裂 并首先提出凋亡 apoptosis 的概念 取代传统的皱缩性坏死 Shinkagenecrosis 和单细胞渐进性坏死 Single cellnecrosis ResearchHistory 2 DNA的降解和内源性核酸内切酶的参与 1987 蛋白质水解酶活化的研究 1995 细胞膜的变化 1997 线粒体的变化和分子生物学的研究 1998 1 相关基因及调控2 信号转导3 各种分子及其相互作用及相互关系4 疾病机制的阐明 以及新疗法的探索及问世 NobelPrizeforPhysiologyorMedicine2002 Co awardedonOctober7 2002For geneticregulationoforgandevelopmentandprogrammedcelldeath SydneyBrenner English H RobertHorvitz American JohnSulston English SydneyBrenner1 3oftheprizeUnitedKingdomTheMolecularSciencesInstituteBerkeley CA USAb 1927 inUnionofSouthAfrica H RobertHorvit1 3oftheprizeUSAMassachusettsInstituteofTechnology MIT Cambridge MA USAb 1947 JohnE SulstonUnitedKingdomTheWellcomeTrustSangerInstituteCambridge UnitedKingdomb 1942 THE2002NOBELPRIZEWINNER Caenorhabditiselegans ThePerfectModel Anematodeapproximatelyonemmlongcontainingblood muscle heart nervous aswellasothertissuesFromfertilizationtoadultinthreedaysLifespanoftwotothreeweeksAdultorganismcomprisedof959cellsDuringembryologicaldevelopmentwillform1090cells Approximately40percentoftheworm sgenesarealsofoundinhumansRespondstotaste smell temperature touch andpossiblylightSo wheredidtheother131cellsgo 线虫神经系统由302个细胞组成 这些细胞来自于407个前体细胞 也就是说105个细胞发生了程序性死亡 研究对象 线虫 nematode 参与线虫发育过程中细胞凋亡调控的基因 凋亡活化基因CED 3 具有严格底物特异性的半胱氨酸蛋白酶 以酶原的形式存在于细胞内 细胞凋亡时活化的CED 3特异性降解蛋白底物 诱导凋亡细胞出现的特征性形态学和生物化学变化 CED 4 既能结合CED 3 也能结合CED 9 在非凋亡细胞中 CED 9以CED 4为中介和CED 3结合成为三元复合物 扣押CED 3使其以无活性的酶原形式存在于细胞内 在凋亡诱导信号的作用下 凋亡调节分子EGL 1与CED 9结合 并使后者自三元复合物中解离 随后CED 3在CED 4的作用下活化并促使细胞凋亡 从哺乳动物鉴定的CED 4同源性蛋白命名为凋亡蛋白酶活化因子1 apoptoticproteaseactivatingfactor1 Apaf 1 凋亡抑制基因CED 9 使胚胎发育避免程序性细胞死亡 与哺乳动物原癌基因Bcl 2相关 二 细胞凋亡的生物学特征 形态学特征生物化学特征 细胞凋亡的形态学特征 细胞体积变小 胞膜气泡化 染色体浓缩 DNA分解成有规律的片段 凋亡细胞的残体被旁邻细胞 巨噬细胞 上皮细胞 吞噬 无炎症现象出现 细胞凋亡的形态特征 1 凋亡的起始 微绒毛的消失 细胞间接触的消失 与周围的细胞脱离 细胞质中 线拉体大体完整 染色质固缩 2 细胞质密度增加 线粒体膜电位消失 通透性改变 释放细胞色素C到胞浆 膜内侧磷脂酰丝氨酸外翻到膜表面 3 凋亡小体的形成 核膜核仁破碎 核染色质断裂为大小不等的片段 与某些细胞器如线粒体一起聚集 为反折的细胞膜所包围 4 凋亡小体逐渐被周围专职或非专职吞噬细胞吞噬 ComparitiveMorphologies Necrosis CellularSwellingPyknosis NuclearDisintegrationDissolutionofcellmembranesInflammationInvolveswholeorgansorlargepartoforgan ApoptosisCellShrinkageChromatinCondensationCytoplasmicblebbing apoptoticbodiesNoinflammationSingleorsmallgroupsofcells 胸腺细胞 正常 凋亡 胸腺细胞 正常 凋亡 细胞坏死与凋亡的区别 坏死凋亡 性质 诱导因素 强烈刺激 严重损伤 较弱刺激 轻度损伤 形态变化 DNA降解 炎症反应 基因调控 细胞结构全面溶解 破坏 成群细胞死亡 胞膜及细胞器相对完整 形成凋亡小体 个别细胞死亡 不规则 电泳不呈梯状分布 规则 电泳呈梯状分布 溶酶体破裂 局部有炎症反应 溶酶体相对完整 局部无炎症反应 有 主动而有序的有控降解 病理性细胞死亡 生理性或病理性细胞死亡 无 被动而无序的随机降解 蛋白质合成无有 细胞凋亡生化特征1 DNA的片段化即DNA双链片段化断裂 其断裂部位发生在染色质核小体的连接部 此处易受内源性核酸内切酶的攻击而断裂 DNase DNA链上每隔200个核苷酸就有1个核小体 当核酸内切酶在核小体连接部切开DNA时 即可形成180 200bp或其整倍数的DNA片段 这些片段在琼脂糖凝胶电泳中可呈特征的阶梯状条带 是判断细胞凋亡的客观指标之一 在正常情况下 内源性核酸内切酶以无活性的形成存在于细胞核内 如被激活就可切断染色质DNA 细胞凋亡DNA的片段化 2 蛋白质降解凋亡蛋白酶 caspases 水解底物天冬氨酸C端肽键 因此又称之为Caspases 取英文CysteineC asparticacid Asp proteases的词头 即半胱天冬蛋白酶或天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶 Biochemicalfeaturesofapoptosis Proteincleavage 细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻Proteincrosslinkage 稳定而广泛的胞浆蛋白交联DNABreakdown 非随机性DNA降解Phagocyticrecognition 三 细胞凋亡的过程及机理 接受凋亡信号凋亡调控分子间的相互作用蛋白水解酶 caspases 的活化凋亡的级联反应 细胞凋亡的酶学基础 1 Caspase与细胞凋亡Caspase的性质与种类Caspase的活化活化的效应Caspase引起细胞凋亡的机制介导细胞凋亡的其他酶类核酸内切酶蛋白激酶 细胞凋亡的酶学基础 2 Caspase的性质与种类性质 一个prodomain 和大小亚基序列各一个 种类 14种Caspase 根据结构的同源性分为3个亚家族 Caspase 1亚家族Caspase 2亚家族Caspase 3亚家族 包括Caspase3 6 7 8 9 10根据Caspase前提分子 procaspase N端prodomain及在细胞凋亡中作用不同分为 Long prodomain initiators Caspase8 9 10 short prodomain effectors Caspase3 6 7 细胞凋亡的酶学基础 3 2 Caspase的活化 Caspase活化机制 Caspase的活化是有顺序的多步水解的过程 虽然分子各异 但是它们活化的过程相似 首先在caspase前体的N 端前肽和大亚基之间的特定位点被水解去除N 端前肽 然后再在大小亚基之间切割释放大小亚基 并进而形成两两组成的有活性的四聚体 细胞凋亡的酶学基础 4 3 活化的效应Caspase引起细胞凋亡的机制 直接破坏细胞结构 如裂解核纤层 核膜骨架结构 导致靶细胞染色质固缩分割胞质 形成凋亡小体 灭活凋亡抑制物 Bcl 2 使脱氧核糖核酸酶CAD激活 引起DNA片段化 使调节蛋白丧失功能 作用于细胞骨架调节有关的酶和蛋白 改变细胞结构 灭活或下调与DNA修复有关的酶 mRNA剪接蛋白 交联蛋白等 使细胞的增殖与复制受阻并发生凋亡 细胞凋亡的酶学基础 5 介导细胞凋亡的其他酶类核酸内切酶 主要是DNA酶蛋白激酶 其他 颗粒酶 细胞凋亡的诱导发生 死亡受体介导的细胞凋亡线粒体相关的凋亡诱导途径细胞核凋亡诱导途径 以p53为中心颗粒酶介导的细胞凋亡 CTL NK内质网相关的凋亡诱导途径细胞的脱落凋亡 anoikis Thetwomainapopticsignallingpathway 细胞凋亡的两条通路 膜受体通路 线粒体通路 一 细胞凋亡的膜受体通路 FASL FAS FADD凋亡诱导复合物 DISC 胞质中游离的caspase8聚集到这个复合物上细胞有足够caspase8细胞caspase8浓度不够死亡受体活化 切割BidtBid从胞质到线粒体细胞凋亡CtyC释放 fas fasL FADD fasassociatedproteinwithdeathdomain DD deathdomain DED deatheffectordomain DISC deathinducingsignalcomplex 效应 破坏DNA的完整性 干扰细胞周期的正常运行 破坏细胞结构 Apoptosissignallingthroughdeathreceptors 线粒体与细胞凋亡 线粒体参与细胞凋亡或坏死的途径释放caspase活化因子细胞色素C 细胞色素C Apaf 1 caspase9 凋亡体AIF 凋亡诱导因子 Caspase3Apaf 1 凋亡蛋白酶活化因子 二 线粒体通路 Apoptosissignallingthroughmitochondria MajorApoptoticPathwaysinMammalianCells Apoptosis Mechanisms Apaf 1 CED 4pro apoptoticBcl 2 CED 9anti apoptoticcomplexfamilybothpro antiFas associatedDeathDomainDeath inducingsignalingcomplex apoptosis 凋亡信号的转导 凋亡的调控 多途性 同一凋亡诱导因素可通过多条信号转导途径触发凋亡 多样性 不同种类的细胞有不同的信号转导系统 偶联性 死亡信号的转导系统与细胞增殖 分化过程中的信号转导系统在某些环节上有交叉 偶联 同一性 不同的凋亡诱导因素可通过同一信号转导途径触发凋亡 凋亡诱导因素 凋亡信号转导 死亡程序激活 apoptosis 特点 凋亡相关基因 细胞 生存 抑凋亡 凋亡 促凋亡 BaxICEwtP53 EIBIAPBcl 2 1 Bcl 2 抗凋亡 能阻抑多种凋亡诱导因素引发的细胞凋亡 机制 直接抗氧化 抑制线粒体释放促凋亡蛋白质 抑制促凋亡性调节蛋白Bax Bak的细胞毒作用 抑制caspases的激活 维持细胞钙稳态 细胞核凋亡诱导途径 P53为核心P53 mostwellknowntumoursuppressorgeneArrestscellcyclewhenDNAdamagedtoallowtimeforrepairIfrepaircannottakeplacetriggersapoptosisAlterationsinfunctionofp53canthusletcellswithdamagetoDNAsurviveandexplainsitsroleincarcinogenesis 2 P53 促凋亡 wtP53 突变P53 功能 在细胞周期的G1期发挥检查点的作用 启动DNA的修复机制 启动凋亡机制 分子警察 细胞受损 P53表达 P16P27表达 CDK抑制 RbE2F G1 S Mycjunfos P53与细胞凋亡P53是肿瘤抑制基因 其产物主要存在于细胞核内 P53基因是人类肿瘤有关基因中突变频率最高的基因 在依赖P53蛋白的细胞凋亡中 P53基因是通过调节Bc1 2和Bax基因的表达来影响细胞凋亡的 P53蛋白能特异地抑制Bc1 2的表达 相反对Bax的表达则有明显的促进作用 研究表明 P53蛋白是Bax基因的直接的转录活化因子 在这些细胞中 P53蛋白的积累和活动引起了细胞凋亡 3 C mycBcl x C myc 一种癌基因 诱导细胞增殖 有生长因子 诱导细胞凋亡 无生长因子 转录调节因子 机制 诱导凋亡的功能区与促进细胞转化 自身调节区是同一个区域 C myc表达 信号 细胞增殖 第二信号 细胞凋亡 MAX1 P21 2 p22 MAD MAX Bcl x Bcl XL 抑制细胞凋亡 Bcl Xs 促进细胞凋亡 与bcl 2同源 与bcl 2同源的氨基酸少 抑制 四 凋亡与生理 PhysiologicApoptosis Aging 年龄增长使许多细胞类型失去凋亡能力而导致衰老和器官功能下降 Post lactationalMenstruationEmbryogenesisNormalcellturnoveronbodysurfaces 细胞凋亡与T细胞 凋亡与T细胞在胸腺的分化发育 1 TCR途径参与的胸腺细胞凋亡2 Fas途径参与的胸腺细胞凋亡3 Bcl 2途径与胸腺细胞凋亡的关系4 细胞因子参与的胸腺细胞凋亡5 胸腺激素介导的胸腺细胞凋亡 凋亡与成熟的T细胞 介导成熟T细胞AICD效应的机制 1 活化T细胞表面高表达fas和fasL 二者结合可致T细胞披此杀伤或直接自杀 2 活化的APC细胞高表达B7分子 参与CD3 TCR信号的启动 生物学意义 1 AICD有助于清除免疫应答中过量的活化T细胞 控制活化T细胞的总量 调节免疫应答的水平 维持自身稳定 2 AICD是外周免疫系统克隆清除的机制之一 某些成熟的自身反应性T细胞一旦被激活 即可通过AICD效应而发生凋亡 维持自身耐受 这是外周耐受的机制之一 细胞凋亡与B细胞 1 凋亡与骨髓中B细胞发育1 SmIg表达与B细胞凋亡2 Bcl 2表达与B细胞凋亡3 BCR交联与B细胞凋亡2 凋亡与成熟的B细胞1 抗原与BCR的结合2 B细胞借助CD40 CD40L与Th细胞结合B细胞凋亡 经过基因重排 92 的细胞凋亡 细胞凋亡与淋巴细胞的细胞毒作用 CTL NK的细胞毒作用有相似的机制1 效应细胞与靶细胞结合后Ca2 内流 导致胞内电子致密颗粒发生极化 与细胞膜融合 颗粒外吐 释放穿孔素 靶细胞溶解破坏 2 外吐颗粒中的颗粒酶 granzyme Gzm 诱导细胞凋亡 Gzm为CTL溶酶体成分 属蛋白酶 其中GzmB直接作为ICE的类似物 或通过活化ICE而引起细胞凋亡 GzmB通过影响细胞周期而介导凋亡 因此GzmB是引起细胞发生快速凋亡的最重要成分 3 fasL可高表达在活化的T细胞表面 参与CTL的细胞毒作用 神经元发育过程中也存在阴性选择机制 以清除那些有害的 即发错误连接的 或无用的神经元 因此 有50 的神经元细胞在发育成熟前 以凋亡的方式被清除 五 细胞凋亡与人类疾病 细胞凋亡受抑制有关的疾病恶性肿瘤 滤泡性淋巴瘤 乳腺癌 等白血病自身免疫性疾病 系统性红斑狼疮 肾炎病毒感染性疾病 腺病毒病 庖疹病毒病细胞凋亡增多有关的疾病艾滋病 神经变性性疾病 早老性迟呆 帕金森病 小脑退化病骨髓发育不全性疾病缺血性疾病酒精中毒性肝炎 凋亡与自身免疫病 细胞凋亡参与自身免疫病的发生 淋巴细胞凋亡过少导致正常细胞过多凋亡凋亡与致病性自身抗原的产生 细胞凋亡可诱导具有潜在免疫活性的细胞组分集聚成簇 凋亡细胞所释放的核小体DNA可能作为诱导自身免疫应答的免疫原 如SLE的抗核抗体等 凋亡与病毒感染 细胞凋亡与宿主抗病毒免疫防御机制 1 病毒通过多种途径干扰机体介导感染细胞凋亡的作用2 病毒感染后机体与凋亡有关的防御性应答1 病毒感染激活免疫细胞 产生TNF p53蛋白等活性分子 引起病毒感染的细胞凋亡 2 CTL3 病毒感染使宿主细胞的信号传递系统发生紊乱 导致感染细胞凋亡 细胞凋亡与AIDS HIVgp120与靶细胞表面CD4分子结合 激活钙通道 使胞内钙离子增高 导致CD4 T细胞凋亡 Fas系统 gp160可使靶细胞表面CD4 分子交联 诱导感染HIV的细胞Fas表达增加 促进凋亡 内源性细胞因子 CD8 T细胞凋亡 HIV感染可使CD8 T细胞慢性激活 诱导后者发生凋亡 IL 2可通过抑制CD8 T细胞凋亡增强机体抗病毒作用 IL 4和IL 10可促进CD8 T细胞凋亡 Fas表达过多学说 氧自由基理论 凋亡与肿瘤 肿瘤细胞完全忽略要它们捐躯的信号1 遗传物质的损伤如编码P53的基因灭活2 过多的自毁抑制物Bcl 2蛋白阻止了细胞死亡3 癌细胞可设法不受丧失生长因子或细胞间接触的影响对凋亡诱导因素的敏感性的差异 凋亡与心脏和大脑 与癌症中细胞凋亡过少相反 局部缺血性心脏病和中风后 过多细胞自毁则是大量细胞死亡的原因 成人的心肌细胞和神经元都不分裂 这些细胞将永远消失 一 心血管疾病 1 心肌缺血再灌注损伤 机制 氧化应激 缺血缺氧使心肌细胞死亡受体上调 Fas FasL配体信号系统激活 缺氧增加P53基因的转录 启动凋亡 2 心力衰竭 机制 氧化应激 压力或容量负荷过度 神经内分泌失调 交感神经 RAAS TNF IL 2 NO 缺血缺氧 正常心肌凋亡指数 0 2 0 4 心衰时 35 5 NeurodegenerativeDiseasesandApoptosis Withdrawalofgrowthfactorsfavoursactionsofpro apoptoticmembersofBcl 2familyForneuronsdependentonnervegrowthfactorsthelossofthisstimulationcanleadtoneuralapoptosisanddegenerativeneurologicdiseases Alzheimerdisease AD 神经元丧失 海马及基底核的胆碱能神经元丧失达30 50 累及大脑皮层AD机制 致病因素 如氧自由基 作用于神经元 Ca2 内流 激活有关基因 促使神经元内 淀粉样蛋白含量 从而导致凋亡 神经元退行性疾病 六 细胞凋亡的几种检测方法 形态学观察 普通光镜 荧光显微镜 透射电子显微镜磷脂酰丝氨酸外翻分析 AnnexinV法 线粒体膜势能的检测DNA片断化检测 大分子染色体DNA片段 DNALadder脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法 terminal deoxynucleotidyltransferasemediatednickendlabeling TUNEL 半胱氨酸蛋白酶Caspase家族活性的检测 细胞凋亡的形态学检测 1光学显微镜和倒置显微镜未染色细胞 凋亡细胞的体积变小 变形 细胞膜完整但出现发泡现象 细胞凋亡晚期可见凋亡小体 染色细胞 常用姬姆萨染色 瑞氏染色 苏木精染色等 凋亡细胞的染色质浓缩 边缘化 呈新月状附在核膜周围 2荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜一般以细胞核染色质的形态学改变来评判细胞凋亡的进展情况 常用的DNA特异性染料有 HO Hoechst33342 HO Hoechst33258 DAPI 3电子显微镜观察 NuclearmorphologicalchangesofHeLacellsinapoptosisprocess 488nm 400 电镜观察凋亡细胞体积变小 细胞质浓缩 凋亡 期的细胞核内染色质高度盘绕 出现许多称为气穴现象的空泡结构 细胞凋亡的晚期 细胞核裂解为碎块 产生凋亡小体 DNA片段化分析 细胞凋亡时主要生物化学特征是其染色质发生浓缩 染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂 形成180 200bp整数倍的寡核苷酸片段 在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱 DNAladder 磷脂酰丝氨酸 PS 外翻分析 AnnexinV法 磷脂酰丝氨酸 Phosphatidylserine PS 正常位于细胞膜的内侧 在凋亡早期 PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面 暴露在细胞外环境中 Annexin V是一种分子量为35 36KD的Ca2 依赖性磷脂结合蛋白 能与PS高亲和力特异性结合 将Annexin V进行荧光素 FITC R PE 或biotin标记 以标记了的Annexin V作为荧光探针 利用流式细胞仪 荧光显微镜以及共聚焦激光扫描显微镜检测细胞凋亡的发生 AnnexinV法 磷脂酰丝氨酸 Phosphatidylserine PS 细胞凋亡早期从内侧翻转到细胞膜表面AnnexinV 钙依赖性的磷脂结合蛋白 与PS可高亲和力特异性结合 AnnexinV与PI联合 碘化丙啶 propidineiodide PI 是一种核酸染料 它不能透过完整的细胞膜 但在凋亡中晚期的细胞和死细胞 PI能够透过细胞膜而使细胞核红染 因此将Annexin V与PI匹配使用 就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来 已开发出多种荧光标记的试剂盒 ApoptoticHeLacellswerestainedwithFITC AnnexinV PI 线粒体膜势能检测 线粒体跨膜电位DYmt的下降 被认为是细胞凋亡级联反应过程中较早发生的事件 它发生在细胞核凋亡特征 染色质浓缩 DNA断裂 出现之前亲脂性阳离子荧光染料 如Rhodamine123 Dioc6 JC 1 TMRM等 可结合到线粒体基质 流式细胞仪检测细胞的荧光强度不能区分细胞凋亡或其他原因导致的线粒体膜电位的变化 TUNEL 细胞凋亡中 染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3 OH末端 可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶 TdT 的作用下 将脱氧核糖核苷酸和荧光素 过氧化物酶 碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3 末端 从而可进行凋亡细胞的检测 是