地塞米松对哮喘小鼠肺液清除功能障碍的作用.pdf

药学服 务与研究P h a r m C a r e R e s 2 0 0 8 F e b 8 1 董春玲 等 地塞米松 对哮喘小 鼠肺液清除功能障碍的作用 地塞米松对哮喘小鼠肺液清除功能障碍 的作用 董春玲 鲁继荣 王桂芳 李 波 肖 奎 陈智鸿 白春 学 1 复旦大学附属 中山医院呼吸 内科 上海 2 0 0 0 3 2 2 吉林大学附属第一医院儿科 长春 1 3 0 0 2 1 论 著 摘要 目的 研究支气管哮喘 以下简称哮喘 小鼠肺液清除功能的变化及地塞米松的作用 并探讨其可能机制 方 法 雌性 C 5 7 B I 6小鼠 4 8只 随机分为对照组 哮喘组和地塞米松干预组 以卵蛋 白 OVA 联合佐剂腹腔注射 第 1 1 5天 加雾 化吸入 第 2 5 2 9天 方法复制小 鼠哮喘模型 分别在末次激发 后 2 h及 2 4 h测定各 组小 鼠肺组织病 理变 化及湿干重 比值 W D 应用免疫组化法测定 各组水通道蛋 白 5 AQP 5 在肺组织 中的分布 分别 采用实时 P C R和蛋 白质印迹 法测定各组 小 鼠肺组织 中 AQ P 5 mRN A和蛋 白质 的变化 E I I S A法测定各组小 鼠支气管肺泡灌洗液 中细胞数和细 胞因子 I F N 一 7及 I L 一 1 3 的水平 结 果 哮喘组小 鼠肺组织 W D较对照组 明显升高 末 次激发后 2 h和 2 4 h分别 为 4 9 8 0 4 6和 4 8 1 0 3 3 分别 升高 2 2 9 和 1 8 7 P 0 0 5 且激发后 2 h哮喘组小 鼠肺组织 W D升高更 明显 地 塞米松干预组 小 鼠 2 h和 2 4 h肺组 织 W D分别为 4 O 1 0 1 1 和 4 2 1 0 1 4 与哮 喘组小 鼠相比显著 降低 P 0 0 5 HE 染色可见哮喘组 小鼠肺组织支 气管 周围大量以嗜酸性粒细胞 和淋 巴细胞 为主 的炎 细胞浸 润 地 塞米松 干预组小 鼠气道 炎症 程度减轻 支 气管肺 泡 灌洗 液 中嗜酸 性粒 细胞 单 核细 胞和 淋 巴细胞 比哮喘组 明显 减少 I F N 一 7和 I I 一 1 3分别 为 8 9 2 5 9 7 1 和 5 2 3 7 8 6 9 p g m I 与哮喘组 I F N 一 7和 I I 一 1 3 分别 为 6 6 7 1 7 5 1 和 8 5 4 9 9 2 3 p g mI 相 比明显改善 P 0 0 5 免疫组化分析 表明 AQP 5主要表达于 I型肺泡上皮细胞和 气道上皮细 胞的腔膜 面 哮喘小 鼠肺组 织 中 A QP 5的表 达均较 对照组 明显减少 mR NA减少约 4 2 蛋 白质 减少约 6 4 地塞 米松上 调其表 达 与模 型组 比较 P 0 0 5 结 论 哮喘小 鼠存在肺液清除功能障碍 肺液 含量 增加可能与 AQP 5表达下 降有关 地塞 米松在发挥抗 炎作 用的 同时 还可通 过上调 AQP 5的表达而对哮喘发挥治疗作用 关键词 哮喘 地塞米松 肺液清除 水通道 蛋白 5 中图分类号 R 2 5 6 1 2 R 9 6 5 1 文献标识码 A 文章编 号 1 6 7 卜2 8 3 8 2 0 0 8 0 1 0 0 2 4 0 4 Ef f e c t s o f d e x a me t ha s o ne o n a l v e o l a r f l u i d c l e a r a n c e i n mo u s e a s t h ma mo d e l s DONG C h u n l i n g I U J i r o n g W ANG Gu i f a n g I I B o XI AO Ku i CHEN Z h i h o n g B AI C h u n x u e 1 De p a r t me nt of Pul mon a r y M e di c i ne Zho ngs ha n Hos p i t al af f i l i a t e d t o Fu da n Un i v e r s i t y Sha n gha i 20 00 32 Chi n a 2 De pa r t me nt of P e d i a t r i c s t h e Fi r s t Ho s p i t a l a f f i l i a t e d t o J i l i n Un i v e r s i t y Ch a n g c h u n 1 3 0 0 2 1 Ch i n a A B S T R A C T 0b j e e t i v e T o s t u d y t h e e f f e c t s o f d e x a me t h a s o n e D e x o n a l v e o l a r f l u i d c l e a r a n c e A F C i n mo u s e a s t h ma mo d e l s a n d e x p l o r e t h e p o s s i b l e me c h a n i s m Me t h o d s F o r t y e i g h t f e ma l e C 5 7 BI 6 mi c e we r e r a n d o ml y d i v i d e d i n t o 3 g r o u p s c o nt r ol gr ou p a s t hma g r o up a nd De x gr ou p The a s t hma mode l s we r e e s t ab l i s h e d by s e ns i t i z a t i on wi t h 20 fig o f ov a l bu mi n OVA a n d 0 6 mg o f a l u mi n u m h y d r o x i d e o n t h e 1 s t d a y 1 5 t h d a y a n d c h a l l e n g e d wi t h 1 OVA o n t h e 2 5 t h t o 2 9 t h d a y s Th e we t d r y iI r a t i o o f l u n g a t 2 h a n d 2 4 h a f t e r t h e l a s t c h a l l e n g e wa s me a s u r e d Th e d i s t r i b u t i o n a n d e x p r e s s i o n o f a q u a p o r i n 5 AQP 5 i n l u n g we r e d e t e c t e d b y i mmu n o h i s t o c h e mi s t r y r e a l t i me P CR a n d We s t e r n b l o t t i n g me t h o d Br o n c h o a l v e o l a r l a v a g e wa s p e r f o r me d a t 2 4 h a f t e r t h e l a s t c h a l l e n g e a n d e e l l c o u n t s a n d t h e l e v e l s o f c y t o k i n e s we r e e x a mi n e d Re s u l t s Th e we t dr y r a t i o of l u ng i n a s t hma gr ou p wa s i nc r e a s e d s i g ni f i c a nt l y a t 2 h 4 9 8 0 46 a nd 2 4 h 4 81 0 3 3 af t e r t he l a s t c h a l l e n g e a s c o mp a r e d wi t h t h e c o n t r o l g r o u p P 0 0 5 Th e we t d r y r a t i o i n De x g r o u p wa s 4 0 1 0 1 1 a t 2 h a n d 4 2 1 0 1 4 a t 2 4 h wh i c h we r e o b v i o u s l y d e c r e a s e d a s c o mp a r e d wi t h a s t h ma g r o u p P 0 0 5 Tot a l c e l l c ou nt e os i no phi l s a nd l ymp ho c yt e s i n b r onc ho a l v e o l a r l a va g e a nd l un g t i s s u e of a s t hma gr oup we r e i nc r e a s e d s i gni f i c a nt l y whi l e De x de c r e a s e d t he m The l e ve l s of I FN一 7 a nd I L一 1 3 we r e do wnr e gu l at e d i n De x gr ou p 8 9 2 5 9 7 1 a n d 5 2 3 7 8 6 9 p g mL a n d h a d s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e w i t h a s t h ma g r o u p 6 6 7 1 7 5 1 a n d 8 5 4 9 9 2 3 p g mL P O 0 5 T h e e x p r e s s i o n o f A QP 5 w a s ma i n l y l o c a t e d i n a l v e o l a r t y p e I c e i l s a n d e p i t h e l i a l c e l l s o f t r a c h e a Th e e x p r e s s i o n o f AQP 5 i n l u n g t i s s u e o f a s t h ma g r o u p wa s o b v i o u s l y d o wn r e g u l a t e d a t mRNA l e v e l d e c r e a s e d b v a b o u t 4 2 a n d p r o t e i n l e v e l d e c r e a s e d b y a b o u t 6 4 Th e e x p r e s s i o n o f AQP5 wa s u p r e g u l a t e d b y De x a s c o mD a r e d wi t h a s t h ma 基金项 目 国家 自然科学基金资助项 目 N o 3 0 3 7 0 6 1 1 上海市重点学科建设资助项 目 N o B 1 1 5 作者简介 董春玲 1 9 7 6 一 女 汉族 博士生 主治 医师 E m a i l d o n g c h u n l i n g g ma i l c o m 通讯作者 E ma i l c x b a i z s h o s p i t a 1 c o m 维普资讯 药学服务与研究P h a r m C a r e Re s 2 0 0 8 F e b 8 1 董春玲 等 地塞米松对哮喘小 鼠肺 液清除功能障碍 的作用 2 5 g r o u p P8 0 混匀支气管肺泡灌洗液 离心 上清液置于一8 0 C保存 备测细胞因子 涂片机涂 片后采用瑞氏染色计数细胞及分类计数 1 4观 察指标 和 测定 方法 1 4 1 病 理 学检 查 将 固定 于 4 多 聚 甲醛 的肺 组织 常规 脱 水 石 蜡 包埋 切 片 厚度 为 5 m HE 染色 以观 察炎 症 细 胞 浸 润 苏 木 素 伊 红 染 色 二 甲苯透 明 中性树 胶封 固 1 4 2 I F N一 7和 I L 1 3的含 量 采 用 E L I S A 法 按 照试 剂盒说 明书步 骤测定 支气 管肺 泡灌洗 液上 清 液 中 I F N一 7和 I L 一 1 3的含 量 1 4 3 AQP 5在肺组织 中的表达 免疫组化法检 测肺 组 织 中 AQP 5的分 布及 含 量 变 化 切 片经 常 规 脱蜡 水 化后 用 3 过 氧 化 氢 去 除 内源 性 氧 化 酶 微波抗原修复 其余步骤按试剂盒说明书进行 用 已知阳性片作为 阳性对照 以 P B S代替一抗作为阴 性对照 AQ P 5抗体稀释度为 1 2 0 0 棕黄色者为 阳性表 达细 胞 1 4 4 AQP 5 mR NA 根 据 AQP 5的基 因 序 列 基 因 编号 NM一 0 0 9 7 0 1 设 计 合 成 引 物 正 向引 物 g c g c t c a g c a a c a a c a c a a c 反 向 引 物 g t g t g a c c g a c a a g c c a a t g 扩增 长度 为 1 4 9 b p 采用 TR I z o l 提取 各组小 鼠肺组织总 RNA 取 2 g R NA逆转录合成 c DNA 以 2 L c D NA 为模板 加入 1 0 L S YB R Gr e e n行 r e a l t i me P C R 肌动 蛋 白 J3 一 a c t i n 基 因编 维普资讯 2 6 I S S N 1 6 7 1 2 8 3 8 P h a r m C a r e R e s 药学服务与研 究2 0 0 8 F e b 8 1 WWW p c a r j o u r n a 1 n e t c n E ma il Ph a r mCR y a h o o c o n 1 c n Ph n Fa x 8 6 21 6 5 5 1 9 82 9 号 X 0 3 6 7 2 为 内 参 正 向 引 物 a c g g c c a g g t c a t c a c t a t t g 反 向引物 t g g a t g c c a c a g g a t t c c a t 并 设 阴性 对 照 反应 条件 相 同 1 4 5 AQP 5蛋 白 常规 提取 肺组 织蛋 白质 B C A 法定量 取 5 0 g样 品加入等体积 2 S D S P AG E 样 品缓 冲液 沸 水煮 5 mi n 进行 S D S P AGE 电泳 其 后转移 至 聚 偏 二 氟 乙 烯 P VD F 膜 用 T B S T 缓 冲 液 1 0 mmo l L t r i s HC 1 1 5 0 mmo l L Na C 1 0 0 5 T we e n 一 2 0 洗 膜 3次 每次 1 0 mi n 按 试 剂 盒 说 明操 作 暗室 曝 光 显 影后 用凝 胶 成 像 仪 测 灰 度值 取均 值 1 5 统计 学 处理 数 据 以 S表 示 采 用 均 数 t 检验 比较 组 问差 异 2 结 果 2 1 哮喘模 型 的建 立 哮喘组 小 鼠气 道 和血 管周 围有大量 的嗜酸性 粒细 胞浸 润 较 对 照组 明显 增 多 地 塞米松 干 预组较 哮 喘组 则 明 显 减轻 但 仍 比对 照 组 多 见 图 1 2 2 肺 泡 灌洗液 中细 胞 因子 含 量 及 细胞 分 类计 数 的 变化末 次 激 发后 2 4 h 地塞 米 松 干预 组 小 鼠肺 泡 灌洗 液 中总细胞 数 嗜酸 性粒 细胞 单核细 胞 和淋 巴细胞均 较 哮 喘 组 明显 减 少 I F N 一 和 I L 一 1 3水平 与 哮喘组 相 比有 明显改 善 见表 1 图 1 各 组 小 鼠末 次 激 发 后 2 4 h肺 组 织 HE染 色 病 理 学 图片 1 6 6 0 F i g 1 T h e h i s t o p a t h o l o g i c a l p i c t u r e s o f t h e l u n g i n e a c h g r o u p 2 4 h a f t e r t h e l a s t c h a l l e n g e HE s t a i n i n g l 6 6 0 A 对照组 B 哮喘组 C 地塞米松干预组 表 1 各组小 鼠支气 管肺泡灌洗液和肺 组织 的检 测结果比较 Ta b l e 1 Co m pa r i s o n o f t he e v a l ua t i o n i n de xe s of b r o nc ho a l v e o l a r l a v a g e an d l un g t i s s u e b e t we e n di f f e r e n t g r o u ps P i 0 0 5 与对照组 比较 P i 0 0 5 与哮喘组 比较 与 B a c t i n比值相对定量 2 3 肺组 织 W D肺 组 织 W D用 来 评 估 肺水 肿 或肺 水平衡 哮 喘 组肺 组 织 的 W D较 对 照 组 明显 增高 尤 以激发后 2 h增 高更 明显 地 塞 米松 干 预组 肺组 织 的 W D较 哮 喘 组 显 著 减 低 且 与 对 照 组 无 明显差 异 见 表 1 2 4 AQP 5在肺 组 织 中的 分 布 及 表 达 变 化 免疫 组化分析发现 AQ P 5染色阳性细胞在各组的分布并 无差别 主要 表 达于I 型 肺泡 上皮 细胞及 气 道 上皮 细 胞 的腔膜 面 而在 肺 内其他 细胞 如 中性粒 细 胞 嗜酸 性粒细胞及淋巴细胞等炎症细胞上并无 AQ P 5蛋 白 的表达 在 哮喘组 肺组 织 中染 色 阳性 的细 胞 明显 减 少 采用实 时 P C R和蛋 白质 印迹 We s t e r n b l o t t i n g 法定量 分 析 表 明 与 对 照组 相 比 AQ P 5的mR N A和 蛋 白质在 哮喘组小 鼠肺 组织中 的表 达显 著降低 地 塞 米松升 高其 表达 具体见表 1 图 2和图 3 3讨 论 本 研究 建立 的 小 鼠哮 喘 模 型 依 据 病 理检 查 和 支 气管 肺泡 灌洗 液细胞 因子测定 细 胞分类 证 实 了 OVA 的反 复刺 激可诱 发 特征性 哮 喘 即表 现为 支气 管 周 围显 著增 多 的炎细 胞 浸 润 肺组 织 W D值 分 析 发现 哮喘组 肺 水 明显 增 多 地 塞 米松 可 逆 转 这种 变化 进 一步 研究 发 现 哮 喘组 小 鼠肺 AQP 5的 表 达 明显下 降 推 测其 主要 原 因可能 是 肺 水 增 多 这 维普资讯 药学服务与研究P h a r m C a r e R e s 2 0 0 8 Fe b 8 1 董春玲 等 地塞米松对 哮喘小 鼠肺液清除功能障碍的作用 2 7 一 一 圈 2各组小 鼠末次激发后 2 4 h 肺 组织 A QP 5的免疫组化照片 1 6 6 0 J F i g 2 I mmu n 0 h i s t 0 c h e mi c a l p i c t u r e s o f AQP 5 i n l u n g t i s s u e o f mi c e 2 4 h a f t e r t h e l a s t c h a l l e n g e 1 6 6 0 J A 对照组 B 哮喘组 C 地 塞米松 干预组 图 A 4 8 0 0 对 照组 哮 端 组 地塞 米松干 预组 即 s 图 3各 组 小 鼠末 次 激 发 后 2 4 h肺 组 织 A QP 5的蛋 白质印迹照片 Fi g 3 We s t e r n b l o t t i n g p i c t u r e o f A QP 5 i n l u n g t i s s u e of m i c e 24 h a f t e r t he l a s t c ha l l e ng e 一 结 果与 国外研 究 的腺病毒 感染 模 型l l4 或博 来 霉 素 肺损 伤模 型 弓 1 起 的 AQP 5减 低 结 果 相 似 分 析 其原 因可 能为 哮喘 时 气 道分 泌 炎 症 介 质 细 胞 因 子 及过 敏炎症 导致 气 道损 伤 引起 上 皮 细 胞 的脱 落 和 破坏 导致 AQP 5 表达降低 但是免疫组化分析发 现 AQP 5 下 降呈 均一 分布 并非 单纯 发 生于 炎症 反 应重 上皮 细胞脱 落 多的部 位 提 示可 能 通过更 复杂 的信 号 通 路 影 响肺 上皮 细胞 中 AQP 5的基 因表 达 和亚细 胞移 位来干 预其 介导 的膜 水通透 本实 验 结 果首 次报 道 地 塞 米松 对 支 气 管 哮 喘 时肺 组 织 内 AQP 5表达 有升 高调 节 作 用 而且 其 升 高 作 用 是 均 一 的 并非呈 明显 区域性 分布 提示 地塞 米松 可能 通 过 以上 细胞 因子或 c AMP等发挥 作用 AQP 5的 降低 参 与肺 水 转 运 失 衡 已有报 道 7 本研 究小 组 曾用 R NAi 技 术 下 调人 气 道 上 皮 细 胞 AQP 5的表达后发现其黏蛋白 MUC 5 AC表达水 平显 著升 高 这些 早 期 的发 现 提 示 AQP 5在 保 持 正 常肺 水平 衡 中发挥 重要 作用 并且 细 胞表 面 AQP 数量 和 或 功能 的变 化 可 能 有助 于不 同肺 疾病 如肺 水 肿 中异常 水代谢 本 研究 发 现 哮 喘小 鼠肺 W D 与 AQP 5的表达密切相关 证实了 AQP 5降低会导 致 哮喘 时肺水 在毛 细 血 管 与肺 泡 间转 运 失衡 进 一 步 提 示 地 塞米 松 极 可能 通 过 提 高 AQP 5水 平 以加 快肺泡内液体 的清除 从而减轻肺组织 的水肿程度 发 挥其 减轻 哮 喘 炎 症 作 用 同 时 也 不 能 完 全 排 除 AQP 5的降低 继 发于 哮 喘炎症 这 种可 能 总 之 AQ P 5 可 能是 哮喘状 态有 用 的指标 至于 肺水 的增 多是由于 AQP 5降低导致肺泡 内水清除障碍所致 还 是 AQP 5的表达利 于 肺 水 的形 成 其 因果 关 系 尚 不明了 进一步研究地塞米松 对 AQ P 5的具 体作 用 机制 可为 治疗 哮 喘性 肺 水 增 多 和 气 道黏 液 高 分 泌提 供新 的靶 点 参考文献 1 Wi l l i a ms O W S h a r a f k h a n e h A Ki m V e t a 1 Ai r wa y mu C U S f r o m p r o d u c t io n t o s e c r e t i o n E J A m J Re s p i r C e l l Mo l Bi o l 2 0 06 3 4 5 5 27 5 3 6 2 B o r o k Z Ve r k ma n A S L u n g e d e ma c l e a r a n c e 2 0 y e a r s o f p r o g r e s s i n v i t e d r e v i e w r o l e o f a q u a p o r i n wa t e r c h a n n e l s i n f l u i d t r a n s p o r t i n l u n g a n d a i r wa y s J J Ap p l P h y s i o l 2 0 0 2 9 3 6 21 9 9 2 2 0 6 3 Ed wa n J H T a l ma d g e J E Ag r a wa l D K Tr e a t me n t wi t h Fh3 l i g a n d p l a s mi d r e v e r s e s a l l e r g i c a i r wa y i n f l a mma t i o n i n o v a l b u mi n s e n s i t i z e d a n d c h a l l e n g e d mi c e J I n t I mmu n o ph a r m a c o l 2 0 05 5 2 3 4 5 3 5 7 4 To wn e J E Ha r r o d K S Kr a n e C M e t a 1 D e c r e a s e d e x p r e s s i o n o f a q u a po r i n AQP 1 a n d AQP5 i n mo u s e l u n g a f t e r a c u t e v i r a l i n f e c t i o n J Am J Re s p i r C e l l Mo l B i o l 2 0 0 0 2 2 1 3 4 4 4 5 Ga b a z z a E C Ka s p e r M Oh t a K e t a 1 D e c r e a s e d e x p r e s s io n o f a q u a p or i n 5 i n b l e o my c i n i n d u c e d l u n g f i b r o s i s i n t h e mo u s e J P a t h o l I n t 2 0 0 4 5 4 1 0 7 7 4 7 8 0 6 N