液相色谱柱的应用.ppt

液相色谱柱的应用 高效液相色谱培训系列 目录 一 液相色谱分离原理 二 液相色谱柱的结构 三 液相色谱柱的选择 四 色谱柱的使用 五 分析条件的影响 六 色谱柱的维护 一 HPLC分离原理 样品组分在流动相和固定相之间进行分配 由于不同组分在流动相和固定相之间的交互作用能力 吸附 分配 离子交换 分子尺寸等 不同 使得不同组分在色谱柱上的移动速率不一样 从而产生色谱分离 必要条件 分配过程 分配系数 K K K 常数 T恒定 Cm 组分在流动相中的浓度Cs 组分在固定相中的浓度 容量因子k 是指在一定条件下 组分在两相间达到分配平衡时的质量比 在实际工作中 常应用另一表征色谱分配平衡过程的重要参数 容量因子 capacityfactor 也称分配比 partitionratio 以k表示 k Ms MmMs为组分在固定相中的质量 Mm为组分在流动相中的质量 由保留时间计算出容量因子 即可由实验测定容量因子k 色谱理论 塔板理论 柱分离效能指标 色谱理论 速率理论 影响柱效的因素 速率理论是荷兰学者范 弟姆特于1956年提出的 表述了影响柱效的因素及提高柱效的多种途径 其核心是速率方程 也称范 弟姆特方程式 速率方程H A B u C uH 理论塔板高度 u 流动相的线速度 色谱理论 速率理论 影响柱效的因素 H A B u C u 色谱理论 分离度 分离度 两个相邻组分的保留值之差与其平均峰宽之比 R 2 TR2 TR1 W2 W1 计算表明 1 R 0 8时 两组分不能完全分离2 R 1时 两组分峰重叠约2 3 R 1 5时 两组分峰完全分离 R值越大分离越好 反之则峰重叠愈多 降低柱温 增加柱长可使R提高 样品组分的分离 液相色谱的基本流程图 流动相 泵 色谱柱 检测器 泵输液 分离 检测 记录 进样阀 进样 HPG 3x00RS泵在整个流速范围下保持800bar高压最高流速达到5ml minWPS 3000RS自动进样器进样周期15秒进样阀耐压1000barTCC 3000RS柱温箱5 110 C温度范围柱后冷却DAD 3000RS检测器全波长扫描范围数据采集速率100HzAcclaim 2 m色谱柱耐压800barChromeleon CMS软件及时获得结果 UltiMate3000RSLC快速分离液相 15 01 2020 13 高性能 UltiMate3000 x2三元梯度系统 有六通道脱气机的溶剂架 独特的双梯度泵 两个三元梯度泵封装在一个机箱内 带温控选项的自动进样器 独特的柱温箱可放置两个柱切换阀 可变波长或二极管矩阵紫外可见光检测器 液相色谱柱的应用 二 色谱柱的结构和安装 色谱柱的构造 色谱柱管常用内壁抛光的不锈钢管作色谱柱的柱管以获得高柱效 使用前柱管先用氯仿 甲醇 水依次清洗 再用50 的HNO3对柱内壁作钝化处理 钝化时使用HNO3在柱管内至少滞留10min 以在内壁形成钝化的氧化物涂层 色谱柱规格内径 常用4 6mm 2 1mm柱长 常用50 100 150 250cm 色谱柱的构造 色谱柱管由柱接头 柱管及滤片组装而成 柱接头采用低死体积结构 柱接头两端是螺纹组件连接 中间放置压环用于密封 为了尽量减少柱外死体积 在安装色谱柱时 用 1 57mm连接管通过空心螺钉压环后要尽量插到底 然后再拧紧空心螺钉 色谱柱子的构造 不同厂家和型号的柱子会有一定的差别 液相色谱柱的构造 在两端柱接头内 柱管两端各放置一片不锈钢滤片 或滤网 用于封堵柱填料不被流动相冲出柱外而流失 空柱各组件均为不锈钢材质 能耐受一般的溶剂作用 但由于含氯化物的溶剂对其有一定的腐蚀性 故使用时要注意 柱及连接管内不能长时间存留此类溶剂 以避免腐蚀 色谱柱的构造 柱填料 液相色谱柱的分离作用是在填料与流动相之间进行的 柱子的分类是依据填料类型而定 常用颗粒粒径在3 10 m的范围内 正相柱 多以硅胶为柱填料 另一类正相填料是硅胶表面键合 CN NH2等官能团即所谓的键合相硅胶 反相柱 主要是以硅胶为基质 在其表面键合十八烷基官能团 ODS 的非极性填料 常用的其他的反相填料还有键合C8 C4 C2 NH2 苯基等 液相色谱柱的安装 色谱柱的安装 拆开柱包装盒 确认色谱柱的类型 尺寸 出厂日期以及柱内贮存的溶剂 液相色谱柱的安装 按柱管上标示的流动相流向 如条件允许 建议在柱前使用保护柱 柱的出口与检测器连接 连接管是外径为1 57mm 内径为0 1 0 3mm的链接管 连接管通过空心螺钉 压环后尽量用力插到底 然后顺时针拧紧空心螺钉 直到拧不动为止 如色谱柱通过流动相加压后有漏液现象 请用扳手继续顺时针拧1 4圈 直至不漏液为止 连接接管必须注意 色谱连接注意事项 1 尽量减少死体积 连接管线与接头 0 12mm内径管线用于毛细管HPLC中 2 1内径色谱柱0 17mm内径管线用于分析型HPLC中2 1 4 6内径色谱柱0 25mm内径管线用于半制备型HPLC中9 4内径色谱柱0 5mm内径管线用于制备型HPLC中21 2内径色谱柱 50mL柱外体积 管线 样品 1 苯丙胺酸2 5 苯基 3 6 二氧 2 哌嗪乙酸3 Asp Phe4 天冬甜素 色谱柱 StableBondSB C18 4 6x30mm 3 5mm流动相 85 H2Owith0 1 三氟乙酸 15 ACN流速 1 0mL min温度 35 C 液相色谱柱的应用 三 液相色谱柱的选择 分离模式的选择 样品 溶于有机溶剂 溶于水 溶于四氢呋喃 非离子化 离子化 溶于有机溶剂 溶于水 溶于正己烷 溶于甲醇或甲醇 水或乙腈或乙腈 水 用键合相的反相模式 用键合相的反相模式 低分子凝胶渗透色谱 用键合相的反相模式 抑制电离反相键合相色谱 用硅胶的正相模式 离子交换模式 凝胶渗透色谱 凝胶过滤色谱 大孔填料的离子交换模式 用大孔填料的反相模式 分子量 2000 分子量 2000 低分子凝胶渗透色 用硅胶的正相模式 用键合相的正相模式 1 填料 硅胶 氧化铝 聚苯乙烯等2 键合相 C4 C8 C18 苯基 氨基等 封端技术 3 孔径 60 100A分子量20004 粒径 2um 10um5 内径 10mm以下 分析 10mm以上 制备 6 长度 10 15 25 30mm 柱子的选择 正相 反相色谱 正相色谱20 反相色谱80 正相色谱极性 固定相 流动相固定相 极性流动相 正己烷 异丙醇 非极性极性物质后出峰 反相色谱极性 固定相 流动相固定相 非极性流动相 甲醇 水 乙腈 THF 极性非极性物质后出峰 正相色谱 C B A C B A CBA CBA 低极性流动相中极性流动相 极性 A B C 反向色谱法 固定相 非极性 C18 C8 C4 苯基流动相 极性 Water MeOH MeCN THF弱酸 弱碱 溶剂极性 各种反相填料的使用比例 反向色谱法 高极性流动相中极性流动相 极性 A B C ABC ABC 流动相 1 反相色谱最常用的流动相及其冲洗强度如下 H2O 甲醇 乙腈 乙醇 丙醇 异丙醇 四氢呋喃最常用的流动相组成是 甲醇 H2O 和 乙腈 H2O 由于乙腈的毒性大 价格贵 通常优先考虑 甲醇 H2O 流动相 2 正相色谱常用的流动相及其冲洗强度的顺序是 正己烷 乙醚 乙酸乙酯 异丙醇最常用的是正已烷 不同混合溶剂的粘度比较 柱填料基质 硅胶基质 pH2 8Al2O3 nH2O pH1 14聚合物基质 pH1 14 高pH下 硅胶会溶解低pH下 键合相会断裂 化学修饰困难 孔结构复杂 孔径不均匀 导致柱效不够高 有机溶剂可能导致聚合物基质溶涨而受损 色谱柱的性能参数 物理性质 硅胶纯度色谱柱尺寸颗粒形状粒径表面积孔径 键合类型碳覆盖率封端 化学性质 色谱柱的物理性质 硅胶纯度填料硅胶的纯度与残留金属离子浓度色谱柱尺寸色谱柱子的长度和内径颗粒形状球型或不规则型粒径平均颗粒直径 通常3 10 m表面积颗粒外表面和内部孔表面的总和 以m2 g表示孔径颗粒的孔或腔的平均尺寸 范围80 300 硅胶纯度 A类硅胶由于带负电荷的残留硅羟基和酸性表面上金属含量高 硅羟基的pKa低 导致碱性化合物发生拖尾 B类硅胶 高纯 由于金属含量低 硅羟基pKa高 碱性化合物不易发生拖尾 一般金属浓度 35ppm 99 995 纯度的二氧化硅 A型 B型硅胶比较 A型硅胶化合物被吸收 B型硅胶峰型峰高分离正常 金属敏感测试 色谱柱Diamonsil 钻石 C185um 150 x4 6mm流动相CH3CN Water 50 50 流速1 0mL min检测UV 230nm硅胶中如果存在金属杂质 将与2 3 二羟基萘 峰2 形成金属螯合物 保留时间延长并导致峰形拖尾 2 7 二羟基萘 峰1 不与金属作用并作为内标物 色谱柱子的尺寸 色谱柱尺寸对色谱分离的影响 短柱 15 100mm 运行时间短 柱压低 长柱 150 250mm 运行时间长 分离度高 窄径柱 2 1mm 检测器灵敏度高 宽径柱 3 23mm 载样量高 颗粒形状与大小 颗粒形状 1球形2无定形 球形 粒径 对色谱分离的影响较小的颗粒柱效较高 但会引起柱压过高 3 5 m粒径的常用于分离复杂的多组份样品 而组份单一的样品多采用5 m的粒径 1 8 m3 5 m5 m7 m10 m 填料粒度 商品化的填料从2 m 30 m目前常用于分析3 m 5 m 10 m用于半制备10 m 15 m用于制备15 m 30 m3 m填料 粒径的影响 N Flow 3 m5 m10 m 粒径与柱效 核壳U HPLC的科学原理 美国AdvancedMaterialTechnologyInc Kirkland博士发明 内核1 7um 因此柱效至少相当于UPLC 外层0 5um 总粒径2 7um 因此色谱柱压力接近3 0um色谱柱 流速设定 色谱柱尺寸和填料粒径的影响 1 C184 6 250 5um 242nm 甲醇15 60 45min 2 C184 6 150 3 5um 242nm 甲醇15 60 25min 3 C184 6 50 3 5um 242nm 甲醇15 60 10min 比表面积与孔径 表面积 对色谱分离的影响高比表面积对于多组份样品的分离具有较强的保留能力 柱容量和分离度 比表面积低的填料通常能迅速达到平衡状态 对于梯度淋洗尤为重要 孔径 对色谱分离的影响大孔的填料颗粒可以延长溶质大分子在填料表面滞留的时间 达到充分分离 改善峰形样品MW 2 000 选择100 的孔径样品MW 2 000 选择300 的孔径 比表面积的比较 比表面积与孔径的影响 大孔径填料适用于大分子分析 大孔径300 全多孔色谱柱可用于分离蛋白质和多肽 色谱柱填料孔径必须适合待测物分子自由进出填料孔 与孔内表面的键合相进行分离分配 300 孔径可改善蛋白质和多肽峰形 选择合适的填料孔径分析大分子可获得最佳峰形 300 孔径可改善大分子的峰形 色谱柱 4 6x150mm 5mm流动相 60 MeOH 40 0 1 三氟乙酸流速 0 75mL min温度 RT检测器 UV282nm 溶液中的分子尺寸决定适宜的色谱柱孔径窄的峰宽表明待测分子进入填料孔没有受到阻碍 分子量虽小但体积较大的分子 色谱柱化学性质 键合类型 单齿键合 键合相分子与基体单点相连 双齿键合 键合相分子与基体多点相连碳覆盖率 与基体物质相连的键合相的量封端 键合步骤之后 用短链将裸露的硅羟基键合后封闭起来 键合类型 键合类型对色谱分离的影响 单齿键合 提高传质速率 加快色谱柱平衡双齿键合 增加色谱柱稳定性 增加色谱柱的载样量 碳载量 碳载量是指固定相中碳的含量不同的键合相有不同的键合密度 并决定固定相的本质 一般C18 C18的碳载量为10 14 高的可达18 20 碳载量 碳载量 对色谱分离的影响高碳载量 保留强 提高分辨率 分析时间长低碳载量 保留弱 缩短运行时间 碳载量 封端技术 封端 对色谱分离的影响封端 减轻待测组份与硅胶表面残留的酸性硅羟基反应而引起的色谱峰拖尾现象对于极性样品和碱性样品 未封端与经过封端处理的色谱柱在选择性上有明显差异 固定相键合二甲基硅烷 封端四甲基硅烷 Si O OH O O CH 3 Si R CH 3 CH 3 Si CH 3 CH 3 Si R CH 3 R C8 C18 etc O OH OH O CH 3 Si R CH 3 CH 3 Si R CH 3 Cl CH 3 Si CH 3 CH 3 OH OH OH OH CH 3 Cl R CH 3 TMS 传统键合及封端技术 三基封端技术 酰胺基 PG 极性酰胺基 R1 空间保护的异丙基 R 烷基链柱子稳定性更好 寿命更长 超临界封端技术 传统封端 固 液回流封端 封端试剂和催化剂溶于有机溶剂中 甲苯 与键合相在有机溶剂沸腾温度回流数小时至数天不等 硅胶小孔难到达 超临界封端 封端试剂和催化剂由CO2超或亚临界流体传递 封端试剂在超或亚临界流体状态下扩散系数是固 液回流状态的1000倍 能充分扩散到硅胶表面和小孔内部 只需要数小时就可以最大限度封闭活性硅羟基 碱灭活测试 色谱柱Diamonsil 钻石 C185um 250 x4 6mm流动相CH3OH H2O 49 51 流速1 0mL min检测UV 254nm如果硅胶表面已经被完全化学改性 乙基苯胺的三个异构体将不会与硅胶发生非极性作用力 所以不会分离并共同洗脱出来 封端技术比较 保留值与pH的关系 pH变化值0 1 RS变化值1 6 色谱柱 C184 6X250mm 5um流动相 27 甲醇 73 磷酸pH2 5 2 6温度 500C流速 1 0mL min 保留值与pH的关系 色谱柱 XDB C84 6x75mm 3 5 m流动相 44 25mM磷酸 pH7 00 56 甲醇流速 1 0mL min温度 25 C检测 UV250nm 可电离的组份的分离可能会随pH变化发生显著变化 甚至很小的0 05 0 25个pH变化单位 样品 ketoprofenethylparabenHydrocortisonefenoprofenpropylparabenPropranololibuprofen 0 25个pH pH值对保留时间的影响 碱性条件保留时间随PH变化明显 PH变化0 2 保留时间变化1 2min 保留时间随PH变化不明显 酸性条件保留时间随PH变化明显 保留值与pH的关系 复杂组分的流动相pH选择技巧 色谱柱 Extend C184 6x150mm 5mm流动相 30 缓冲液 70 MeOHpH7缓冲液20mMNa2HPO4pH11缓冲液20mMTEA流速 1 0mL min温度 RT检测器 UV254nm 05 1 2 3 4 5 Time min 7 6 C18pH7 1 Maleate马来酸盐2 Scopolamine东莨菪碱pKa7 63 PseudoEphedrine假麻黄碱pKa9 84 Doxylamine抗敏安 多西拉敏 pKa9 25 Chlorpheniramine氯苯吡胺pKa9 16 Triprol内径ine苯丙烯啶pKa6 57 Diphenhydramine苯海拉明pKa9 0 C18pH11 0510 1 2 3 4 Time min 6 5 7 高pH下 碱性成分的保留增加 待测物pKa 1 5以外的流动相pH可保证方法的稳定性 液相色谱柱的应用 四 色谱柱的使用 色谱柱的评价 色谱柱的评价 溶剂前处理 过滤 0 45um或0 22um孔径滤膜目的 除去流动相和样品溶剂中的微小颗粒 避免堵塞色谱柱 尤其是使用无机盐配制的缓冲液 试剂纯度 采用 HPLC 级溶剂对试样有适宜的溶解度 溶剂前处理 脱气目的 除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡气泡对测定的影响 1 柱流量不准2 检测器基线波动 返回 基线问题分析 液相色谱柱的使用 平衡色谱柱反相色谱柱在经过出厂测试后是保存在甲醇 乙腈 的 由于色谱柱在储存或运输过程中可能会干掉 硅胶柱或极性色谱柱在经过出厂测试后是保存在正庚烷 正己烷 中的 如果需要使用含水的流动相 使用流动相之前用异丙醇过渡 液相色谱柱的使用 新色谱柱的平衡方法 首先用0 3ml min的流速将色谱柱平衡过夜 然后将流速逐步升高到1 0ml min冲洗30分钟 以便将色谱柱的填料充分平衡至最佳状态 这样可以保证色谱柱的使用寿命 并且保证在以后的使用中 获得分析结果的重现性 液相色谱柱的使用 日常平衡色谱柱反相色谱柱使用10 20倍柱体积的甲醇或乙腈平衡色谱柱 用流动相平衡色谱柱直到获得稳定的基线 如果您所使用的流动相中含有缓冲盐 应注意用90 甲醇或乙腈过渡 缓冲盐或离子对试剂度需要较长的时间来平衡 正相色谱柱在使用10 20倍柱体积有机溶剂后用流动相平衡直到基线平稳 如果需要使用含水的流动相 在使用流动相之前用异丙醇过渡 色谱柱柱内体积和平衡时间 单次样品运行时间 分析时间 色谱柱平衡时间色谱柱平衡时间 10倍柱内体积 流速 液相色谱柱的使用 流动相流速的选择 因柱效是柱中流动相线性流速的函数 使用不同的流速可得到不同的柱效 对于一根特定的色谱柱 要追求最佳柱效 最好使用最佳流速 对内径为4 6mm的色谱柱 流速一般选择1ml min 对于内径为4 0mm柱 流速0 8ml min为佳 当选用最佳流速时 分析时间可能延长 可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间 如使用反相柱时 可适当增加甲醇或乙腈的含量 USP允许调节的色谱条件范围 色谱柱子长度 70 色谱柱子内径 25 粒径 可减少50 流速 50 柱温 10 流动相比例 较小比例的成分 30 缓冲盐的浓度 10 流动相PH 0 5检测波长 不允许改变 五 分析条件调整的影响 流动相调整的基本原则 等度 1 由强到弱 一般先用90 的乙腈 或甲醇 水 或缓冲溶液 进行试验 这样可以很快地得到分离结果 然后根据出峰情况调整有机溶剂 乙腈或甲醇 的比例 2 三倍规则 每减少10 的有机溶剂 甲醇或乙腈 的量 保留因子约增加3倍 此为三倍规则 调整的过程中 注意观察各个峰的分离情况 3 微调比例 当分离达到一定程度 应将有机溶剂10 的改变量调整为5 并据此规则逐渐降低调整率 直至各组分的分离情况不再改变 样品溶剂溶解强度的影响 样品溶剂溶解能力强于流动相导致色谱峰峰形问题 裂分峰 色谱柱 ZORBAXC18 4 6x150mm 5um流动相 82 H2O 18 ACN检测波长 215nm A 样品溶剂100 乙腈 010 Time min 1 2 B 样品溶剂流动相 010 Time min 1 2 样品 安痛片 1 咖啡因2 水杨酰胺 样品溶剂溶解强度的影响 戴安Ultimate3000色谱柱 DionexacclaimC18 250 4 6mm流动相 磷酸二氢钠6 0g 加水1000ml 加三乙胺1ml 用氢氧化钠溶液调PH至7 0 甲醇 75 25 检测波长 254nm流速 1 0ml min样品溶剂溶解能力强于流动相导致色谱峰峰形问题 峰前伸和裂分峰 1 溶剂峰2 4 N 去甲基安乃近3 安乃近 溶剂 100 甲醇 溶剂 80 甲醇 缓冲液对中性物质的影响 色谱柱 ZORBAXEclipseXDB C18 4 6x75mm 3 5 m流动相 44 A 56 甲醇流速 1 0mL min温度 25 C检测 UV250nm 含缓冲液的流动相可改善保留 分离和色谱峰峰形 A 水 A 水 25mM磷酸盐缓冲液 1酮2泊金乙酯3可的松4诺洛芬5泊金丙酯6普萘洛尔7布洛芬 增加缓冲液浓度减少拖尾 色谱柱 EclipseXDB C84 6x150mm 5um流动相 40 磷酸盐缓冲液60 ACN流速 1 5mL min 温度 40 C USPTf1 621 651 631 771 831 12 10mM磷酸盐pH7 0 USPTf1 411 501 331 391 361 00 25mM磷酸盐pH7 0 在中等pH下 离子强度较高 能有效掩蔽硅羟基的二次作用减少拖尾 随缓冲盐浓度升高 Rt降低 流动相pH值的选择 酸性分析物 pH pKa 2碱性分析物 pH pKa 2 反相HPLC常用缓冲液 缓冲液pKapH范围磷酸盐pK12 11 1 3 1柠檬酸盐pK13 12 1 4 1甲酸盐3 82 8 4 8柠檬酸盐pK24 73 7 5 7乙酸盐4 83 8 5 8柠檬酸盐pK35 44 4 6 4磷酸盐pK27 26 2 8 2羟甲基甲胺8 37 3 9 3氨9 28 2 10 2硼酸盐9 28 2 10 2甘氨酸9 88 8 10 81 甲基 哌啶10 39 3 11 3四氢化吡咯10 59 5 11 5二乙胺10 59 5 11 5三乙胺10 79 7 11 7磷酸盐pK312 311 3 13 3 缓冲液的一般有效缓冲范围为PK 1pH 三乙胺对碱性成分峰形的影响 02 55 0 Time min 1 2 3 4 5 色谱柱 XDB C8 4 6x150mm 5mm流动相 85 25mMNa2HPO4 15 ACN流速 1 0mL min 温度 35 C USPTF5 1 1 292 1 333 1 634 2 355 1 57 NoTEA 10mMTEA USPTF5 1 1 192 1 183 1 204 1 265 1 14 样品 1 去甲麻黄碱2 麻黄素3 苯丙胺4 脱氧麻黄碱5 苯丁胺 酸对酸性组分的峰形的影响 色谱柱 ZORBAXStableBondSB C184 6x150mm 5mm流动相 40 A 60 ACN流速 1 0mL min 温度 室温样品 异丁苯丙酸 pKa4 4 pH35mMNaH2PO4 Tf 1 8 pH35mMNaH2PO41 乙酸 pH2 50 1 三氟乙酸 Tf 1 0 Tf 1 09 A 乙酸和三氟乙酸均能作为酸性调节剂加至流动相中 柱容量对峰型的影响 41 4mmoverloaded 4 6mmoverloaded 4 6mm 液相色谱柱 ZORBAXEclipseXDB C18色谱柱尺寸 4 6x250mm5 mUV 254nm流速 1mL min UracilButylparabenNaphthaleneDipropylphthala