食品101贺斌科技论文2.doc

天津渤海职业技术学院高效液相色谱法测定奶粉中三聚氰胺含量 High-performance liquid chromatography (HPLC) in melamine milk powder content 系别：环境工程系 专业名称：食品营养与检测 班级：101 姓名：贺斌学号:08摘 要目的：测定奶粉中三聚氰胺的含量。方法：采用甲醇-0.02mol/L硫酸铵（体积比 4：96）为流动相，流动相溶解样品， Hedera 5-C8（4.6250mm，5m）柱(江苏汉邦科技)分离,235nm检测。结果：线性范围为 26.24ng 2099.2ng(r=0.9999,n=9),平均回收率为 96.82%，RSD=1.57%（n=9）。结论：该方法奶粉中三聚氰胺的含量结果稳定，重现性好，可操作性强,适用于奶粉中三聚氰胺的定性定量检测。关键词：三聚氰胺；奶粉；HPLCABSTRACTObjective: to determine melamine milk powder in the content. Methods: using methanol - 0.02 mol/L ammonium sulfate (volume but 6 than) as mobile phase, the current phase solubility samples, Hedera 5 - C8 (4.6 x 250mm, 5 muon m) column (jiangsu chamberlain overseas technology) 235nm detection separation,. Results: the linear range for 26.24 ng 2099.2 ng (r = was 0.9999, n = 9), and the average recovery was 96.82%, RSD = 1.57% (n = 9). Conclusion: this method melamine milk powder in the content, the results are stable good reproducibility, the maneuverability is strong, applicable to commercial melamine qualitative and quantitative detection.Key words: Melamine; Milk powder; HPLC目录1 实验1.1 仪器和试药 1.1.1 仪器 1.1.2 试药1.2 色谱条件1.3 对照品溶液的配制1.4 供试品溶液的制备2 结果与讨论2.1 线性和定量限2.2 精密度考察2.3 重复性考察2.4 加样回收考察2.5 样品测定2.6 讨论 2.6.1 波长选择 2.6.2 流动相选择 2.6.3 样品提取溶剂选择 2.6.4 样品提取时间选择 2.6.5 样品提取方法选择 2.6.6 与国标法的比较3 参考文献1 实验 1.1 仪器和试药 1.1.1 仪器 高效液相色谱仪 LC310 包括 LC-P100高压恒流泵，LC-UV100紫外检测器，LC-C0100柱温箱， LC-WS310液相色谱工作站，均为江苏天瑞信息技术有限公司产品，电子天平（赛多利斯），超声波清洗器（张家港神科超声），紫外分光光度计（上海精密），精密酸度计（上海精科），超纯水机（南京易普易达）。 1.1.2 试药 磷酸二氢钾、磷酸、硫酸铵、柠檬酸、醋酸、醋酸铵，氨水，三氯乙酸，均为分析纯；辛烷磺酸钠、庚烷磺酸钠，均为色谱纯；甲醇、乙腈（色谱纯，美国 Tedia 公司）；水（超纯水，自制）。三聚氰胺对照品从上海安谱公司购买，供含量测定用。奶粉市场购买各品牌。三氯乙酸溶液（1）：准确称取 10 g三氯乙酸于 1L容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，混匀。氨化甲醇溶液（5）：准确量取5 mL氨水和 95mL甲醇，混匀后备用。阳离子交换固相萃取柱：混合型阳离子交换固相萃取柱，基质为苯磺酸化的聚苯乙烯-二乙烯基苯高聚物，60mg，3mL。使用前依次用 3mL甲醇、5 mL水活化。后备用。1.2 色谱条件色谱柱Hedera 5-C8（4.6250mm，5m）(江苏汉邦科技)；流动相：甲醇 0.02mol/L硫酸铵（体积比 4：96）（使用前用孔径为 0.45m的微孔滤膜滤过），流速： 0.4 ml/min，检测波长：235nm，柱温：26， 进样量：10L。在此色谱条件下按三聚氰胺的峰计算均在4000以上，且能到达基线分离。 1.3对照品溶液的配制 精密称取三聚氰胺对照品32.8mg，置50ml棕色容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，得三聚氰胺对照品储备液。精密吸取对照品储备液2ml于50ml棕色容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得三聚氰胺对照品溶液（每1ml中含三聚氰胺 26.24g）。 1.4供试品溶液的制备 精密称取奶粉样品2g，精确到0.0001g于50ml具塞塑料离心管中，加入15mL三氯乙酸（1%）溶液和5mL乙腈，超声提取10min，再振荡提取10min后，以不低于 4000r/min离心 10min。上清液经三氯乙酸溶液润湿的滤纸过滤后，用三氯乙酸溶液定容至25mL，移取5mL滤液，加入5mL水混匀后做待净化液。 将待净化液转移至固相萃取柱中。依次用3mL水和3mL甲醇洗涤，抽至近干后 ，用6mL氨化甲醇溶液洗脱。整个固相萃取过程流速不超过1mL/min。洗脱液于50下用氮气吹干，残留物（相当于 0.4g样品）用1mL流动相定容，涡旋混合 1min，过微孔滤膜后，供 HPLC测定。分别吸取对照品溶液（图1），供试品溶液（图2）10l进样测定，色谱图如下： 图1：三聚氰胺对照品溶液图2：奶粉样品溶液天津渤海职业技术学院图1：三聚氰胺图2：奶粉样品溶液2结果与讨论 2.1线性和定量限 配制三聚氰胺质量浓度为2.624g/ml、7.872g/ml、13.120g/ml、18.368g/ml、 26.240g/ml、52.480g/ml、131.200g/ml、157.400g/ml、209.920g/ml的系列标准品溶液，按照1.2中色谱条件进样检测，分别进样10L，以浓度X（ng）为横坐标，峰面积Y为纵坐标，得回归方程为：Y=311.28X 1235.40， r=0.9999，线性范围为：26.24ng 2099.2ng，标准品质量浓度与峰面积值具有良好的线性关系。 将标准品溶液稀释进样，以性噪比为 10（S/N=10）计算，三聚氰胺的最低检出浓度为 0.20992g/ml,按1.4中样品处理方法，奶粉中三聚氰胺最低检出限为2.0992ng。 2.2精密度考察 精密吸取上述C=26.24g/ml的对照品溶液10L，连续进样6次，测得其RSD=0.66%，表明精密度良好。 2.3重复性考察 取同一样品6份，分别按1.4项下方法处理测定，得其含量的RSD=0.51%。 2.4加样回收考察 精密称取已经含量的供试品1g共9份，精确到0.0001g于50ml具塞塑料离心管中，分为3组，每组3份，第一组加入三聚氰胺2mg，第二组加入三聚氰胺5mg，第三组加入三聚氰胺10mg，按1.4项下方法处理，分别取10L进样测定。计算其平均回收率为：96.82%，RSD=1.57%（n=9）。 2.5样品测定 选取不同厂家的奶粉分别按国标法和上述测定方法测定三聚氰胺的含量，结果见表1，结果表明：该方法测定结果稳定，重现性好。 表1 样品测定结果（mg/kg） 品名国标法本法雅士利27.8628.02三 鹿1295.251279.46雅 培未检出未检出贝因美未检出未检出伊利2.462.51 多美滋未检出未检出2.6 讨论 2.6.1波长选择 取三聚氰胺对照品溶液，在 190nm 400nm范围内进行波长扫描，得到光谱扫描图，结果显示在 235nm处有最大吸收，三聚氰胺也能到达基线分离，因此选择 235nm作为检测波长。 2.6.2流动相选择 除国标方法1用1%氢氧化钠溶液调流动相PH=3以外，考察了乙腈-庚烷磺酸钠缓冲液2 ，甲醇-0.02mol/l硫酸铵3 ，乙腈-辛烷磺酸铵缓冲液4 （柠檬酸调PH=3.0）, 10.0mmolL的庚烷磺酸钠（HCl调PH3.0）-乙腈5，0.05molL磷酸二氢钾溶液(磷酸调 pH值至3O)-乙腈7，10mmol/L醋酸钠溶液(醋酸调pH=3)-乙腈9等系统，最后选择甲醇 -0.02mol/l硫酸铵（4：96），对流动相比例、柱温、流速进行反复的筛选，最后确定了本法的色谱条件。在该色谱条件下测定，得到良好的峰形，适当的保留时间，较高的理论板数，均符合国标检测要求。 2.6.3样品提取溶剂选择 在相同条件下，考察了2.6.2中各流动相、1%三氯乙酸+乙腈1、甲醇6、乙腈7、50%乙腈8作为提取溶剂的情况，结果表明：1%三氯乙酸+乙腈的提取率最高，杂质最少，因此选择国标方法中提取溶剂为提取溶剂。 2.6.4样品提取时间选择 在相同条件下，考察样品进行2min、5min、10min、15min、20min超声的情况，结果表明，样品在超声10min时提取率最高，15min和20min时均无明显的提高，因此选择超声10min作为样品的提取时间。 2.6.5样品提取方法选择 在相同条件下，考察样品分别考察先超声10min再振摇10min、直接超声20min和直接振摇20min的样品提取情况，结果先超声10min再振摇10min提取效率最高，故选择先超声10min再振摇10min作为提取方法。 2.6.6与国标法的比较通过大量的实验数据表明，使用国标法测定三聚氰胺时，存在以下情况：1）仪器系统平衡时间较长，基线漂移较大，是因为乙腈和离子对试剂不易混合均匀，容易产生气泡；2）每次配制离子对缓冲液时要调节PH值，操作复杂；3）离子对试剂价格昂贵，成本费用较高。本文提出的HPLC法，有以下优点：1）仪器系统平衡时间短；2）流动相配置简捷，成本低；3）本方法的检测限为0.5mg/kg，高于国标方法。本法测定奶粉中三聚氰胺的含量，简便、快速、准确、灵敏度高、适用性好、回收率高，适合奶制品行业的质量控制。 3 参考文献 1GB/T22388-2008原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法M,中国标准出版社出版。 2NY/T1372-2007饲料中三聚氰胺的测定M，中国标准出版社出版。 3汪辉,曹小彦，彭新凯，等.高效液相色谱-二极管阵列法测定高蛋白食品中的三聚氰胺 J，食品与机械，2007，23(5):1114-115，124. 4倪沁颜.高效液相色谱法(HPLC)测定饲料中三聚氰胺的含量J，福建分析测试,2008,17(1)：57-59. 5赵永彪，李自春，刘婷，等.高效液相色谱法测定宠物食品中的三聚氰胺J，分析试验室,2008,27增刊