千年基因外显子组测序应用手册.pdf

外显子组研究 千年基因 MACROGEN M c o en A Macrogen Europe Macrogen Asia TGACGTAA CTGACAAT TTGGCCAT GACGTAAT GGCACCTG ACTGACAA TTTGGCCA TGACGTAA TGGCACCT GACTGACA ATTTGGCC ATGACGTA ATGGCACC TGACTGAC AATTTGGC CATGACGT AATGGCAC CTGACTGA CAATTTGG CCATGACG TAATGGCA CCTGACTG ACAATTTG GCCATGAC GTAATGGC ACCTGACT GACAATTT GGCCATGA CGTAATGG CACCTGAC TGACAATT TGGCCATG ACGTAATG GCACCTGA CTGACAAT TTGGCCAT GACGTAAT GGCACCTG ACTGACAA TTTGGCCA TGACGTAA CTGACAAT TTGGCCAT GACGTAAT GGCACCTG ACTGACAA TTTGGCCA TGACGTAA CTGACAAT TTGGCCAT GACGTAAT GGCACCTG ACTGACAA TTTGGCCA TGACGTAA CTGACAAT TTGGCCAT GACGTAAT GGCACCTG ACTGACAA TTTGGCCA 01 卷 首 语 高通量测序的数据质量是信息分析和实验验证的基础 其准确性将直接影响实 验结果的可靠性 项目的完成时间及科研成果的及时发布 不可靠的实验结果可能 导致文章发表时无法通过审核或更严重者出现退稿现象 这将对研究人员的学术声 誉及后期基金项目的申请造成不利的影响 低质量的测序数据将严重影响后期的信息分析 在基因组组装中 低质量的测 序数据会导致组装结果太短 组装的准确性太低 从而无法得到全长 准确的基因 组信息 错误的组装信息在后期实验中无法得到验证 并影响后续的功能基因挖掘 及遗传育种分析 在重测序及外显子组测序中 错误的碱基会引起很大的假阳性变 异 一则导致项目的可用数据减少 二则形成大量的噪声数据 候选的变异位点过 多 无法得到明确的实验结论并大幅增加实验验证及功能研究的工作量 假阴性的 检测结果将导致有价值的相关变异信息的遗漏 因此无法达到实验目的 在转录组 测序中 低质量的数据会造成组装的准确度降低 从而引起基因上的假阳性变异 并形成较多假阳性的新转录本 最终导致不能得到明确的研究结论 为保证测序结果的准确性 千年基因始终坚持以最高的质量服务于研究人员 其质量优势源于上市公司的信誉 丰富的项目经验及Illumina的官方认证 我们郑重承诺 严格使用Illumina原厂测序试剂 信息分析的参数可向合作伙伴公开 随时接受监督和验证 如因千年基因的责任导致项目失败 将免费为合作伙伴重做或全额退款 千年基因 TGACGTAA CTGACAAT TTGGCCAT GACGTAAT GGCACCTG ACTGACAA TTTGGCCA TGACGTAA TGGCACCT GACTGACA ATTTGGCC ATGACGTA ATGGCACC TGACTGAC AATTTGGC CATGACGT AATGGCAC CTGACTGA CAATTTGG CCATGACG TAATGGCA CCTGACTG ACAATTTG GCCATGAC GTAATGGC ACCTGACT GACAATTT GGCCATGA CGTAATGG CACCTGAC TGACAATT TGGCCATG ACGTAATG GCACCTGA CTGACAAT TTGGCCAT GACGTAAT GGCACCTG ACTGACAA TTTGGCCA TGACGTAA CTGACAAT TTGGCCAT GACGTAAT GGCACCTG ACTGACAA TTTGGCCA TGACGTAA CTGACAAT TTGGCCAT GACGTAAT GGCACCTG ACTGACAA TTTGGCCA TGACGTAA CTGACAAT TTGGCCAT GACGTAAT GGCACCTG ACTGACAA TTTGGCCA 02 关于千年基因 Macrogen 集团由首尔大学于1997年成立 总部位于韩国首尔 是世界领先的生 物技术研发与应用企业 目前已在中国 美国 日本 欧洲等成立了多家分部 并 与来自全球一百多个国家的万余家科研单位保持着长期的合作 2000年 Macrogen 成为首家在韩国创业板 Kosdaq 上市的生物医药企业 2011年 Macrogen成功跻 身于全球新能源企业500强 Macrogen中国分部千年基因于2009年在深圳成立 主要致力于为研究人员提供 全球最高质量的高通量测序 生物信息分析及相关技术支持 目前已与国内近百家 科研单位建立了广泛合作 Phone 86 0 755 2306 7982 Email info Website MACROGEN M c o en A Macrogen Europe Macrogen Asia TGACGTAA CTGACAAT TTGGCCAT GACGTAAT GGCACCTG ACTGACAA TTTGGCCA TGACGTAA TGGCACCT GACTGACA ATTTGGCC ATGACGTA ATGGCACC TGACTGAC AATTTGGC CATGACGT AATGGCAC CTGACTGA CAATTTGG CCATGACG TAATGGCA CCTGACTG ACAATTTG GCCATGAC GTAATGGC ACCTGACT GACAATTT GGCCATGA CGTAATGG CACCTGAC TGACAATT TGGCCATG ACGTAATG GCACCTGA CTGACAAT TTGGCCAT GACGTAAT GGCACCTG ACTGACAA TTTGGCCA TGACGTAA CTGACAAT TTGGCCAT GACGTAAT GGCACCTG ACTGACAA TTTGGCCA TGACGTAA CTGACAAT TTGGCCAT GACGTAAT GGCACCTG ACTGACAA TTTGGCCA TGACGTAA CTGACAAT TTGGCCAT GACGTAAT GGCACCTG ACTGACAA TTTGGCCA 03 千年基因的测序质量为何最高 1 17年上市公司的信誉 Macrogen于1997年成立 2000年上市 完善的上市公司管理模式下所有实验流程和项目 周期均受董事会严格监管 公司信誉深受全球万余家合作单位的长期信赖 2 丰富的项目经验 Macrogen研究院已在Nature Nature Genetics Genome Research等高影响力杂志发表了 大量文章 近年来平均每月完成近万份外显子组样本的测序及分析 丰富的项目经验是合作 伙伴实验成功的保障 3 Illumina官方认证 Macrogen是亚太地区唯一一家通过Illumina Genome Network认证并签署Illumina CSPro协 议的测序服务机构 Illumina Genome Network是Illumina在全球的最高认证 承诺提供最高的测序质量 因此 是研究人员选择测序服务的最佳保证 Illumina Genome Network对其成员的测序质量 项目 经验及周期均有非常严格的审核标准 目前全球仅有Macrogen 加拿大迈克 史密斯基因组 科学中心 BCGSC 和国际基因组源中心 NCGR 三个机构通过认证 代表Illumina全球最 高的测序质量 Genome Network的详细介绍请见附录二 Illumina CSPro是Illumina与测序仪订购单位签订的基本认证 是测序服务商真正拥有 Illumina测序平台的有力证明 一般来说 凡直接购买Illumina测序仪的服务商均可与之签署 Illumina CSPro协议 千年基因 TGACGTAA CTGACAAT TTGGCCAT GACGTAAT GGCACCTG ACTGACAA TTTGGCCA TGACGTAA TGGCACCT GACTGACA ATTTGGCC ATGACGTA ATGGCACC TGACTGAC AATTTGGC CATGACGT AATGGCAC CTGACTGA CAATTTGG CCATGACG TAATGGCA CCTGACTG ACAATTTG GCCATGAC GTAATGGC ACCTGACT GACAATTT GGCCATGA CGTAATGG CACCTGAC TGACAATT TGGCCATG ACGTAATG GCACCTGA CTGACAAT TTGGCCAT GACGTAAT GGCACCTG ACTGACAA TTTGGCCA TGACGTAA CTGACAAT TTGGCCAT GACGTAAT GGCACCTG ACTGACAA TTTGGCCA TGACGTAA CTGACAAT TTGGCCAT GACGTAAT GGCACCTG ACTGACAA TTTGGCCA TGACGTAA CTGACAAT TTGGCCAT GACGTAAT GGCACCTG ACTGACAA TTTGGCCA 04 千年基因的测序质量高在哪里 1 最高的碱基质量 碱基质量值是衡量测序质量的重要指标 质量值 Q 越高代表碱基被测错的概率 P 越小 其计算公式为Q 10 lgP 其中 Q20和Q30分别代表碱基被测错的概率为1 和1 对于HiSeq 2000平台 千年基因平均99 碱基准确度达到Q20 可保证大于85 碱 基准确度达到Q30 2 最高的测序覆盖率 覆盖率是指被测到的碱基占总的待测序区域的比率 覆盖率随数据量升高而提高 在相同的数据量下 覆盖率主要受测序试剂 实验操作和GC bias等因素影响 高覆盖率 是评价基因组组装完整性的重要依据 同时也为变异检测的准确性提供数据基础 千年 基因严格使用Illumina原厂试剂 在相同的数据量下可提供最高的测序覆盖率 3 最高的测序均一性 覆盖深度是指总测序量与待测目标区域大小的比值 由于测序试剂 实验操作和GC bias等因素影响 所有待测区域的覆盖深度并不完全一致 即测序的不均一性 变异检 测时单条read检测出的变异信息很可能由测序错误导致 可靠性较低 因此通常选取覆 盖深度大于10 的reads进行分析 目前已发表的外显子组文章中约80 90 的外显子区 域覆盖度达到10 以上 千年基因严格使用Illumina原厂试剂 约90 的外显子区域覆盖 度达到10 以上 保证最高的测序均一性 4 最小的文库方差 较大的文库方差将导致PE测序产生的一对reads间距离误差较大 信息分析软件很可 能将它们误认为是两条独立的read 这将影响组装结果的准确性和变异分析结果的可靠 性 千年基因严格控制建库流程 可保证最小的文库方差 MACROGEN M c o en A Macrogen Europe Macrogen Asia TGACGTAA CTGACAAT TTGGCCAT GACGTAAT GGCACCTG ACTGACAA TTTGGCCA TGACGTAA TGGCACCT GACTGACA ATTTGGCC ATGACGTA ATGGCACC TGACTGAC AATTTGGC CATGACGT AATGGCAC CTGACTGA CAATTTGG CCATGACG TAATGGCA CCTGACTG ACAATTTG GCCATGAC GTAATGGC ACCTGACT GACAATTT GGCCATGA CGTAATGG CACCTGAC TGACAATT TGGCCATG ACGTAATG GCACCTGA CTGACAAT TTGGCCAT GACGTAAT GGCACCTG ACTGACAA TTTGGCCA TGACGTAA CTGACAAT TTGGCCAT GACGTAAT GGCACCTG ACTGACAA TTTGGCCA TGACGTAA CTGACAAT TTGGCCAT GACGTAAT GGCACCTG ACTGACAA TTTGGCCA TGACGTAA CTGACAAT TTGGCCAT GACGTAAT GGCACCTG ACTGACAA TTTGGCCA 05 5 最低的duplicate rate 文库制备或外显子捕获过程会因PCR扩增引入完全一致的DNA片段 即测序结果中 的duplicate reads duplicate reads的比率将影响测序深度的统计和变异的可靠性分析 千年基因严格控制实验流程 可获得最低的duplicate reads比例 平均clean data占raw data 约90 以上 相同的测序数据量下可获得最高的有效数据量 科研成果举例 Macrogen研究院主要致力于医药学基因组研究 并在此领域取得了大量科研成果 2000年 完成了韩国人基因组指纹图谱的构建 2004年 基因工程鼠的研究结果发表于Nature 2005年 运动发酵单胞菌基因组项目成果发表于Nature 2009年 第一个韩国人基因组图谱以其高度注释的结果发表于Nature 2010年 亚洲人基因组CNV的研究结果发表于Nature Genetics 2011年 人类基因组和转录组多样性的研究发表于Nature Genetics 2011年 肺癌相关的基因融合研究发表于Genome Research 2012年 肺癌的深入研究结果发表于Genome Research 合作伙伴举例 千年基因在国内已与中国科学院 中国农业科学院 中国热带农业科学院 中国林 业科学研究院 中国医学科学院 山东省农业科学院 山东省海洋水产研究所 广东省 农业科学院 广东省生态环境与土壤研究所 辽宁省农业科学院 福建省亚热带植物研 究所 上海市农业科学院 北京大学 清华大学 北京师范大学 中国农业大学 中国 科学技术大学 上海交通大学 复旦大学 同济大学 中山大学 华南理工大学 华南 师范大学 汕头大学 西安交通大学 华中农业大学 山东农业大学 云南农业大学 浙江海洋学院 湖南师范大学 北京协和医院 广东省人民医院 中山眼科中心 南方 医科大学 广东药学院 四川省人民医院 华西医院 第三军医大学 新华医院 胸科 医院 中山医院 湘雅医院 武汉同济医院 国家计生委科学技术研究所 汕头国际眼 科中心 香港大学 香港中文大学 香港科技大学等单位建立了广泛的合作 测序质量 得到了合作伙伴的高度认可和一致好评 千年基因 TGACGTAA CTGACAAT TTGGCCAT GACGTAAT GGCACCTG ACTGACAA TTTGGCCA TGACGTAA TGGCACCT GACTGACA ATTTGGCC ATGACGTA ATGGCACC TGACTGAC AATTTGGC CATGACGT AATGGCAC CTGACTGA CAATTTGG CCATGACG TAATGGCA CCTGACTG ACAATTTG GCCATGAC GTAATGGC ACCTGACT GACAATTT GGCCATGA CGTAATGG CACCTGAC TGACAATT TGGCCATG ACGTAATG GCACCTGA CTGACAAT TTGGCCAT GACGTAAT GGCACCTG ACTGACAA TTTGGCCA TGACGTAA CTGACAAT TTGGCCAT GACGTAAT GGCACCTG ACTGACAA TTTGGCCA TGACGTAA CTGACAAT TTGGCCAT GACGTAAT GGCACCTG ACTGACAA TTTGGCCA TGACGTAA CTGACAAT TTGGCCAT GACGTAAT GGCACCTG ACTGACAA TTTGGCCA 06 来自上海新华医院 外显子组测序结果已通过实验验证完毕 SNP的准确率达到100 非常满意 来自清华大学 我的样本之前做了转基因 你们的测序和分析结果正好和我们之前用传统测序预估 的结果完全吻合 可以直接用于写文章了 来自广东省农科院 一般情况下只能用clean data进行转录组组装 而你们的raw data就可以直接进行组 装 且组装结果非常好 可见你们的数据质量和可用数据量非常高 来自中国医学科学院 你们的效率太高了 不到一个月就完成了所有的外显子组测序和分析 非常及时 来自华西医院 很放心把项目交给你们 因为各方面的问题都能帮我们想到 同时也非常感谢你们 对所有问题的详细解答 让我们感到你们对待每一位客户的重视和诚意 来自中国科学院 你们的敬业态度让我印象深刻 期望下次的合作 MACROGEN M c o en A Macrogen Europe Macrogen Asia TGACGTAA CTGACAAT TTGGCCAT GACGTAAT GGCACCTG ACTGACAA TTTGGCCA TGACGTAA TGGCACCT GACTGACA ATTTGGCC ATGACGTA ATGGCACC TGACTGAC AATTTGGC CATGACGT AATGGCAC CTGACTGA CAATTTGG CCATGACG TAATGGCA CCTGACTG ACAATTTG GCCATGAC GTAATGGC ACCTGACT GACAATTT GGCCATGA CGTAATGG CACCTGAC TGACAATT TGGCCATG ACGTAATG GCACCTGA CTGACAAT TTGGCCAT GACGTAAT GGCACCTG ACTGACAA TTTGGCCA TGACGTAA CTGACAAT TTGGCCAT GACGTAAT GGCACCTG ACTGACAA TTTGGCCA TGACGTAA CTGACAAT TTGGCCAT GACGTAAT GGCACCTG ACTGACAA TTTGGCCA TGACGTAA CTGACAAT TTGGCCAT GACGTAAT GGCACCTG ACTGACAA TTTGGCCA 07 外显子组测序 技术简介 08 技术优势 08 应用举例 09 方案设计 10 捕获平台 12 项目流程 13 案例解析 21 Macrogen参与发表文章举例 25 附录一 26 附录二 27 千年基因 TGACGTAA CTGACAAT TTGGCCAT GACGTAAT GGCACCTG ACTGACAA TTTGGCCA TGACGTAA TGGCACCT GACTGACA ATTTGGCC ATGACGTA ATGGCACC TGACTGAC AATTTGGC CATGACGT AATGGCAC CTGACTGA CAATTTGG CCATGACG TAATGGCA CCTGACTG ACAATTTG GCCATGAC GTAATGGC ACCTGACT GACAATTT GGCCATGA CGTAATGG CACCTGAC TGACAATT TGGCCATG ACGTAATG GCACCTGA CTGACAAT TTGGCCAT GACGTAAT GGCACCTG ACTGACAA TTTGGCCA TGACGTAA CTGACAAT TTGGCCAT GACGTAAT GGCACCTG ACTGACAA TTTGGCCA TGACGTAA CTGACAAT TTGGCCAT GACGTAAT GGCACCTG ACTGACAA TTTGGCCA TGACGTAA CTGACAAT TTGGCCAT GACGTAAT GGCACCTG ACTGACAA TTTGGCCA 08 技术简介 随着社会生活水平的提高 人类健康问题也越来越多地受到社会各界的关注 传统 的遗传疾病研究模式是采用显带分析 核型分析 FISH 遗传标记 PCR DNA测序等传 统实验方法来寻找与疾病相关的DNA变异 这些方法各有各的特点 但都存在效率低 工作量大 分辨率低等一系列的限制 新一代高通量测序技术的出现 为遗传疾病的研 究提供了全新的思路 2009年 基因组定向捕获工具的出现使外显子组测序成为可能 2009年9月 第一篇 关于外显子组测序的原理验证文章于Nature杂志发表 来自华盛顿大学的Jay Shendure通 过对四名Freeman Sheldon综合征患者的外显子组测序 找到已知的致病基因MYH3 随 后 该团队将这种技术应用于米勒综合征的研究 通过对患者编码区序列的捕获及深度 测序 鉴定出单个候选基因DHODH 并经Sanger测序验证其他患者中也存在该基因的突 变 外显子组的序列仅占全基因组序列的1 左右 但大多数与疾病相关的变异位于外显 子区 通过外显子组测序可鉴定约8万个变异 全基因组测序可鉴定300万个变异 因此 与全基因组测序相比 外显子组测序不仅费用较低 数据阐释也更为简单 外显子组测 序技术以其经济有效的优势广泛应用于孟德尔遗传病 罕见综合征及复杂疾病的研究 并于2010年被Science杂志评为十大突破之一 近两年外显子组研究相关的SCI文章已发表 千余篇 已对数百种疾病展开了深入研究 研究结果推动了人类医学的研究 技术优势 直接对蛋白编码序列进行测序 找出影响蛋白结构的变异 高深度测序 可发现常见变异及频率低于1 的罕见变异 针对外显子组区域测序 约占基因组的1 有效降低费用 周期 工作量 MACROGEN M c on A Macrogen Europe Macrogen Asia TGACGTAA CTGACAAT TTGGCCAT GACGTAAT GGCACCTG ACTGACAA TTTGGCCA TGACGTAA TGGCACCT GACTGACA ATTTGGCC ATGACGTA ATGGCACC TGACTGAC AATTTGGC CATGACGT AATGGCAC CTGACTGA CAATTTGG CCATGACG TAATGGCA CCTGACTG ACAATTTG GCCATGAC GTAATGGC ACCTGACT GACAATTT GGCCATGA CGTAATGG CACCTGAC TGACAATT TGGCCATG ACGTAATG GCACCTGA CTGACAAT TTGGCCAT GACGTAAT GGCACCTG ACTGACAA TTTGGCCA TGACGTAA CTGACAAT TTGGCCAT GACGTAAT GGCACCTG ACTGACAA TTTGGCCA TGACGTAA CTGACAAT TTGGCCAT GACGTAAT GGCACCTG ACTGACAA TTTGGCCA TGACGTAA CTGACAAT TTGGCCAT GACGTAAT GGCACCTG ACTGACAA TTTGGCCA 09 应用举例 疾病 遗传模式 致病基因 Freeman Sheldon 综合征 AD MYH3 Kabuki 综合征 AD MLL2 Schinzel Giedion 综合征 AR SETBP1 Sensenbrenner 综合征 AR WDR35 Fowler 综合征 AR FLVCR2 Perrault 综合征 AR HSD17B4 Hajdu Cheney 综合征 AD NOTCH2 成骨不全 AR SERPINF1 米勒综合征 AR DHODH Brown Vialetto van Laere 综合征 AR C20orf54 血磷酸脂酶过多智力迟钝综合征 AR PIGV 家族性 脂蛋白过少血症 AD ANGPTL3 色素性视网膜炎 AR DHDDS 非综合征性耳聋 AR GPSM2 原发性淋巴管性水肿 AD GJC2 肌萎缩性侧索硬化 AD VCP 非综合征的智力迟钝 AR TECR Van Den Ende Gupta 综合征 AR SCARF2 自身免疫性淋巴组织增生症 ALPS AR FADD 小脑共济失调 AD TGM6 逆向性痤疮 AD NCSTN 千年基因 TGACGTAA CTGACAAT TTGGCCAT GACGTAAT GGCACCTG ACTGACAA TTTGGCCA TGACGTAA TGGCACCT GACTGACA ATTTGGCC ATGACGTA ATGGCACC TGACTGAC AATTTGGC CATGACGT AATGGCAC CTGACTGA CAATTTGG CCATGACG TAATGGCA CCTGACTG ACAATTTG GCCATGAC GTAATGGC ACCTGACT GACAATTT GGCCATGA CGTAATGG CACCTGAC TGACAATT TGGCCATG ACGTAATG GCACCTGA CTGACAAT TTGGCCAT GACGTAAT GGCACCTG ACTGACAA TTTGGCCA TGACGTAA CTGACAAT TTGGCCAT GACGTAAT GGCACCTG ACTGACAA TTTGGCCA TGACGTAA CTGACAAT TTGGCCAT GACGTAAT GGCACCTG ACTGACAA TTTGGCCA TGACGTAA CTGACAAT TTGGCCAT GACGTAAT GGCACCTG ACTGACAA TTTGGCCA 10 方案设计 相比传统测序 外显子组测序能够迅速的获得所有外显子区域的遗传信息 在大幅 提升效率的同时显著降低了研究成本 相比全基因组测序 外显子组测序能够在缩短实 验周期 减少数据分析量及实验投入的基础上有针对性的得到大部分全基因组测序所能 得到的信息 基于外显子组测序良好的性价比 该方法目前在国际上已经被广泛应用于 遗传病和癌症研究 1 单基因疾病研究方案 首先需要按照疾病表型对家系成员进行严格筛查 明确其患病情况并进行该疾病研 究的背景调查 在找出该疾病已经有一些研究背景和相关的致病基因报道 可通过传统 PCR测序方法对已知的疾病相关变异进行验证和初筛 确认所研究的样本中未发现相关 的基因变异 那么可挑选一个或数个相同疾病家系的核心成员成员进行外显子组测序 每个家系中的患病个体选取3 5个样本 正常个体选取1 2名作为对照进行研究 按照疾 病模型 AD AR等 及样品的家系信息对测序得到的结果进行分析 以缩小候选变异的 范围 经过多种注释 筛选后过滤掉对功能无影响的变异及公共数据库中的常见变异 再使用传统PCR测序进行样本扩大化验证及相关的功能研究 最终确定疾病相关变异 单基因遗传病研究举例 a 家系图 b 分析思路 隐性纯合突变致病 两个患者共享相同的纯合突变 父母为杂合携带者 复合杂合突变致病 两个患者具有相同的突变 即在一个基因内有两个不同的杂合变异 而父母分别为这两个杂合突变的携带者 显性模式 新生突变 找两个患者共有的杂合突变 而父母不带有该突变 MACROGEN M c o en A Macrogen Europe Macrogen Asia TGACGTAA CTGACAAT TTGGCCAT GACGTAAT GGCACCTG ACTGACAA TTTGGCCA TGACGTAA TGGCACCT GACTGACA ATTTGGCC ATGACGTA ATGGCACC TGACTGAC AATTTGGC CATGACGT AATGGCAC CTGACTGA CAATTTGG CCATGACG TAATGGCA CCTGACTG ACAATTTG GCCATGAC GTAATGGC ACCTGACT GACAATTT GGCCATGA CGTAATGG CACCTGAC TGACAATT TGGCCATG ACGTAATG GCACCTGA CTGACAAT TTGGCCAT GACGTAAT GGCACCTG ACTGACAA TTTGGCCA TGACGTAA CTGACAAT TTGGCCAT GACGTAAT GGCACCTG ACTGACAA TTTGGCCA TGACGTAA CTGACAAT TTGGCCAT GACGTAAT GGCACCTG ACTGACAA TTTGGCCA TGACGTAA CTGACAAT TTGGCCAT GACGTAAT GGCACCTG ACTGACAA TTTGGCCA 11 c 分析结果示意 若样本为散发样本 由于样本间没有血缘关系 遗传背景相差较大 测序得到的结 果也较难分析 为了更为准确地得到有价值的结果 使用散发样本进行外显子组测序要 求的样本数目比家系样本要多一些 一般建议至少做30个患病个体样本以上的平行测序 分析 对大量患病个体的测序数据进行多样本分析 从而确定候选疾病相关变异 再用 传统PCR测序在其他的相同疾病患病个体和正常人群中做进一步验证 2 复杂疾病及癌症的研究方案 对于复杂疾病 首先应该选择具有遗传性较高的病例作为研究对象 一般需要满足 以下几个特点 a 与疾病相关 b 高度遗传 c 在患者中表现较早 表型一致 高外显 率 d 疾病的发病机制相似 整体的研究思路一般是通过适量样本的外显子测序 患病 和健康个体各50例 找到与疾病高度关联的低频突变 然后根据这一结果订制合适的芯 片 在大样本里进行大规模验证 从而获得精确度更高的疾病相关变异位点 接着可以 针对这些位点进行生物学功能研究 从而得到有意义的结果 开发出疾病诊断及治疗的 相关产品等 选取遗传性 较高的样本 case control 外显子测序 多样本分析 筛选相关性 较高的低频 变异 设计芯片进 行大规模样 品的验证 生物学功能 研究 变异总数 112 491 剩余 27 845 剩余 14 061 剩余 842 结果 隐形纯合 2 复合杂合 2 新生突变 21 外显子区域筛 选 非同义变异筛 选 疾病模式筛选数据库过滤 千年基因 TGACGTAA CTGACAAT TTGGCCAT GACGTAAT GGCACCTG ACTGACAA TTTGGCCA TGACGTAA TGGCACCT GACTGACA ATTTGGCC ATGACGTA ATGGCACC TGACTGAC AATTTGGC CATGACGT AATGGCAC CTGACTGA CAATTTGG CCATGACG TAATGGCA CCTGACTG ACAATTTG GCCATGAC GTAATGGC ACCTGACT GACAATTT GGCCATGA CGTAATGG CACCTGAC TGACAATT TGGCCATG ACGTAATG GCACCTGA CTGACAAT TTGGCCAT GACGTAAT GGCACCTG ACTGACAA TTTGGCCA TGACGTAA CTGACAAT TTGGCCAT GACGTAAT GGCACCTG ACTGACAA TTTGGCCA TGACGTAA CTGACAAT TTGGCCAT GACGTAAT GGCACCTG ACTGACAA TTTGGCCA TGACGTAA CTGACAAT TTGGCCAT GACGTAAT GGCACCTG ACTGACAA TTTGGCCA 12 在各种环境因素的作用下 机体某些体细胞染色体上发生的变异破坏或改变了某些 重要的生物学过程 体细胞可能会因此异常增生而转变为肿瘤细胞 由于肿瘤细胞具有 异质性 同一块肿瘤组织里可能含有不同时期的肿瘤细胞以及正常体细胞 因此它的基 因变异情况相对其遗传疾病来说更为复杂 对于肿瘤组织的外显子组测序研究 其最关 键的步骤在于样本的选取 目前最常见的情况是分别取同一癌症患者的癌组织和癌旁组 织进行比较 样本数目建议至少20对以上 测序后成对的样本进行分析后再进行不同病 人间的多样本分析 以此来发掘肿瘤相关的基因变异 由于肿瘤产生的原因包括基因突 变 基因表达水平变异 表观遗传变异等多个方面 在利用NGS研究肿瘤的时候 通常 会使用多种实验方法相结合的方法 例如转录组测序 全基因组测序 甲基化测序等 相互进行印证 多数据整合分析可以进一步的提高数据的可靠性 捕获平台 千年基因可提供目前主流的捕获平台 各平台的特点如下 捕获平台 Illumina TruSeqExome Enrichment Kit Roche SeqCap EZ Human Exome Library Agilent SureSelect Human All Exon 捕获量62M64M51M 捕获区域 外显子及旁翼区 部 分UTR及miRNA 外显子区及miRNA外显子区 探针95 mer DNA90 105 mer DNA120 mer RNA 探针数量340 4272 100 000655 872 对常用数据库的覆盖 率 97 2 CCDS 96 4 RefSeq 93 2 Gencode 77 6 miRBase 99 8 CCDS 98 4 RefSeq 96 7 Gencode 98 67 miRBase 1 22 of human genomic regions 700 human miRNAs 300 additional human non coding RNAs MACROGEN M c o en A Macrogen Europe Macrogen Asia TGACGTAA CTGACAAT TTGGCCAT GACGTAAT GGCACCTG ACTGACAA TTTGGCCA TGACGTAA TGGCACCT GACTGACA ATTTGGCC ATGACGTA ATGGCACC TGACTGAC AATTTGGC CATGACGT AATGGCAC CTGACTGA CAATTTGG CCATGACG TAATGGCA CCTGACTG ACAATTTG GCCATGAC GTAATGGC ACCTGACT GACAATTT GGCCATGA CGTAATGG CACCTGAC TGACAATT TGGCCATG ACGTAATG GCACCTGA CTGACAAT TTGGCCAT GACGTAAT GGCACCTG ACTGACAA TTTGGCCA TGACGTAA CTGACAAT TTGGCCAT GACGTAAT GGCACCTG ACTGACAA TTTGGCCA TGACGTAA CTGACAAT TTGGCCAT GACGTAAT GGCACCTG ACTGACAA TTTGGCCA TGACGTAA CTGACAAT TTGGCCAT GACGTAAT GGCACCTG ACTGACAA TTTGGCCA 13 项目流程 1 样本检测 Macrogen拥有通过ISO9001 the Macrogen Genomic Medicine Institute Proven Technology Illumina sequencing platforms employ sequencing by synthesis SBS chemistry the most effective widely used proven next generation sequencing chemistry with an unsurpassed 3 200 publications Sequencing whole genomes with SBS chemistry yields the highest quality data providing access to more rare variants with the accuracy and reliability needed to move research forward High Quality Data TruSeq technology is Illumina s latest advancement in next generation sequencing technology delivering the most accurate human genome at any coverage Powering all Illumina sequencing systems TruSeq technology provides the highest yield of error free reads and fewer false negatives and false positives than competing technologies With Illumina sequencing platforms researchers can count on the highest data quality Sequence More Cost Effectively Quickly Illumina has negotiated competitive prices with its Genome Network partners The per genome cost will be at the same level as a similar service that uses less accepted technologies performed by less experienced users In addition the Illumina Genome Network is committed to providing industry leading turnaround times Analysis Assistance Sequencing through the Illumina Genome Network provides more than a virtual instrument Illumina Genome Network partners offer simplified data analysis solutions Customers receive raw data in the most widely adopted formats with access to the broadest selection of commercial and open source analysis tools in the industry Standard analysis is included at no charge with premium data analysis services also available Follow On Study Support The Illumina Genome Network offers researchers an affordable entry point to Illumina next generation sequencing Once a whole genome sequencing project is completed follow on sequencing projects can be performed by Illumina Genome Network or CSPro partners using Illumina SBS based platforms ensuring efficient analysis Illumina Genome Network Delivering whole human genome sequencing services using the industry s most respected sequencing platforms Genome Network Highlights Most Widely Adopted and Published Technology Cited in over 3 200 publications Uncompromising Data Quality Highest sensitivity and specificity Expert Sequencing Service Providers CSPro partners have extensive sequencing and data analysis experience Cost Effective Services with Fast Turnaround Times Committed to providing industry leading turnaround times Simplified Data Analysis Standard analysis included with raw data provided in the most widely adopted formats The Illumina CSPro program is a collaborative service partnership dedicated to ensuring delivery of the highest quality data available for genetic analysis applications Learn more at 附录二 Canada s Michael Smith Genome Sciences Centre BCGSC Data Sheet Genome Network Services Illumina 1 800 809 4566 toll free U S 1 858 202 4566 tel techsupport FOr rESEArCH USE ONlY 2011 2012 Illumina Inc All rights reserved Illumina illuminaDx BaseSpace BeadArray BeadXpress cBot CSPro DASL DesignStudio Eco GAIIx Genetic Energy Genome Analyzer GenomeStudio GoldenGate HiScan HiSeq Infinium iSelect MiSeq Nextera Sentrix SeqMonitor Solexa TruSeq VeraCode the pumpkin orange color and the Genetic Energy streaming bases design are trademarks or 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