02-2012级硕士高级免疫学实验技术-Western.ppt

高级免疫学实验技术2012级硕士研究生 吉林大学白求恩医学院免疫学系 免疫印迹Westernblotting Westernblotting 是一种在固相膜上如硝酸纤维素 NC 膜进行的抗原抗体反应 蛋白质经过电流作用后 可以从胶转移至膜上 再与特异性抗体孵育 洗去游离的抗体 然后和酶标记的二抗孵育 再进行底物显色 由于抗原抗体反应特异性好 亲合力高 Westernblotting检测的灵敏度较高 物品准备 实验步骤 SDS PAGEProteinBlottingImmuno Detection 实验步骤 SDS PAGEProteinBlottingImmuno Detection SDS PAGE实验步骤 组装两块玻璃板 配制分离胶 见后 灌胶 先灌分离胶 胶量大约在梳子下1cm处 缓缓加dH2O封盖 在室温下聚胶30min 倒掉dH2O 且dH2O冲洗 然后用滤纸片将水吸干 加入新配制的浓缩胶 胶量距离上边0 4cm处 倾斜插入梳子 避免产生气泡 然后补齐浓缩胶 室温下聚合30min 装入电泳槽 固定好胶 每个电泳槽放一块胶 倒入电泳缓冲液 平稳拔下梳子 内槽液体量要刚好没过样品孔 外槽的液体量要低于内槽 用电泳缓冲液冲洗样品孔 用微量加样器沿底部加入不同稀释度的变性的样品 30 l well 接通电源 200V 恒压 进行电泳 当溴酚兰跑到距离分离胶上缘3cm时 终止电泳 小心将胶取下 注意不要将胶破坏 准备转膜 Start 胶的配制 制胶注意 丙烯酰胺凝胶用过硫酸铵 Ap 聚合后 TEMED 四甲基乙二胺 加速催化Ap自由基的释放 加速胶的聚合 所以准备工作做好后再加TEMED 注意操作过程中不要混入气泡 否则容易影响电泳时电流的通过 影响蛋白质迁移的速率 用玻璃板制板时夹夹子对称 稍微靠下 以免夹碎玻璃板 胶的配制 灌胶 先灌分离胶 胶量大约在梳子下1cm处 缓缓加dH2O封盖 在室温下聚胶30min SDS PAGE实验步骤 组装两块玻璃板 配制分离胶 见后 灌胶 先灌分离胶 胶量大约在梳子下1cm处 缓缓加dH2O封盖 在室温下聚胶30min 倒掉dH2O 且dH2O冲洗 然后用滤纸片将水吸干 加入新配制的浓缩胶 胶量距离上边0 4cm处 倾斜插入梳子 避免产生气泡 然后补齐浓缩胶 室温下聚合30min 装入电泳槽 固定好胶 每个电泳槽放一块胶 倒入电泳缓冲液 平稳拔下梳子 内槽液体量要刚好没过样品孔 外槽的液体量要低于内槽 用电泳缓冲液冲洗样品孔 用微量加样器沿底部加入不同稀释度的变性的样品 30 l well 接通电源 200V 恒压 进行电泳 当溴酚兰跑到距离分离胶上缘3cm时 终止电泳 小心将胶取下 注意不要将胶破坏 准备转膜 Start 蛋白变性 不同的蛋白带有不同的电荷和分子量 强阴离子去污剂SDS与还原剂 低分子量的硫醇 2 ME DTT 并用 通过加热使蛋白质解离 大量的SDS结合蛋白质 使其带相同密度的负电荷 在聚丙烯酰胺凝胶电泳 PAGE 上 不同蛋白质的迁移率仅取决于分子量 上样缓冲液包括 SDS 负电荷溴酚兰 指示剂甘油 下沉二巯基乙醇 解链使蛋白质成线性Tris HCL 缓冲液 SDS PAGE实验步骤 组装两块玻璃板 配制分离胶 见后 灌胶 先灌分离胶 胶量大约在梳子下1cm处 缓缓加dH2O封盖 在室温下聚胶30min 倒掉dH2O 且dH2O冲洗 然后用滤纸片将水吸干 加入新配制的浓缩胶 胶量距离上边0 4cm处 倾斜插入梳子 避免产生气泡 然后补齐浓缩胶 室温下聚合30min 装入电泳槽 固定好胶 每个电泳槽放一块胶 倒入电泳缓冲液 平稳拔下梳子 内槽液体量要刚好没过样品孔 外槽的液体量要低于内槽 用电泳缓冲液冲洗样品孔 用微量加样器沿底部加入不同稀释度的变性的样品 30 l well 接通电源 200V 恒压 进行电泳 当溴酚兰跑到距离分离胶上缘3cm时 终止电泳 小心将胶取下 注意不要将胶破坏 准备转膜 Start SDS PAGE实验步骤 组装两块玻璃板 配制分离胶 见后 灌胶 先灌分离胶 胶量大约在梳子下1cm处 缓缓加dH2O封盖 在室温下聚胶30min 倒掉dH2O 且dH2O冲洗 然后用滤纸片将水吸干 加入新配制的浓缩胶 胶量距离上边0 4cm处 倾斜插入梳子 避免产生气泡 然后补齐浓缩胶 室温下聚合30min 装入电泳槽 固定好胶 每个电泳槽放一块胶 倒入电泳缓冲液 平稳拔下梳子 内槽液体量要刚好没过样品孔 外槽的液体量要低于内槽 用电泳缓冲液冲洗样品孔 用微量加样器沿底部加入不同稀释度的变性的样品 30 l well 接通电源 200V 恒压 进行电泳 当溴酚兰跑到距离分离胶上缘3cm时 终止电泳 小心将胶取下 注意不要将胶破坏 准备转膜 Start SDS PAGE实验步骤 组装两块玻璃板 配制分离胶 见后 灌胶 先灌分离胶 胶量大约在梳子下1cm处 缓缓加DW封盖 在室温下聚胶30min 倒掉DW 且DW冲洗 然后用滤纸片将水吸干 加入新配制的浓缩胶 胶量距离上边0 4cm处 倾斜插入梳子 避免产生气泡 然后补齐浓缩胶 室温下聚合30min 装入电泳槽 固定好胶 每个电泳槽放一块胶 倒入电泳缓冲液 平稳拔下梳子 内槽液体量要刚好没过样品孔 外槽的液体量要低于内槽 用电泳缓冲液冲洗样品孔 用微量加样器沿底部加入不同稀释度的变性的样品 30 l well 接通电源 200V 恒压 进行电泳 当溴酚兰跑到距离分离胶上缘3cm时 终止电泳 小心将胶取下 注意不要将胶破坏 准备转膜 Start PAGE PolyAcrylamideGelElectrophoresis SDS PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳 MSample 实验步骤 SDS PAGEProteinBlottingImmuno Detection 8KD 蛋白印迹 ProteinBlotting Gel Membrane MSample 蛋白印迹实验步骤 将膜 滤纸片剪成合适大小 用转移缓冲液浸5分钟 按图所示安装转印槽 膜略大于凝胶 并且滤纸和凝胶精确对齐 注意在胶和膜之间不要产生气泡 正确安装后 稳流100mA 转膜30mins 将膜取出 放入塑料盒内 用0 1MPBS洗净粘在膜上的凝胶 用dH2O冲洗一遍 转印安装示意图 吸水纸5张 吸水纸5张 注意 膜和胶的位置不能放反 且膜略大于胶 膜 胶 蛋白印迹实验步骤 将膜 滤纸片剪成合适大小 用转移缓冲液浸5分钟 按图所示安装转印槽 膜略大于凝胶 并且滤纸和凝胶精确对齐 注意在胶和膜之间不要产生气泡 正确安装后 稳流100mA 转膜30mins 将膜取出 放入塑料盒内 用0 1MPBS洗净粘在膜上的凝胶 用dH2O冲洗一遍 实验步骤 SDS PAGEProteinBlottingImmuno Detection 免疫学检测实验步骤 封闭 放入封闭液 含3 BSA的PBS T 10ml中封闭 先在摇床上摇10min 然后放入37 孵箱中放置60min 孵育结束后 直接向封闭液中加入靶抗原特异的一抗 1 100 先在摇床上摇10min 再放入37 孵箱中孵育30min 用PBS T洗三次 每次5min 在摇床上摇 弃去洗涤液 加入用1 BSA PBS T稀释的酶标二抗 HRP DaR 1 500 先在摇床上摇10min 再放入37 孵箱中孵育30min 用PBS T洗三次 每次5min 在摇床上摇 加入新配制的DAB底物液 显色 待显出明显条带时用dH2O终止反应 一抗 特异性抗体 洗涤 辣根过氧化物酶标记的二抗 底物 免疫学检测 Immuno detection Exampleofimmunoblotting 免疫学检测实验步骤 封闭 放入封闭液 含3 BSA的PBS T 10ml中封闭 先在摇床上摇10min 然后放入37 孵箱中放置60min 孵育结束后 直接向封闭液中加入靶抗原特异的一抗 1 100 先在摇床上