（无机化学专业论文）酚氧桥联双核金属配合物的合成、表征及其与dna的作用研究.pdf

摘要 人工核酸切割与作用试剂多年来一直是生物无机化学中一个最为活 跃的研究领域 其中以过渡金属配合物作为人工核酸酶体系又是该研究 领域的主要内容 过渡金属配合物作为许多天然核酸酶模型研究的重要 性在于 首先 通过对它们的研究 我们可以了解天然酶的催化机理及 金属离子在其中所起的作用 其次 高效特异性识别切割试剂可作为分 子生物学工具 用于生物工程 最后 这些切割试剂可作为化疗药物用 于治疗肿瘤 艾滋病以及其它遗传疾病 也可以作为结构探针 用于研 究d n a 结构以及蛋白质与d n a 的相互作用等 近年来 用双核 多核金属配合物体系作为核酸切割试剂的研究备 受关注 这缘于人们认识到与核酸有关的多种天然酶活性部位含有两个 或多个协同作用的金属离子 z n i i m g i i n i 1 1 f e i i i 等 特别是 当两个金属离子通过桥联配体进行配位时这种协同作用更为有效 基于以上两点 我们选择酚氧桥联型双核金属配合物体系来模拟天 然核酸酶中的双核活性中心结构 本文合成了能为两个金属离子提供相 同配位环境 含n 及双酚氧桥结构的八齿大环配体h l 1 和h 4 l 2 的一 系列双核金属配合物 研究了它们与p b r 3 2 2d n a 小牛胸腺d n a 以及 磷酸二酯键模型化合物b d n p p 2 4 二硝基苯基磷酸酯 的作用 主要 内容包含以下几方面 1 首先用金属样板离子法合成了上述两个配体与z n i m g i i f e i i i m n n v b i i 的一系列过渡金属配合物 用i r u v e a 摩尔 电导 质谱等方法推测了它们的结构 同时还得到了两个中间产物2 6 二羟甲基 4 氯苯酚和2 6 二甲酰基一4 氯苯酚的晶体结构 2 采用凝胶电泳手段 发现两种配体的z n i i 酉g 合物和以h 4 l 2 为 配体的m n 0 i 酉e 合物在3 6 5n l l l 的紫外光照下 p h 7 5 0 的t r i s h c i 缓冲 溶液中 可选择性地切割超螺旋质粒d n a 在此基础上 我们更进一步 考察了它们与p b r 3 2 2 d n a 作用的最佳反应条件 并结合文献方法从多 个角度研究了其作用机理 发现它们在反应过程中有多种物种起作用 其切割机理较为复杂 3 用u v v i s 光谱和荧光光谱 e b 为探针 研究了以上配合物与 酚氧桥联双核金属配合物的合成 表征及其与d n a 的作用研究 c td n a 的作用方式 发现它们与d n a 的结合方式极有可能不只 种 配合物f e 2 l 1 和m n 2 l 2 主要是与d n a 的碱基结合 且有部分插入作用 而其它配合物倾向于与d n a 上的磷酸基团静电结合 4 用紫外吸收光谱法研究了配合物与d n a 磷酸二酯键模型化合物 b d n p p 的相互作用 实验结果表明 配合物f e 2 l l 和m 9 2 l 1 在p h 6 0 8 0 的条件下可有效断裂b d n p p 中的p o 键 其中f e 2 l 1 可加快反应速 率达10 0 0 多倍 我们进一步研究了配合物f e 2 l 1 的水解条件及水解产物 发现在中性及温度较高的情况下该水解反应更易进行 综上所述 本文合成的系列配体的金属配合物中有些能够有效的断 裂d n a 或水解d n a 的模型化合物 是较好的化学核酸酶体系 其细节有 待于进一步深入研究 关键词 双核金属配合物 d n a 的水解断裂 人工酶 磷酸二酯键 摘要 a b s t r a c t f o rm a n yy e a r ss t u d i e so ns y n t h e t i cc o m p o u n d sc a p a b l eo fc l e a v i n g n u c l e i ca c i d sa n di n t e r a c t i n gw i t ht h e mh a v eb e e no n eo ft h em o s tv i g o r o u s f i e l d si nb i o i n o r g a n i c c h e m i s t r y a m o n gt h e s er e a g e n t s t a k i n gt r a n s i t i o n m e t a lc o m p l e x e sa sa r t i f i c i a ln u c l e a s es y s t e m sf o r m e dm a j o rc o n t e n t so ft h e r e s e a r c h t h ei m p o r t a n c eo fu s i n gt r a n s i t i o nm e t a lc o m p l e x e sa sm o d e l so f n a t u r a ln u c l e a s e sc a nb es u m m a r i z e da st h e f o l l o w s f i r s t w i t h t h e k n o w l e d g eo b t a i n e df r o mt h em o d e l sw e c a nl e a r nt h ea c t i n gm e c h a n is m so f n a t u r a le n z y m e sa n dt h er o l e sp l a y e db yt h em e t a li o n si nt h e i rc a t a l y t i c p r o c e s s s e c o n d t h e s ec l e a v a g er e a g e n t s w i t h h i g hs p e c i f i c i t y a n d r e c o g n i t i o nc a nb eu s e da st o o l so fm o l e c u l a rb i o l o g yi nb i o e n g i n e e r i n g a n d t h i r dl a s t l y t h e s e c l e a v a g er e a g e n t sc a nb es e r v e da sd r u g si nc h e m i c a l t h e r a p yt ot r e a tt u m o r s a i d sa n ds o m eg e n e t i cd i s e a s e s t h e yc a na l s ob e u t i l i z e da ss t r u c t u r a l p r o b e s t o s t u d yt h e s t r u c t u r e so fd n aa n dt h e i n t e r a c t i o n sb e t w e e nd n a b i n d i n gp r o t e i na n dd n a b a s e do nt h ea f o r e s a i dt w op o i n t s w ec h o s es o m en e ws y s t e m so f b i n u c l e a rm e t a lc o m p l e x e sw i t he n d o g e n o u sa l k o x ya n dp h e n o x yb r i d g e sa s o u rt a r g e tc o m p o u n d st om i m i ct h ea c t i v ec e n t e r so fn u c l e a s e s i nt h et h e s i s w ew e r es u c c e s s f u lt os y n t h e s i z et w ol i g a n d s n a m e l yh 4 l1a n dh 4 l 2 w h i c h c a ns u p p l yt w os i m i l a rc o o r d i n a t i o ne n v i r o n m e n tf o rt h et w om e t a li o n sa n d r e a c ta so c a d e n t a t el i g a n d sw i t hb o t hm e t a li o n st of o r ms t r u c t u r e sc o n t a i n i n g n 4c o o r d i n a t i o ns e t sa n dt w oa l k o x y l a t ea n dp h e n o l a t eb r i d g e s t h e nw e i n v e s t i g a t e dt h ei n t e r a c t i o n sb e t w e e nt h em e t a lc o m p l e x e sa n dp b r 3 2 2d n a c td n aa n d b d n p p b i s 2 4 一d i n i t r o p h e n y i p h o s p h a t e t h el a s t i sa c o m m o nm o d e lc o m p o u n do fp h o s p h a t ed i e s t e r t h ec o n t e n t so ft h et h e s i s i n c l u d e 1 s t a r t i n gf r o m2 6 一d i f o r m y l 一4 一s u b s t i t u t e d p h e n o l sa n d1 3 一d i a m i n o 一2 h y d r o x y p r o p a n e w eh a v es y n t h e s i z e dt h en e wc o m p o u n d s z n 2 l1 z n 2 l 2 m 9 2 l1 m 9 2 l 2 f e 2 l1 m n 2 l 2a n dp b 2 l 2w i t ht h es o c a l l e d m e t a li o n t e m p l a t ec o n d e n s a t i o n m e t h o da n dc h a r a c t e r i z e dt h e i rs t r u c t u r e sb yi n f r a r e d s p e c t r a u v v i ss p e c t r a e l e m e n t a la n a l y s i s m o l a re l e c t r o l y t i cc o n d u c t i v i t y a n dn l a s ss p e c t r u m m e a n w h i l e w eh a v eg o tt h ec r y s t a ls t r u c t u r eo ft w o t 1 i 酚氧桥联双核金属配合物的合成 表征及其与d n a 的作用研究 i n t e r m e d i a t e s 2 6 一h y d r o x y m e t h y l 一4 一c h l o r o p h e n o la n d2 6 d i f o r m y l 一4 一c h l o r o p h e n 0 1 2 s o m em e t a lc o m p l e x e sw e r es e l e c t e da st h ec a n d i d a t e st os t u d yt h e b i o a c t i v i t yi nt h ec l e a v a g eo fp l a s m i dp b r 3 2 2 d n ab yg e le l e c t r o p h o r e s i s t e c h n i q u e s p e c i f i c a l l y a f t e rt h eu vi r r a d i a t i o na t3 6 5 n m z n 2 l1 z n 2 l 2a n d m n 2 l 2c o u l dc l e a v ed n ae f f e c t i v e l ya tp h 7 5 f o rz n 2 l1a n dz n 2 l 2 t h e y c a nt r a n s f e rt h ec c cf o r mo fd n ai n t oo ca n dl i n e a rf o r m s f u r t h e r m o r e w e h a v em a n a g e dt of i n dt h eb e s tc o n d i t i o n sf o rt h e i rr e a c t i o na n dt os t u d yt h e r e a c t i o nm e c h a n i s mo fc o m p l e x e sw i t hd n a b yt h ea d d i t i o no fd 2 0 r a d i c a l s c a v e n g e r s w ec o m et ot h ec o n c l u s i o nt h a ts o m eo f o u rc o m p l e x e sa r eg o o d c a n d i d a t e si n c l e a v i n gd n a h o w e v e r t h e i rr e a c t i o n s i n v o l v ei n q u i t e c o m p l i c a t e da c t i o nm e c h a n i s m s 3 w ee x p l o r e dt h ea c t i n gm o d e so ft h ec o m p l e x e sw i t hd n a b yu s i n g a b s o r p t i o ns p e c t r aa n de ba saf l u o r e s c e n c ep r o b e a n df o u n dt h a tt h e i r r e a c t i o nm o d es h o u l dn o tb eu n i q u e e x p e r i m e n t a lr e s u l t ss u g g e s t e dt h a tf o r f e 2 l1 a n dm n 2 l 2 t h e i rb i n d i n gt od n a m a i n l ya c t e dt h r o u g hi n t e r a c t i o n w i t hb a s ep a i r sc o n c e r n i n gp a r t i a l i n t e r c a l a t i o n w h i l ef o ro t h e rc o m p l e x e s b i n d i n gw i t hp h o s p h a t eg r o u p so nd n ab a c k b o n er e a l i z e dv i ae l e c t r o s t a t i c i n t e r a c t i o n 4 t h ei n t e r a c t i o no fc o m p l e x e sf e 2 l1a n dm 9 2 l1w i t hd n am o d e l c o m p o u n d b d n p pw a s a l s o i n v e s t i g a t e dw i t h u vs p e c t r o p h o t o m e t r i c m e a s u r e m e n t s t h ee x p e r i m e n t si n d i c a t e dt h a tt h ec o m p l e x e sa r ee f f e c t i v ei n t h ec l e a v a g eo fp 一0b o n di nb d n p pa tp h 6 o 8 0 t h er e s u l t ss h o w e dt h a t f e 2 l1c a na c c e l e r a t et h eh y d r o l y t i cr a t eo fb d n p pf o r10 0 0f o l da n di ti s e v e nm o r ee f f e c t i v ea th i g h e rt e m p e r a t u r ea n dp h7 0 t os u mu p s o m eo f o u rm e t a lc o m p l e x e sh a v ed i s p l a y e dp r o w e s si nt h e c l e a v a g eo fd n a a n dh y d r o l y s i so fd n am o d e lc o m p o u n d t h e ya r eh o p e f u l c a n d i d a t e so fc h e m i c a ln u c l e a s e b u tf u r t h e rr e s e a r c hi ss t i l ln e e d e d k e y w o r d b i n u c l e a rm e t a l c o m p l e x e s h y d r o l y t i cc l e a v a g e o fd n a a r t i f i c i a le n z y m e s t h ep h o s p h a t ed i e s t e rb o n d i v 第一章综述 第一章综述弟一早三示迎 1 1 核酸 核酸酶简介及其研究意义 核酸是生物体中最重要的组成物质 是由核苷酸通过磷酸二酯键聚合成的多核 苷酸长链 任何有机体中无一例外都含有核酸 核酸分为脱氧核糖核酸 d n a 并1 3 核糖 核酸 r n a 两大类 d n a 主要存在于细胞核的染色体中 它是生物遗传信息的载体 r n a 主要集中于细胞质中 是蛋白质合成过程中必不可少的物质 核酸具有特别重要的生物功能 是生物承载和传递信息的载体 是基因表达的 物质基础 它不但对生物体的生长 发育和繁殖等正常的生命活动具有十分重要的 作用 而且与生命的一些异常情况 如肿瘤发生 放射损伤 遗传疾病等也有密切 关系 因此 核酸是分子生物学和医学研究中的重要领域 核酸广泛存在于动物 植物和微生物中 在这些生物活体内 根据生理活动的 需求 有时需要发生核酸的合成 有时又需要发生核酸的降解 而这些核酸的合成 和降解均由相关的酶催化 并受到严格的调节 所谓核酸的切割 就是通过化学反 应将长链的核酸分子断裂成较短的碎片 虽然限制性内切酶能在特定位点切割d n a 分子 但其识别位点仅为4 8 个核苷酸 而在一条较长的核酸链中这样的识别序列出 现的几率非常高 化学合成的d n a r n a 定位断裂试剂是国际上8 0 年代开始发展起 来的一类新型非酶断裂工具 被称为化学核酸酶 它是由切割体系和识别体系两部 分组成 可以在核酸底物特定部位将其断裂 它们既具有限制性内切酶的高度专一 性 又能在人们预先设计的任何位点断裂d n a 和r n a 此外还具有制备简单 价格 便宜 不受酶的天然专一性限制等优点 随着遗传工程及分子生物学技术的不断发 展 人们已越来越不满足于限制性内切酶的应用 化学合成的核酸断裂工具已引起 人们的极大重视 人工核酸切割剂的研究是八十年代发展起来的生物无机化学领域的重要分支 研 究人工核酸切割试剂具有很重要的理论价值和应用价值 1 人工核酸切割试剂可 以作为许多天然核酸酶的模型 有助于我们深入了解核酸酶的催化机理 对金属及 配合物催化核酸水解机理的研究可以帮助我们理解金属离子参与核酸酶催化水解时 所起的作用 2 人工核酸切割试剂可以作为化疗药物用于治疗肿瘤以及遗传疾病 也可作为d n a 的结构探针用于研究d n a 的结构以及蛋白质与d n a 的相互作用等 3 人工核酸切割试剂与d n a 结合的大分子偶联体具有定点切割的特性 可以作为 重要的分子生物工具 弥补天然核酸酶的缺陷 这也是研究人工化学核酸酶的终极 酚氧桥联双核金属配合物的合成 表征及其与d n a 的作用研究 目标 此外 将定点切割试剂用于反义p c r 技术 2 还可以大大推进克隆技术的发展 普通的核酸切割试剂在足迹技术中也得到了广泛的应用 3 足迹技术中往往使用化学 试剂或核酸酶来水解与蛋白结合在一起的核酸 多数核酸酶由于体积太大而只具有 有限的分辨率 因此需要更小的化学探针来获得更高的分辨率 人工核酸切割试剂 便可以充当这种化学探针 同理 它也可以作为研究核酸高级结构的探针 4 j 由于这 是一项涉及化学 生物学 分子生物学等多种学科的前沿性基础研究 它的深入研 究必将促进相关学科的迅速发展 产生出一大类人工模拟酶 并在高科技生物技术 领域中获得广泛应用 目前人们对人工化学核酸酶的主要研究成果还是针对上述的 1 和 2 两方面 对于第 3 方面的研究成果相对较少 正是因为人工化学核酸酶的这些重要理论价 值和应用价值 2 0 多年来有越来越多的课题组开展了该领域的研究 并随着人类基 因图谱测序工作的完成 对这一领域的研究兴趣和研究热情空前高涨 1 2 化学核酸酶的研究背景 1 2 1 人工化学核酸酶的研究进展 基因工程是在分子水平上将目标基因或具有其它功能的d n a 片段按人们的要求 和设计 在体外重新组合成具有某种新的功能或比原d n a 序列更为有效的重组d n a 分子的过程 这涉及到对d n a 序列进行切割 修饰和连接等复杂操作 而d n a 定位 断裂是这些过程中的关键所在 然而 在生理和非酶条件下 d n a 的磷酸 n 键非 常稳定 不易被水解 在p h 7 0 币h 2 5 c 时的半衰期估计为几亿到几千亿年 5 7 如此 长的半衰期对d n a 作为遗传信息的载体是非常关键的 但对于基因工程中最重要的 d n a 断裂技术却是一个挑战 它要求催化剂必须在数分钟内提供高达1 0 数量级的反 应来加速 促成磷酸二酯键的水解断裂 这一过程最常用的断裂手段是天然限制性 内切酶 基因工程中的 分子剪刀 但天然限制性内切酶固有的先天缺陷使其很 难适应飞速发展的基因工程技术的要求 因此 核酸酶的化学模拟研究迫在眉睫 近年来 多核金属配合物用作核酸切割试剂的研究取得了引人注目的进展 其 中重要的推动原因是人们从结构上逐步认识到与核酸有关的多种天然酶的活性部位 含有两个甚至更多个协同作用的金属离子 如z n i i m g i i n i i i f e i i i 8 9 等 特别是当两个金属离子通过桥联配体 如氢氧基或水分子 进行配位时更为有效 这样 双核金属中心有利于电子离域化从而降低反应活化能 有利于结合较大的底物分子 也有利于底物分子的静电活化或水分子的电离 减小反应过渡态的能量 但这些金 第一章综述 属配合物大多集中于过渡金属和稀土金属 特别是由于第一过渡金属电子密度高 l e w i s 酸活性较强 所以人们一般选择这些金属离子作为人工水解切割试剂的活性中 心 d n a 的主要断裂方式有氧化性断裂和水解性断裂 由于磷酸二酯键固有的高度 稳定性使之除了在核酸酶作用下才能发生有效断裂外 要发生非酶催化的水解性断 裂存在着极大的困难 因此 关于磷酸二酯键被小分子降解的研究大都集中于d n a 的氧化降解或模型化合物的水解 而关于d n a 本身水解的报道却为数较少 目前 绝大部分化学断裂系统是以氧化还原机理起作用的 19 7 9 年s i g m a n 等 j 在研究菲咯啉对大肠杆菌d n a 聚合酶i 抑制作用机理时发现 在过量的o p h 2 0 2 存 在下c u i i 能引起d n a 断裂 这是第一个描述对双链d n a 具有有效切割能力的化学 核酸酶 实验 l l 表明它断裂最普遍的右手螺旋型b d n a 比断裂较不普遍存在的 z d n a 要容易得多 该断裂反应的活化物种是 o p 2 c u 且必需有两个共反应物 o p 2 c u 矛1 h 2 0 2 随后人们又发现 在h 2 0 2 或0 2 加还原剂的存在下 f e i i e d t a 可有效地断裂单链或双链d n a 在这个切割过程中 o h 自由基通过f e n t o n 反应产生 然后通过吸引与脱氧核糖环上的一个氢原子结合 使得糖环重排从而导致发生链的 断裂和碱基的释放 这个体系已被广泛用于印迹技术 l2 1 近十年来 除上述两个体 系外 还发现了许多其它的氧化断裂d n a 的配合物体系 如博莱霉素 b l m 作为 抗肿瘤试剂 能够用来结合和断裂d n a 1 3 1 4 1 但反应需某些具有还原活性的金属 铁 钻 镍 作媒介 同时在分子氧存在下 f e i i 川l m 体系 n 0 2 3 j h h 2 0 2 产生活性中 心 以 o h 自由基对d n a 产生切割 1 3 8 1 此外 还有许多配体与c u i i 络合能对d n a 氧化降解 这些配体有2 2 一联吡啶 19 1 各种异羟肟酸 2 0 2 1 l 三肽g 1 y g 1 y h i s 2 2 等 平面正方形n i i i 配合物也可用于氧化j c 刃害 q d n a 2 3 2 4 同时 各种光切割剂和电 解切割剂也能用来氧化断裂d n a 如铑 2 5 1 钌 2 6 2 7 1 和钻 的化合物能够作为光切割 剂来探测核酸构象以及对d n a 链进行特异性识别 水解性断裂是生物体内降解核酸所采用的模式 有关水解断裂d n a 的最早报道 见诸于1 9 8 7 年 由b a r t o n 等 2 9 j 合成的一个大环多胺双臂式r u i i 配合物 r u i i d i p 2 m a c r o d i p d i p h e n y l 1 10 一p h e n a n t h r o l i n e m a c r o 4 7 n h 2 c h 2 c h 2 2 n c h 2 c h 2 n h s 0 2 c 6 h 4 1 1 0 p h e n a n t h r o l i n e 在非氧化还原金属离子z n i i c d i i p b i i 和c u i i 等的存在下 可以将超螺旋p b r 3 2 2 d n a 切割成缺刻d n a 但切割 效率不高 之后不断报道了其他金属配合物也能水解超螺旋d n a 如l n i i i 3 0 3 4 f e i i 3 5 1 c o i i i 3 6 3 7 1 c u i i 2 0 3 8 n i i i 3 9 4 0 1 z n i i 4 1 1 以及其它一些二价过渡 酚氧桥联双核金属配合物的合成 表征及其与d n a 的作用研究 金属配合物 4 2 4 3 和稀土配合物 4 4 1 特别是1 9 9 4 年 q u e 等人 3 5 发现f e 2 h p t b o h n 0 3 4 h p t b 寸q n n n t e t r a k i s 2 b e n z i m i d a z o l y m e t h y l 2 h y d r o x y l 一1 3 d i a m i n o p r o p a n e 在0 2 或h 2 0 2 加还原n 硫苏糖醇 d t t 或抗坏血酸的存在下能水解断裂质 粒d n a p b r 3 2 2 近年来 杨频课题组也陆续发现了一些具有水解d n a 模型化合物 的体系 4 5 卿 其中c u i i l 组氨酸配合物m 在生理条件及3 7 c 下 可以有效切割双 链质粒d n a 和单链核苷酸二聚体d a p d a 且切割反应符合水解机理并有一定的序列 性 二乙基三胺 镁 i i m g d i e n 具有很好的引发双链d n a 水解断裂的活性 4 7 1 这一体系不仅可以在准生理条件下水解切割双链d n a 也可以切割二核苷酸d a p d a 甚至可以有效地水解切割单核苷酸5 d a m p 和3 d a m p 这些结果对于寻找用s 区 生命金属为基础的人工核酸酶研究做出了有益的探索 1 2 2 人工化学核酸酶切割d n a 的作用机理 人工化学核酸酶切割d n a 的作用机理大致可以分为自由基氧化切割 磷酸酯水 解切割和消除机理切割 5 1 1 其中消除机理切割试剂的研究较少 5 2 1 绝大多数切割试 剂是以氧化还原机理进行的 通过进攻核酸的糖环或碱基进行夺氢氧化 从而引起 核酸的断裂 这种断裂是破坏性的 会导致遗传信息的丢失 失去了生物学利用价 值 另外 由于氧化断裂试剂的特异性主要依赖于在d n a 不同位置的反应性差异以 及断裂试剂与d n a 的特异性结合造成的局部自由基富集 而自由基所具有的高反应 性和扩散性使其特异性比较差 反应难于控制 产物种类较多 从而也就大大限制 了其应用 而d n a 水解型断裂试剂通常是金属离子直接或间接与磷酸骨架上的氧原 子配位 进攻磷酸二酯键引起水解或酯反应并导致链断裂 其机理与天然核酸酶基 本相同 它所产生的断裂片段是黏性的 可以用连接酶连接起来进一步加以利用 且不易产生易扩散的自由基 不需要氧化还原性的辅因子 反应条件温和 所以 虽然酯水解切割试剂在切割速率上不及氧化型切割试剂 但是在基因工程和分子生 物学方面却具有很深远的研究意义和应用价值 1 2 2 1d n a 的自由基氧化切割机理 氧化型断裂一般需要在反应体系中加入辅助剂 如h 2 0 2 等 或用一定频率的光照 射 生成原子态氧或氢氧基自由基等活性物种进攻核酸的糖环和碱基 夺去氢原子 而导致其氧化破坏 进而使核酸链发生断裂 因此 氧化型人工化学核酸酶的主要 作用基团是核酸链上的糖环 磷酸骨架和杂环碱基 53 j 1 糖环 磷酸骨架的氧化 4 第一章综述 b h 1 图1 1 脱氧核糖上的七个氢原子的位置 如图1 1 所示 在d n a 链上的脱氧核糖环上五个部位共有七个氢原子 分别是 h 1 h 2 h 2 h 3 h 4 h 5 h 5 这些氢原子都可以被氧化剂或自由基夺 去 产生的碳正自由基进行重组即可导致核酸链的断裂 根据寡聚核昔酸的x 射线晶 体数据表明 1 和4 位于b 型d n a 的小沟内 2 和3 的位置在大沟内 而5 位置上的 一个氢原子伸向小沟内 另一个则远离d n a 骨架伸向溶剂内 2 2 o 虽然d n a 中的七个 氢原子都对自由基有活性 但是它们从双股螺旋上脱去的几率却不完全相同 主要 取决于核酸的结构以及氧化剂接近糖环的方式 不同的氧化切割试剂 夺取的h 原子 也不同 h 1 脱氢反应类切割试剂的代表就是c u p h e n 2 1 1 铜邻啡咯啉配合物是具有序 列选择性的小沟插入试剂 研究表明在溶液中c u p h e n 2 首先被还原剂还原成 c u l p h e n 2 还原产物与d n a 结合并由氧化剂氧化生成活性铜氧组分进攻并断裂d n a 链 主要切割产物是游离碱基 5 亚甲基呋喃酮 5 m f 和带有3 磷酸末端和5 磷酸末端的d n a 碎片 5 5 5 6 c 2 位上的h 原子深埋在大沟内 因此 这个位置上的h 反应活性较低 不易发生脱氢反应 c 2 位上的脱氢反应一般只发生在d n a 的光致切 割过程中 到目前为止在文献中还未见报道以c 2 脱氢反应为机理的氧化切割试剂 c 3 位上的氢较难接近且由此产生的3 脱氧核糖自由基的稳定性较差 因此切割试剂 很少以h 一3 脱氢机理来断裂d n a 在这类试剂中主要是三价铑与平面插入配体所形 成的配合物 例如 r h p h e n 2 p h i 3 十 r h p h i 2 b p y 3 5 n r h e n 2 p h i 3 在光照条件下这 些配合物能够断裂d n a 并造成双股螺旋的轻微解旋 5 7 5 8 h 4 位于b 型d n a 中的小 沟位置 非常易于接近 所以许多切割试剂选择这一位置作为反应位点 如 e d t a f e i i 1 4 f e n t o n 反应产生的羟基自由基 5 9 1 博莱霉素 1 3 1 4 及f e i i 博莱霉素 配合物 6 0 1 等 c 5 位置上的两个h 原子也非常易受攻击 6 1 6 2 1 进攻这两个h 原子都要 从小沟方向入手 以h 5 或h 5 脱氢反应为反应机理的切割试剂有f e n t o n 反应产生的 羟基自由基 6 2 1 和阳离子金属卟啉 6 3 1 等 总之 在b 型d n a 中处于小沟内的5 和4 氢原子最易受攻击 因此 小沟结合分 酚氧桥联双核金属配合物的合成 表征及其与d n a 的作用研究 子和那些非选择性自由基物种最易从核糖环的5 和4 位置入手 而大沟结合分子则易 于从大沟方向进攻h 5 来断裂d n a 2 杂环碱基的氧化 d n a 0 7 含有四种碱基 鸟嘌呤 g 腺嘌呤 a 胸腺嘧啶 t 和胞嘧啶 c 其中 富电子的嘌呤和嘧啶杂环是许多亲电试剂和氧化剂的主要攻击对象 核酸碱基的氧 化损伤是d n a 切割的重要途径 虽然碱基损伤并不能直接引起核酸链的断裂 但是 经过第二步化学处理 如加热 碱或酶作用等 最终可以产生位点特异性甚至一定 程序上的序列特异性的d n a 断裂 5 引 在核酸的四种碱基中鸟嘌呤的单电子氧化还原电势最低 最易被氧化 因而大多 数氧化剂选择鸟嘌呤为进攻目标 腺嘌呤的氧化还原电势比鸟嘌呤稍高 因而发生 氧化损伤的几率也较低 胸腺嘧啶和胞嘧啶的电势虽然最高 但在温和的几近生理 条件下 它们也可以发生碱基特异性反应 金属及其配合物是我们所最为关心的导致核酸碱基损伤的氧化剂 一般地 如果 某金属配合物有足够的氧化能力去夺取糖环上的氢原子 那么它也有可能在鸟嘌呤 甚至另外三个碱基上进行单电子氧化反应 2 3 1 由碱基氧化损伤进而引起d n a 断裂的 方式和途径多种多样 不同的金属及其配合物有不同的碱基和序列选择性 如锰和 锇盐具有胸腺嘧啶选择性 金属镍配合物具有鸟嘌呤特异性 此外 同一种金属的 不同配合物也会改变氧化还原电位从而改变其碱基选择性 具有超强氧化能力的金 属配合物可以运用不同的途径来氧化损伤d n a 的碱基 需要说明的是 事实上许多 切割试剂在氧化切匐 d n a 过程中 氧化糖环一磷酸骨架和氧化碱基两种作用模式都在 发挥作用 1 2 2 2 d n a 的酯水解切割机理 d n a 的酯水解断裂试剂只是将核酸链上某些磷酸二酯键发生水解性切割 它比 氧化切割试剂具有如下优点 1 它不破坏碱基和糖环 保留了遗传信息 生成的 磷酸末端产物能用连接酶连接起来进一步利用 2 它不会产生易弥散的自由基 有利于合成高度序列专一性的定点切割试剂 3 它不需要加入辅助试剂或辅助手 段 对生物体的毒害较小 d n a 酯水解断裂的结果大多是生成带有5 磷酸基 n 3 羟基的片段 该反应是一 个亲核取代过程 涉及到三种基团 1 活化亲核水分子的广义碱 2 促进3 羟 基离去的广义酸 6 4 j 3 稳定五价过渡态磷原子上负电荷的l e w i s 酸 许多金属离子 及其络合物都可以作为l e w i s 酸而催化核酸水解 它们有三个方面的催化作用 一是 第一章综述 它们可以与核酸上的磷氧负电荷结合从而提高磷原子的亲电性 这有利于亲核试剂 进攻形成五配位磷过渡态 二是它们可与过渡态中带部分负电荷的离去基团结合 帮助其离去 第三 h 2 0 与金属离子结合后 可以生成与其络合的氢氧根离子作为亲 核试剂 6 5 总之 d n a 的水解切割条件较为温和 可在近生理条件下进行 由于金属离子 是l e w i s 酸 在水溶液中两个水分子可与之结合 其中一个生成与其络合的氢氧根离 子作为亲核试剂 另一个与核酸上的磷氧负电荷结合从而提高磷的亲电性 研究 6 6 6 8 表明金属离子催化核酸水解断裂机理如图1 2 所示 首先 亲核试剂进攻d n a 分子中 的磷酸酯形成五配位磷过渡态 这一步是可逆的 这种配位有利于过渡态中的离去 基团更好的离去 第二步 磷酸二酯键中的p o 键断裂 从而使d n a 发生断裂 p x 图1 3 配体的结构通式 h 2 l 1 h 4 l 2 h 4 l 3 h 3 l 4 r c h 2 x y h r c h 2 x y o h r c h 2 2 x y o h r c h 2x hy o h r o h 审r 叱 酚氧桥联双核金属配合物的合成 表征及其与d n a 的作用研究 2 2 12 6 二羟甲基 4 取代苯酚的合成及结构表征 1 将2 1 6 9 对甲基苯酚加入到含有1 0 9 n a o h 的4 0 m l 水中 搅拌溶解得金 黄色溶液 冷却至室温 加入4 3 m l3 7 的甲醛溶液 得亮黄色溶液 室温下继 续搅拌约8 h 生成大量的淡黄色团粒状沉淀并聚集成块状 过滤沉淀 用3 4 0 m l 饱和n a c i 溶液洗涤 得白色固体 用2 0 0 m l 热水将其溶解 再加入冰醋酸调节 p h l 2 析出沉淀 将沉淀抽滤 水洗 真空干燥 用乙酸乙酯重结晶上述产品 得白色产物 1 2 6 一二羟甲基一4 甲基苯酚 2 2 3 9 产率8 1 m p 12 7 12 8 c 文 献值 6 1 2 8 1 2 9 c 元素分析 c 9 h 1 2 0 3 实测值 计算值 c 6 4 2 1 6 4 2 8 h 7 2 3 7 1 9 2 用等物质的量的对氯酚代替对甲酚在上述相同的条件下反应 可得白色产 物 l a 2 6 二羟甲基 4 一氯苯酚 7 1 2 3 8 9 收率6 3 m p 1 5 3 1 5 4 c 我们将重 结晶的乙酸乙酯滤液在室温静置三天后有无色的长方体状晶体析出 其x 射线单 晶衍射数据如下 图2 2产物 1 a 的椭球结构图图2 3 产物 1 a 的7 7 1 堆积模式 图2 4 产物 1 a 的氢键图 表2 1 产物 1 a 的部分键长和键角参数 第二章双核金属配合物的合成及结构鉴定 表2 2 产物 1 a 的部分氢键键长 2 2 2 2 6 二甲酰基 4 取代苯酚的合成及结构表征 1 活性m n 0 2 的制备 8 在控温2 5 0 c 下 用坩埚加热分解5 4 9 碳酸锰1 0 h 得 4 0 9 活性m n 0 2 转入干燥器中备用 2 在一5 0 0 m l 圆底烧瓶中加入4 0 9 新制的活性m n 0 2 和2 0 0 m l c h c l 3 搅拌并 加热使其回流反应约1 5 m i n 向上述反应体系中加入5 9 产物 1 即2 6 二羟甲基一4 一甲 基苯酚并继续回流反应8 h 冷却 抽滤得黄色液体 用3 8 0 m l 的c h c l 3 洗涤固体 直到滤液变为无色 然后将所有滤液合并 旋转蒸发得黄色产物 2 2 6 二甲酰基 4 甲基苯酚 简写为d f m p 3 0 9 产率6 2 m p 1 2 8 1 2 9 c 文献值1 9 1 1 2 9 i 3 0 c hn m r 3 0 0m h z 6 p p m c d c l 3 2 4 4 s 3 h 一c h 3 7 8 2 s 2 h 一c h 1 0 2 7 s 2 h c h o 1 1 5 2 s 1 h o h i r k b r 2 8 7 0c m 以 甲酰基的c h 1 6 8 1c m 以 甲酰基的c o 1 2 1 5c m 叫 苯酚的c 0 3 用等质量的产物 1a 2 6 二羟甲基 4 氯苯酚 代替产物 1 2 6 二羟甲基一4 甲基苯酚 在上述相同的条件下回流反应2 4 h 得黄色产物 2 a 2 6 二甲酰基 4 氯苯 酚 简写为c i d f m p 2 8 9 产率5 7 n q p 1 0 5 q 0 6 c 文献值b o 1 0 6 q 0 7 c 用 甲苯重结晶 重结晶的滤液在室温静置一周析出黄色针状晶体 其x 单晶衍射数据 如下 图2 5 产物 2 a 的椭球结构图 图2 6 产物 2 a 的氢键图 酚氧桥联双核金属配合物的合成 表征及其与d n a 的作用研究 表2 3 产物 2 a 的部分键长和键角参数 0 5 h 2 0 6 0 5 一h 2 0 3 0 3 h 5 a ol c 7 h 7 a 0 3 0 8 2 0 8 2 0 8 2 0 9 3 1 8 6 2 4 8 1 9 2 2 4 7 2 5 8 7 11 2 9 6 3 1 2 2 6 4 1 1 3 2 7 8 5 1 4 1 4 6 3 1 1 8 7 1 4 5 3 9 9 6 c 1 5 一h 1 5 a 0 5 o 9 32 4 5 2 7 8 9 1 6 1 0 1 3 0 3 h 5 a o 主0 8 2 2 4 7 2 9 5 2 11 11 8 4 2 2 第二章双核金属配合物的合成及结构鉴定 2 2 3 样板离子法合成金属配合物 2 2 3 1 z n 2 l 1 和z n 2 l 2 配合物的合成 1 将0 1 6 4 2 9 1m m 0 1 2 6 一二甲酰基 4 一甲基苯酚 d f m p 溶于1 0m l 热无水乙醇 中 加入已溶于5m l 无水乙醇的o 2 9 7 5 9 1m m o z n n 0 3 2 2 h 2 0 的溶液 搅拌回 流反应1 5r a i n 向反应混合溶液中滴加5m l1 3 二氨基 2 丙醇 0 0 9 0 9 9 1m m 0 1 的无水乙醇溶液 继续回流反应2 4 h 得橙黄色沉淀 过滤并分别用热无水乙醇和氯 仿洗涤三次 真空干燥 得产物 i 0 3 0g 产率8 6 2 称取0 18 4 3 9 1m m 0 1 2 6 二甲酰基一4 一氯苯酚 c i d f m p 年 10 219 6 9 1m m 0 1 z n c h 3 c o o