流式细胞基本原理和在白血病中应用ppt课件

流式细胞学在血液病中的临床应用 基础篇 1 流式细胞术的基本概念 流式细胞术是一项集激光技术 流体力学技术 光电测量技术 计算机技术以及细胞荧光化学技术 单克隆抗体技术为一体的新型高科技技术 快速 准确 客观 多参数 可同时对特定群体加以分选 研究对象为生物颗粒 如各种细胞 微生物及人工合成微球等 研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征 并加以定量 是当代最先进的细胞定量分析技术 2 白血病和淋巴瘤的免疫分型微量残留白血病细胞检查阵发性睡眠性血红蛋白尿多发性骨髓瘤干细胞计数肿瘤细胞的周期和倍体分析网织红细胞和网织血小板计数免疫状态监测血小板功能及相关疾病HLA B27 流式细胞仪的临床应用 3 标本来源 外周血 骨髓 组织块 培养细胞 脱落细胞及其他血清或各类体液样本 肝素抗凝的外周血和骨髓标本 存放时限为48 72小时 EDTA抗凝标本 存放时限只有12 24小时 因为髓细胞在此条件下会裂解 4 直方图 散点图 二维等高图 密度图 常见的几种流式细胞图 5 设门 淋巴细胞亚群 6 一 白血病免疫分型 7 白血病诊断依赖于多种检测方法 样本 形态学 流式细胞术 细胞遗传学 FISH 分子生物学 基础和金标准 必需 重要 8 急性白血病免疫分型的价值 区分淋系 髓系白血病区分淋系白血病中的T B ALL鉴定混合细胞性白血病的类型 T M B M T B T B M治疗过程中监测MRD 评价疗效提示某些遗传学异常 CD19 AML t 8 21 CD13 CD33 B ALL t 9 22 提示预后 CD56等阳性的AML患者预后不良CD15阳性的AML患者CR率高 9 正常造血细胞各系列抗原表达的演进 不管是在胚胎期 老年期 还是化疗以后 正常造血细胞抗原组合的表达模式都不改变 10 白血病细胞表面抗原异常表达 造血细胞抗原组合的表达模型能够用于鉴别恶性克隆 白血病克隆与正常细胞之间抗原表达不同 白血病相关的免疫表型 LAIP 11 正常造血细胞白血病细胞抗原表达遵循系列保守性出现抗原跨系表达髓系 CD33 T系 CD7 髓系 CD33 CD7 抗原表达有一定的时序性出现抗原时序混乱表达原始细胞 CD34 CD15 原始细胞 CD34 CD15 各阶段细胞按一定的比例分布出现分化阻滞原幼细胞20 抗原表达的缺失抗原强度的异常 12 需要掌握 正常造血细胞的抗原表达规律不同系列的细胞表达的抗原 同一系列不同阶段的细胞表达的抗原 每种抗原的表达强度 13 免疫分型常用的抗体 干祖细胞CD34 TDT CD117 CD38 HLA DR AMLCD33 CD13 CD11b CD15 CD64 CD14 MPO怀疑M6加做CD71 GPA怀疑M7加做CD61 CD41 CD42B ALLCD10 CD19 CD20 CD22 c mIg cCD22 CD79aT ALLCD10 CD3 CD4 CD8 CD2 CD5 CD7 CD1a cCD3NK细胞CD16 CD56 CD57浆细胞CD38 CD138 c c CD19 CD56 14 根据骨髓细胞CD45 SSC图中分布情况设门圈定各类细胞R1门为成熟淋巴细胞R2门为正常单核细胞位置R3门正常粒细胞位置R4门为幼稚淋巴细胞出现位置R5门为有核红细胞或细胞碎片位置R6门为幼稚髓细胞出现位置白血病细胞通常会在R4R6两门位置处出现 正常成人骨髓样本 CD45设门 15 AML M1 16 AML M2 17 AML M3 18 结论 ANLL 建议结合染色体和分子生物学和形态学诊断M3 19 结论 ANLL 伴单核细胞分化 免疫表型符合M4 20 结论 ANLL 伴单核细胞分化 免疫表型符合M5 21 结论 ANLL 建议结合形态学以确诊M6 22 AML M7 23 B ALL 24 T ALL 25 EGILScoringSystemForBAL 2points 26 Requirementsforassigningmorethanonelineagetoasingleblastpopulation MyeloidlineageMyeloperoxidase flowcytometry immunohistochemistryorcytochemistry orMonocyticdifferentiation atleast2ofthefollowing NSE CD11c CD14 CD64 TlineageCytoplasmicCD3 flowcytometrywithantibodiestoCD3epsilonchain immunohistochemistryusingpolyclonalanti CD3antibodyzetachain whichisnotT cellspecific orSurfaceCD3 rareinmixedphenotypeacuteleukemia BlineageStrongCD19withatleast1ofthefollowingstronglyexpressed CD79a cytoplasmicCD22 CD10orWeakCD19withatleast2ofthefollowingstronglyexpressed CD79a cytoplasmicCD22 CD10 MPAL mixedphenotypeacuteleukemia WHO2008 27 CD19 CD22 CD10 CD15 B lineageALL B negative CD64 CD14 CD33 MonocyticLeukemia TwoLeukemicPopulations Monoblasts Lymphoblasts 结论 急性混合细胞白血病 AM LL 28 二 白血病微小残留病灶 MRD 目的 判断预后 指导个体化分层治疗 预测复发 29 B ALL 多数表达CD34 CD38dim TDT CD19 CD10str CD20 这些标志的任意组合CD34 CD22 CD34 CD20 TDT CD10等 也可加上某些异常标志如CD13 CD33 CD15即可将ALL细胞与正常骨髓和外周血细胞分开 60 80 T ALL TDT结合T细胞表面标志如CD5或CD3 加上cCD3 90 30 AML CD34 CD56 CD15在内的多种组合 表达TDT CD13 CD33与散射光及抗原密度 可确定残留的AML细胞 70 80 31 LEUKEMIAATDIAGNOSIS NORMAL 32 2013 4 21 原始细胞占79 2 2013 5 18 MRD 1 09 CD19 CD33 CD10 CD20 33 34 三 成熟淋巴细胞增殖性疾病 35 慢性淋巴细胞白血病幼稚淋巴细胞白血病毛细胞白血病脾边缘区淋巴瘤大颗粒淋巴细胞白血病皮肤T细胞淋巴瘤相关白血病 循环淋巴细胞增殖性疾病 这类疾病必须有流式细胞术的辅助诊断 36 正常淋巴细胞 淋巴细胞增殖性疾病 克隆扩增 确定克隆来源 37 B LPD B淋巴细胞出现轻链的单一抑制性表达 T NK CLPD 由于缺乏单克隆的标记物 通过FCM诊断成为难点 38 正常 单克隆 39 CD19 淋巴细胞增多的鉴别诊断 DighieroG HamblinTJ Lancet 2008 371 March22 1017 B LPD lymphoproliferativedisease 40 结论 CLL SLL 41 结论 慢性B淋巴细胞增殖性疾病 建议进一步FISH检测t 11 14 以确诊MCL 42 结论 免疫表型符合HCL 建议结合形态学和临床明确诊断 43 44 1 前驱T淋巴母细胞白血病 淋巴瘤 T ALL T LBL 2 母细胞性NK细胞淋巴瘤3 慢性前淋巴细胞白血病 淋巴瘤 T CLL T PLL 4 颗粒淋巴细胞白血病 T LGL 5 侵袭性NK细胞白血病 ANKCL 6 成人T细胞淋巴瘤 白血病 ATCL L 7 节外NK T细胞淋巴瘤 鼻型 NK TCL 8 肠病型T细胞淋巴瘤 ITCL 9 肝脾 T细胞淋巴瘤10 皮下脂膜样T细胞淋巴瘤11 菌样霉菌病 赛塞里 Sezary 综合征 MF SS 12 间变性大细胞淋巴瘤 ALCL T和非T非B细胞 原发性皮肤型13 周围T细胞淋巴瘤 PTL 14 血管免疫母细胞T细胞淋巴瘤 AITCL 15 间变性大细胞淋巴瘤 ALCL T和非T非B细胞 原发性全身型 WHO2008成熟T NK细胞肿瘤淋巴增殖性疾病分类 45 免疫表型特征 46 1 光散射信号的异常 FS 47 2 抗原丢失 75 成熟肿瘤T细胞会丢失正常抗原CD7是最易发生丢失的抗原CD2和CD5也是经常发生丢失的抗原 48 3 抗原表达异常 如 伴CD10 49 4 抗原表达强度异常 50 正常 CD4 CD8 1 5 2 5 1肿瘤细胞出现CD4或CD8某一个群体的限制性表达模式 CD4 CD8 CD4 CD8 CD4 CD8 CD4 CD8 多见 5 细胞群体数量的异常增加以及抗原的限制性表达 51 52 常见T CLPD免疫表型 T 幼稚淋巴细胞白血病 T PLL 通常CD4 orCD4 CD8 PB 55 幼淋细胞 杭XX 女 60 结果 异常淋巴细胞占47 4 表达CD3 cCD3 CD4 CD8 CD5 占比例47 4 表型符合T PLL 53 血管免疫母细胞淋巴瘤 AITCL CD4 CD2 CD5 CD10 CD26 CD7 CD3 常见T CLPD免疫表型 54 患者 丁XX 男 59 淋巴结 骨髓 结论 异常T淋巴细胞占78 抗原表达异常 CD3 CD4 CD7 CD10 CD2 CD5 提示T CLPD 55 外周T细胞淋巴瘤 PTCL 骨髓侵犯 CD4 多数CD7 and orCD5 常见T CLPD免疫表型 56 成人T细胞淋巴瘤 ATLL CD4 CD2 其他T系抗原可有缺失部分伴有髓系抗原表达 CD13 CD33 CD15外周血 多形核淋巴细胞确诊 HTLV 1基因阳性 常见T CLPD免疫表型 57 T LGLCD4 orCD8 伴有NK抗原表达CD16 CD57 部分CD56 形态学 大颗粒淋巴细胞 常见T CLPD免疫表型 58 TCRV 限制性表达1 包含24种抗体 两种荧光素 识别70 V 亚家族 2 在诊断和MRD监测中的作用 59 60 61 STRUCTUREOFTCELLRECEPTOR BecauseTCRisapartofCD3complex vbetaanalysiscannotbeusedforsurfaceCD3 negativeTcells 62 部分病例运用免疫标记物难以将恶性成熟T淋巴细胞从正常T淋巴细胞中精确鉴别 反应性或克隆性 原因 1 肿瘤细胞被反应性T细胞掩盖2 CD8 占优势群体还见于 V感染 AIDS EBV BMT后 临床特点对诊断更为重要 63 流式诊断NK细胞淋巴瘤 典型 CD2 CD16 CD56 CD122 CD3 没有特征性抗体区分肿瘤和反应性NK细胞 数量以及FSKIR KIRs CD94 NKG2 均一性表达KIR同种型 64 四 阵发性睡眠性血红蛋白尿 65 阵发性睡眠性血红蛋白尿症 PNH 糖基化磷脂酰肌醇锚 GPI 连接的锚连蛋白缺乏 补体介导的血管内溶血为特征的获得性造血干细胞克隆性疾病 磷脂酰肌醇聚糖A PIG A 基因突变 PIG A基因突变 对补体敏感性增高 溶血 锚连蛋白 补体调节蛋白CD55 CD59 CD16 CD24 CD14 Flaer等 66 样本收集 优先选择外周血 不推荐骨髓抗凝剂 EDTA 肝素RBC最多可存放至7天WBC必须在48小时内检测 粒细胞上的抗原表达和散射会随着时间而改变 CCS指南推荐对 2种细胞系进行检测 标本类型 抗凝剂 标本储存 67 常规检测 敏感度1 获取5000个目的细胞高敏检测 敏感度0 01 获取250 000个目的细胞中性粒细胞 必做红细胞 中性粒细胞检出PNH克隆时必做 或全部标本都做 但单独检测不推荐单核细胞 可提供稳定的结果淋巴细胞 不推荐 细胞获取 目的细胞 68 抗体的选择 仅检测CD55 CD59 不推荐敏感性 5 10 Sutherlandandal CytometryPartB72B 167 177 Flaer 组成高特异性的PNHPanel 69 红细胞分析 优点 与WBC相比 RBC检测能更好地鉴别II型细胞 缺点 输血和溶血会造成PNH克隆大小检测值偏低 单检测红细胞不能充分评估PNH I型 正常红细胞II型 CD59部分缺失的PNH克隆III型 CD59完全缺失的PNH克隆 70 同个患者的红细胞和粒细胞检测结果 粒细胞PNH克隆 54 5 红细胞PNH克隆 6 1 溶血 输血对PNH克隆大小的影响 71 红细胞分析 抗体选择和分析 CD59优于CD55CD59在红细胞上的表达水平远高于CD55结果分析 PNH细胞比较多时 适合使用直方图异常细胞数少时 适合使用散点图 同一个患者 CD59能区分出II型和III型细胞 CD55则不能 红细胞PNH克隆很少时 适合散点图分析 72 中性粒细胞和单核细胞都可以检测 不适宜采用淋巴细胞 白细胞分析 检测PNH克隆最好的方法 73 CD59 最早用于检测粒系PNH克隆的标记物FLAER 能和WBC上所有的GPI锚连蛋白特异性结合 当前成为最佳标记物CD14是表达在单核细胞上的GPI锚连蛋白 用于检测单核细胞的PNH克隆 CD24是表达在粒细胞上的GPI锚连蛋白 用于检测粒细胞的PNH克隆 白细胞分析 检测PNH克隆最好的方法 74 什么是FLAER FLAER FLuorescentAERo