TCB4-2植物细胞培养.pdf

植物细胞培养 与细胞工程 植物细胞培养 与细胞工程 愈伤组织愈伤组织 植物细胞培养和细胞工程的理论基础植物细胞培养和细胞工程的理论基础 细胞全能性学说细胞全能性学说 激素化控理论激素化控理论 细胞全能性认为 细胞全能性认为 植物的细胞具有发育为胚胎 和植株的潜能 植物的细胞具有发育为胚胎 和植株的潜能 不是所有的细胞都具有全能性 但许多类型的 细胞可以在离体培养条件下发育为胚状体 不是所有的细胞都具有全能性 但许多类型的 细胞可以在离体培养条件下发育为胚状体 把细胞全能性学说看作是细胞工程的理论基础 把细胞全能性学说看作是细胞工程的理论基础 1 通过细胞培养和植株再生可以将细胞遗传 修饰变成植物的遗传修饰 从而改变整个植株 的遗传特性 通过细胞培养和植株再生可以将细胞遗传 修饰变成植物的遗传修饰 从而改变整个植株 的遗传特性 2 利用植物细胞的大量培养的方法 在生物 反应器中生产有用的化合物 利用植物细胞的大量培养的方法 在生物 反应器中生产有用的化合物 胚性细胞 植物的干细胞胚性细胞 植物的干细胞 不是植物体内的每一个细胞都具有全能性 一般说来 高度分化或特化的细胞 已经失 去分裂和再生的能力 即使在离体培养的条 件下 也不可能发育成植株 不是植物体内的每一个细胞都具有全能性 一般说来 高度分化或特化的细胞 已经失 去分裂和再生的能力 即使在离体培养的条 件下 也不可能发育成植株 只有胚性细胞 只有胚性细胞 embryogenic cells 或或 embryonic cells 或分化程度不高的细胞才可 具备发育为胚胎或植株的全能性 或分化程度不高的细胞才可 具备发育为胚胎或植株的全能性 胚性细胞同胚胎干细胞基本相同 如被子植物 的合子 植物早期胚胎细胞及植物的分生组织 细胞 胚性细胞同胚胎干细胞基本相同 如被子植物 的合子 植物早期胚胎细胞及植物的分生组织 细胞 动物器官分化是一个有限的过程 在胚胎成熟 时器官的分化过程已完成 动物器官分化是一个有限的过程 在胚胎成熟 时器官的分化过程已完成 植物的器官分化是一个无限的过程 种子中的 胚胎萌发成苗后 在整个生活史中不断形成新 的器官 直到生命的终结 植物的连续的器官 分化是由顶端分生组织来完成的 可见它们是 一种具有全能性的细胞 植物的器官分化是一个无限的过程 种子中的 胚胎萌发成苗后 在整个生活史中不断形成新 的器官 直到生命的终结 植物的连续的器官 分化是由顶端分生组织来完成的 可见它们是 一种具有全能性的细胞 脱分化 脱分化 dedifferentiation 在离体培 养条件下 一个分化细胞转变为分生状 态 形成胚性细胞团或愈伤组织的现象 在离体培 养条件下 一个分化细胞转变为分生状 态 形成胚性细胞团或愈伤组织的现象 需要两个条件 创伤和外源激素需要两个条件 创伤和外源激素 再分化 再分化 redifferentiation 大多数 情况下 在愈伤组织细胞中发生 但在有 些情况下 可以直接发生于脱分化的细胞 中 无须经历愈伤组织阶段 大多数 情况下 在愈伤组织细胞中发生 但在有 些情况下 可以直接发生于脱分化的细胞 中 无须经历愈伤组织阶段 一 细胞脱分化过程的形态学 和生物化学变化 一 细胞脱分化过程的形态学 和生物化学变化 外植体 用于组织培养的组 织块 烟草叶肉细胞脱分化过程可 以概括为以下三个阶段 静止的叶肉细胞进行第一次 分裂 经过连续几次细胞分裂 叶 肉细胞转变为分生细胞 分生细胞形成愈伤组织 外植体 用于组织培养的组 织块 烟草叶肉细胞脱分化过程可 以概括为以下三个阶段 静止的叶肉细胞进行第一次 分裂 经过连续几次细胞分裂 叶 肉细胞转变为分生细胞 分生细胞形成愈伤组织 一个愈伤组织内大多为薄壁细胞 少量为分 生细胞 一个愈伤组织内大多为薄壁细胞 少量为分 生细胞 生长中心生长中心 包在内部 成为芯 子 仍保持分生状态 可不断分裂 生长 较快 出现少量的维管分子 管胞 伴胞 筛管 包在内部 成为芯 子 仍保持分生状态 可不断分裂 生长 较快 出现少量的维管分子 管胞 伴胞 筛管 维管结节维管结节 分生细胞的再分化与植株再生 分生细胞的再分化与植株再生 从分化细胞经过脱分化过程形成的分生细胞或分生细胞团可 以再分化形成胚胎或器官 然后发育为完整的植株 从分化细胞经过脱分化过程形成的分生细胞或分生细胞团可 以再分化形成胚胎或器官 然后发育为完整的植株 体细胞胚胎发生 体细胞胚胎发生 embyogenesis 离体培养的细胞在完成脱分化过程之后 在适当的诱导条件 下 能够通过体细胞胚胎发生过程产生体细胞胚或胚状体 离体条件下的体细胞胚胎发生过程最早是在胡萝卜中发现 的 研究比较详细的其他植物还有石龙芮 博落洄以及柑橘 属和咖啡属的一些物种 离体培养的细胞在完成脱分化过程之后 在适当的诱导条件 下 能够通过体细胞胚胎发生过程产生体细胞胚或胚状体 离体条件下的体细胞胚胎发生过程最早是在胡萝卜中发现 的 研究比较详细的其他植物还有石龙芮 博落洄以及柑橘 属和咖啡属的一些物种 器官发生 器官发生 organogenesis 离体培养的细胞脱分化后 形成再生植株的 另一条途径是器官发生 在一定的诱导条件 下 离体细胞或组织重建芽的分生组织 分 化出芽后再产生根 成为完整的植株 离体培养的细胞脱分化后 形成再生植株的 另一条途径是器官发生 在一定的诱导条件 下 离体细胞或组织重建芽的分生组织 分 化出芽后再产生根 成为完整的植株 有些离体细胞不能发育为完整植株 只能发 育为某种特定的器官 器官分化的模式和程 度主要 有些离体细胞不能发育为完整植株 只能发 育为某种特定的器官 器官分化的模式和程 度主要取决于供体细胞的生理状态的培养基 中外加激素的组成 取决于供体细胞的生理状态的培养基 中外加激素的组成 器官发生原因器官发生原因 细胞要分化出一个组织器官 则细胞间有一定的排列 顺序 这团细胞间存在相互制约 互相交流对换 细 胞间要对换必须有足够的紧密联系 细胞要分化出一个组织器官 则细胞间有一定的排列 顺序 这团细胞间存在相互制约 互相交流对换 细 胞间要对换必须有足够的紧密联系 松散型无相互制约 对换不容易 难以形成器官 相 反 可形成胚状体前体 因为胚状体发生是单细胞 少数为多细胞的 松散型无相互制约 对换不容易 难以形成器官 相 反 可形成胚状体前体 因为胚状体发生是单细胞 少数为多细胞的 使用的生长素对愈伤组织分化与否有关 诱导愈伤 时 生长素要量大 当降低生长素量时 会出现组织 化 使用的生长素对愈伤组织分化与否有关 诱导愈伤 时 生长素要量大 当降低生长素量时 会出现组织 化 2 4 D在愈伤形成时 不仅起启动细胞分裂作 用 而且起到抑制细胞间对话的作用 在愈伤形成时 不仅起启动细胞分裂作 用 而且起到抑制细胞间对话的作用 Hormones small organic molecules that serve as highly specific chemical signals between cells 1 Auxin生长素生长素 IAA Indole acetic acid 2 4D Dichlorophenoxy acid stimulates stem elongation root growth apical dominance development of fruit 延伸 根生长 顶端优势 发育 延伸 根生长 顶端优势 发育 2 Cytokinin细胞分裂素细胞分裂素 kinetin activation of cell division and regulation of plant growth cycle 分化 生长周期 分化 生长周期 3 Gibberellins赤霉素赤霉素 GA promotes elongation of internodes of various plants 节间延伸 节间延伸 4 Abscisic acid脱落酸脱落酸 ABA abscission of plant parts as they age 脱木质化 脱木质化 5 Ethylene乙烯乙烯 gas regulates plant development including aging and response to pathogen 老化和病菌 老化和病菌 外植体中外植体中Auxin cytokinin 植物生长素 植物生长素 细胞分裂素 的比例决定了植物细胞脱分化或再分化的水平和状态 细胞分裂素 的比例决定了植物细胞脱分化或再分化的水平和状态 通常通常 上述两种激素的比率决定植物的分化上述两种激素的比率决定植物的分化 Auxin Cytokinin 分化根 分化根 Cytokinin Auxin 分化芽分化芽 Auxin Cytokinin 分化愈伤分化愈伤 综上所述 综上所述 100年来对于植物细胞全能性的研究经 历了理论假设 组织培养试验证明 细胞生物学观 测和分子生物学机理探讨等发展阶段 这方面的试 验研究使得上千种的植物的细胞可以在人工培养条 件下发育为器官 胚胎和植株 从而为细胞工程研 究和应用奠定了坚实的基础 年来对于植物细胞全能性的研究经 历了理论假设 组织培养试验证明 细胞生物学观 测和分子生物学机理探讨等发展阶段 这方面的试 验研究使得上千种的植物的细胞可以在人工培养条 件下发育为器官 胚胎和植株 从而为细胞工程研 究和应用奠定了坚实的基础 现在我们不仅可以通过培养离体细胞或组织实现种 苗大量繁殖和生产有用的次生代谢产物 而且能够 对细胞进行遗传操作 达到培育新品种的目的 使 细胞工程成为改良植物的有力手段 现在我们不仅可以通过培养离体细胞或组织实现种 苗大量繁殖和生产有用的次生代谢产物 而且能够 对细胞进行遗传操作 达到培育新品种的目的 使 细胞工程成为改良植物的有力手段 5 原生质体培养 原生质体培养 Protoplast culture 脱壁后的植物细胞 称为原生质体 脱壁后的植物细胞 称为原生质体 protoplast 其特点是 比较容易摄取外来的遗传 物质 如 其特点是 比较容易摄取外来的遗传 物质 如DNA 便于进行细胞融合 形成杂交细胞 与完整细胞 一样具有全能性 仍可产生细胞壁 经诱导分化成完整植株 便于进行细胞融合 形成杂交细胞 与完整细胞 一样具有全能性 仍可产生细胞壁 经诱导分化成完整植株 培养基母液的配制培养基母液的配制 培养基母液的配制一般用蒸馏水 用于茎 尖分生组织培养用的培养基母液 特别是 一些激素和有机物母液 在有条件的单位 最好用重蒸馏水或无离子水配制 培养基母液的配制一般用蒸馏水 用于茎 尖分生组织培养用的培养基母液 特别是 一些激素和有机物母液 在有条件的单位 最好用重蒸馏水或无离子水配制 下面以下面以MS培养基为例 详细介绍各种母液 的制备 培养基为例 详细介绍各种母液 的制备 MS基本培养基大量元素母液配制基本培养基大量元素母液配制 大量元素 元素用量相对较大 可以以每 种试剂单独配制成母液 配制时以 大量元素 元素用量相对较大 可以以每 种试剂单独配制成母液 配制时以100倍的 用量分别称出并分别进行溶解定容 制备 培养基时每升培养基取每种母液 倍的 用量分别称出并分别进行溶解定容 制备 培养基时每升培养基取每种母液10 ml MS 培养基大量元素母液配制培养基大量元素母液配制 44440CaCl2 2H20 Ca 17170KH2PO4P 37370 MgSO4Mg 1651650 NH4NO3NH4 1010001901900KNO3K 每升培养基 用母液量 毫升 蒸馏水 定容 毫升 母液含量 克 培养基 含量 毫克 每升培养基 用母液量 毫升 蒸馏水 定容 毫升 母液含量 克 培养基 含量 毫克 升 试剂 母液 代号 母液配制 升 试剂 母液 代号 母液配制MS培养基培养基 MS基本培养基大量元素母液配制基本培养基大量元素母液配制 MS基本培养基微量元素母液配制基本培养基微量元素母液配制 2 51 2 5 CoCl2 6H20 2 51 2 5CuSO4 5H20 2 51025NaMoO4 2H2O 8 31083KI 62 010620H3BO3 8 6100 860ZnSO4 7H2O 10100022 31002230MnSO4 4H2OB 每升培养基 用母液量 毫升 蒸馏水定容 毫升 母液用量 毫升 母液浓度 毫克 每升培养基 用母液量 毫升 蒸馏水定容 毫升 母液用量 毫升 母液浓度 毫克 毫升 培养基含量 毫克毫升 培养基含量 毫克 升 试剂 母液 代号 母液配制 升 试剂 母液 代号 母液配制MS培养基培养基 MS基本培养基铁盐母液配制基本培养基铁盐母液配制 2 780FeSO4 7H20 53 730Na2 EDTAFe 每升培养基 用母液量 毫升 母液称量 克 培养基含量 毫克 每升培养基 用母液量 毫升 母液称量 克 培养基含量 毫克 升 试剂 母液 代号 母液配制 升 试剂 母液 代号 母液配制MS培养基培养基 MS基本培养基有机物母液配制 10000100肌醇肌醇 500 5烟酸烟酸 500 5盐酸比哆素盐酸比哆素 400 4盐酸噻胺盐酸噻胺 1010002002 0甘氨酸甘氨酸C 每升培养基 用母液量 毫升 蒸馏水定容 毫升 母液称量 克 培养基含量 毫克 每升培养基 用母液量 毫升 蒸馏水定容 毫升 母液称量 克 培养基含量 毫克 升 试剂 母液 代号 母液配制 升 试剂 母液 代号 母液配制MS培养基培养基 影响植物组织培养的因素影响植物组织培养的因素 Growth media Minerals growth factors carbon source hormones 环境因素环境因素 Light temperature photoperiod sterility media 外植体的来源外植体的来源 Usually the younger less differentiated the explant the better for tissue culture 遗传遗传 Different species show differences in amenability to tissue culture In many cases different genotypes within a species will have variable responses to tissue culture Response to somatic embryogenesis has been transferred between melon cultivars through sexual hybridization 组织培养的应用组织培养的应用 Micropropagation 微组织繁殖法 快速繁殖 微组织繁殖法 快速繁殖 种质保存 种质保存 Germplasm preservation Somaclonal variation mutation selection 胚培养 胚培养 Embryo Culture 单倍体 单倍体 Haploid Dihaploid Production 体细胞杂交 原生质体融合 体细胞杂交 原生质体融合 In vitro hybridization Protoplast Fusion Industrial Products from Cell Cultures One Last Role of Plant Tissue Culture Genetic engineering would not be possible without the development of plant tissue Genetic engineering requires the regeneration of whole plants from single cells Efficient regeneration systems are required for commercial success of genetically engineered products MS培养基是培养基是1962年穆拉希吉克 年穆拉希吉克 Murashige 和斯科克 和斯科克 Skoog 为培养菸草材料而设计的 它对在固 体培养条件下诱导愈伤组织 在液体培养条件下作细胞悬浮培养及用于胚 茎尖 茎段及花药等的培养和 形态发生研究方面 均获得了明显的成功 为培养菸草材料而设计的 它对在固 体培养条件下诱导愈伤组织 在液体培养条件下作细胞悬浮培养及用于胚 茎尖 茎段及花药等的培养和 形态发生研究方面 均获得了明显的成功 MS培养基中无机养份的数量和比例均较合适 可以满足很多 植物细胞在营养和生理上的需要 与其他培养基的基本成分相比 培养基中无机养份的数量和比例均较合适 可以满足很多 植物细胞在营养和生理上的需要 与其他培养基的基本成分相比 MS培养基中的硝酸盐 钾和铵的含量高 这也是它的显著特点 与培养基中的硝酸盐 钾和铵的含量高 这也是它的显著特点 与MS培 养基较为接近的 还有 培 养基较为接近的 还有LS Linsmaier和和Skoog 1965 培养基及 培养基及RM 田中 田中 1964 培养