代谢副产物对L-苏氨酸发酵的影响及应对措施.pdf

代谢副产物对 L 一 苏氨酸发酵的影响及应对措施 冯志彬 徐庆阳 陈宁 天津科技大学生物工程学院 天津工业微生物重点实验室 天津 3 0 0 2 2 2 摘要研究了L 苏氨酸的发酵过程 通过高效液相色谱和氨基酸分析仪测定了L 苏氨酸发酵液中的主要副 产物为乙酸 乳酸 撷氨酸 天冬氨酸 丙氨酸等 利用外源添加实验研究了各种代谢副产物对L 苏氨酸发酵的 影响 结果表明乙 酸浓度高于2 g L 乳酸浓度高于1 0 g L时对L 一 苏氮酸生产菌的生长和产酸有抑制作用 采 用提高溶解氧和菊萄糖限制性脉冲流加措施将乙酸 乳酸的浓度控制在0 5 g L以下 L 一 苏氨酸产量明显提高 关键词代谢副产物 L 一 苏氨酸 溶氧 乙酸 L 苏氨酸是人与动物体内所必需的一种氨基 酸 具有恢复体力 促进生长发育的效果 自身不能合 成 必须从食物中摄取 在人和动物所需的8种限制 性氨基酸中 苏氨酸是仅次于蛋氨酸 赖氨酸 色氨酸 的第 4 种氨基酸 在大多数植物蛋白饲料中 苏氨酸 是第 2 或第 3 限制性氨基酸 是重要的营养强化剂 另外 对抗溃疡 防辐射 对催眠 镇静等有较好效 果川 微生物发酵法生产L 苏氨酸是目 前主要的工 业生产方法 2 7 o L 苏氨酸生产菌在发酵产生L 一 苏氨 酸的同时还会生成乙酸 乳酸 领氨酸 丙氨酸 天冬 氨酸等代谢副产物 在一定程度上影响菌体生长及 L 苏氨酸产量 3 文中分析了各种代谢副产物对 L 苏氨酸发酵的影响 确定改善溶氧条件和葡萄糖限制 流加为控制乙酸 乳酸等有害代谢副产物的有效手 段 此外 将乙酸 乳酸的产生和溶氧参数进行关联 利用溶氧指标监控有害代谢产物的产生 建立高效生 产L 苏氨酸的发酵调控工艺 3 7 0C 以泡敌消泡 发酵到一定时间流加补料液 定 时取样测定各项参数 1 3 分析方法 菌体浓度测定 吸取样品菌液 用蒸馏水稀释 以 蒸馏水作为空白对照 采用 7 5 2 分光光度计于 1 c m 光程测定 D s o o n m 将发酵液离心洗涤 2 次 收集菌 泥 1 0 0 c 烘干至恒重 测定细菌干重 5 1 还原糖 采用 3 5 一 二硝基水杨酸法 有机酸含量 采用高效液相色谱仪测定 氨基酸含量 采用 E l i t e A A A氨基酸分析系统 测定 2 结果与讨论 2 1 I r 苏氮酸发酵过程分析 在 1 0 L自控发酵罐上进行补料分批发酵 每隔4 h 测定菌体生物量 L 一 苏氨酸产量和溶氧值等参数 结果如图 1 所示 一山 妙嘲潭州 050tJO 叱八22 1 为0 阴即阅叨2 0 更屏边 乙 妙翻戚橇告 1 材料与方法 1 1 菌种及培养基 见参考文献 4 0 1 2 培养方法 种子培养 吸取适量无菌生理盐水于 1 支活化斜 面中 将所有菌悬液全部接人 5 L种子罐中 搅拌转 速3 0 0 7 0 0 r m i n 通过自 动流加氨水控制 p H在 7 0 培养温度3 7 0C 1 0 L罐发酵 按 1 接种量将种子液接入 1 0 L 发酵罐中 初始通风量 2 L m i n 搅拌转速 5 0 0 8 0 0 r m i n 通过自 动流加氨水控制 p H在 7 0 培养温度 0 4 8 1 22 8 3 2 3 6 4 0 一 L 苏氨酸 1 6 2 0 2 4 发酵时间 h 月 溶氧 卜 生物量 第一作者 硕士研究生 陈宁教授为通讯作者 收稿日期 2 0 0 6 1 1 1 7 图1 L 一 苏氨酸发酵过程曲线 由图 1 可知 L 一 苏氨酸发酵可分为 4 个阶段 前 6 h 主要为菌体生长阶段 菌体生长缓慢 对氧需求 较低 6 v 2 0 h 为菌体生长及产物合成阶段 菌体增 殖迅速 产物大量合成 溶氧急剧下降 在 1 8 h 左右 溶氧接近 点 2 0 h以后菌体增殖速度放慢 产物仍 继续合成 溶氧稳定在 5 左右 3 2 h 后溶氧值逐步 3 2 2 0 0 7 V o l 3 3 N o 6 T o t a l 2 3 4 口d 几b 八 6lU 乃JtIJ4njA工 9J 回升 表明菌体已处于衰亡期 呼吸作用不再旺盛 就整个发酵过程来看 菌体生长量不足 利用高 效液相和氨基酸分析仪分别测定发酵液中有机酸和 氨基酸副产物含量 结果如图2 所示 的人为添加浓度 表 1 乙酸添加方式 乙酸对L 一 苏氮酸发酵的影响 生物量L苏氨酸残糖 g L g L g L 发酵周期 h 一 乙酸 卜乳酸 一 奋 一 撷氨酸 卜丙氨酸 州 十天冬氨酸 不添加 O h 2 g L O h 5 g L 1 5 h 2 g L 1 5 h 5 g L 0 4 0 8 山6 1 5 1 0 1 2 81 6 发酵时间 2 2 2 乳酸的影响 分别在发酵初期和发酵 1 5 h 后向发酵培养基中 添加 5 g L和1 0 g L的乳酸 考察对菌体生长和 L 苏氨酸产量的影响 结果如表 2 所示 表2 乳酸对L 一 苏氮酸发酵的影响 64q刁q一10 向 潭戈赢蒸军 q白 3 24山 乳酸添加方式 生物量 9 L L 一苏氨酸残糖 g L g L 发酵周期 h 卜日已J门二 内b内b月1内b 勺dgd勺d J 8 8 6 8 7 9 8 0 3 一 8 一9 6 一 内匕J任nnC八 八合od六乙勺d 9自几乙宁自Q自 图2 发酵副产物积累曲线 测定结果表明 乙酸 乳酸 撷氨酸 天冬氨酸 丙 氨酸为L 一 苏氨酸发酵液中的主要副产物 乙酸一般 在 2 种情况下产生 设备的供氧能力不足使工程菌的 呼吸受到限制或葡萄糖的摄入速率大于工程菌 T C A 循环的周转能力 在这 2 种情况下都会导致底物通 过乙酞磷酸途径转化为乙酸 3 由图2 可知 乙酸大 约在 1 6h开始积累 在 2 4 h达到最大值点 1 9 g L 2 4 h 后部分被菌体重新利用并有所下降 但利用水 平较低 结合图 1 乳酸和撷氨酸主要在供氧不足的 情况下产生 随着溶氧值的回升 乳酸可以被菌体重 新利用 撷氨酸浓度则不再增加 2 2 代谢副产物对L 一 苏氨酸发酵的影响 由图2 可知 乙酸 乳酸 撷氨酸 天冬氨酸 丙氨 酸在发酵液中达到的最高浓度分别为1 9 g L 6 7 g L 3 2 g L 0 9 g L 2 3 g L 以此为基准设计 实验 分别考察实验条件对L 一 苏氨酸发酵的影响 2 2 1 乙酸的影响 分别在发酵初期和发酵 1 5h 后向发酵培养基中 添加2 g L和5 g L的乙酸 考察对菌体生长和L 一 苏 氨酸产量的影响 结果如表 1 所示 由表 1 可知 乙 酸对L 一 苏氨酸的发酵具有明显的抑制作用 0h 添加 较1 5 h 添加抑制作用为强 且随浓度升高抑制作用 加强 添加量为2 g L 0 h 及 1 5 h 添加分别使L 一 苏 氨酸产量下降了1 7 7 和8 7 0 0 这可能是发酵初期 菌体浓度较低 生长较弱 对乙酸的耐受能力较差 0 h 添加5 g L的乙酸 生物量和L 一 苏氨酸产量分别只 有1 6 1 g L和6 3 2 g L 相比对照组分别下降了 1 6 8 和2 7 9 0 o 另外发酵周期延长4 h 但在现实 生产中发酵初期设备提供的溶氧条件完全可以满足 菌体呼吸需要 故乙酸的生成量不会达到2 g L以上 不添加 O h 5 g L O h 1 0 g L 1 5 h 5 g L 1 5 h l O g L 1 0 3 7 0 由表 2 可知 相对于乙酸 乳酸对 L 一 苏氨酸生产 菌的影响不大 添加量在 5 g L左右时未见有明显 影响 如在发酵 1 5 h 时添加5 g L的乳酸 8 0 m i n 后 检测其浓度已降低至 0 5 6 g L 培养环境中溶氧值 妻1 0 0 0 说明乳酸在有氧情况下可作为碳源被菌体 正常利用 当添加量大于 1 0 g L时抑制作用较强 2 2 3 副产物氨基酸的影响 在发酵液中检测到的3种副产物氨基酸的量属 正常分泌范围 5 1 经验证对L 一 苏氨酸发酵无影响 但 提高培养环境的溶氧值可以降低撷氨酸的生成量 2 3 改善溶氧条件减少副产物生成 L 一 苏氨酸生产菌对氧需求旺盛 溶氧过低将会导 致生产菌的代谢异常并造成副产物的过量积累 其中 部分代谢副产物如乙酸 乳酸对 L 苏氨酸生产菌的 生长及目的产物的合成有抑制作用 2 3 1 转速 5 对溶氧的影响 3 由图3 可知 转速越高溶氧效果越好 当转速为 7 0 0 r m i n 时 最低溶氧值可在 5 以上 但并不是搅 拌越高越好 过高的搅拌速度产生了很强的剪切力 对细胞有一定的损害作用并影响产物的合成 当转速 高于7 0 0 r m i n时 动耗加大但未见溶氧有明显的提 升 镜检发现有细胞碎片 另外由于部分细胞的破碎 内容物泄漏 造成发酵液粘稠 不利于溶氧条件的改 善 2 2 2 通气量对溶氧条件的影响 5 1 2 0 0 7 年第3 3 卷第6 期 总第2 3 4 期 3 3 1 oo 8 0 3 0 0 r mi n t 5 r mi n 一 泊尸7 0 h mi n 一 8 0 0 r mi n 2 4 葡萄糖限制流加减少副产物生成 当L 一 苏氨酸生产菌的比摄糖速率超过一定的临 界值时 即使供氧充足也会产生乙酸 这是因为葡萄 糖的摄人速率大于 T C A循环的周转能力而使中间 产物乙酞辅酶 A通过乙酞磷酸途径产生乙酸 控制 葡萄糖的流加速率可把菌体的比生长率和发酵液中 的葡萄糖浓度控制在一定的阀值内 避免乙酸的产 生 2 4 1 最佳葡萄糖维持浓度的确定 控制葡萄糖的摄人速率略低于或等于T C A循 环的周转能力 避免副产物乙酸的产生 发酵液中残 糖的维持浓度至关重要 分别维持发酵液中残糖浓 度在2 g L 5 g L 1 0 g L和1 5 g L 测定发酵高峰 期最低溶氧值及在最低溶氧时发酵液中乙酸浓度和 发酵结束时生物量和 L 一 苏氨酸的产量 结果如表 4 所示 表4 葡萄箱浓度对L 一 苏氮酸发酵的影响 阅如 索 屏胜 8 1 6 2 0 2 4 3 2 3 6联 发酵时间爪 图3 转速对溶氧的影响 由图4 可见 3 v v m为最佳通气量 1 仪 8 0 团4 j 李 屏边 0 8 1 6 2 0 2 4 3 2 4 0 发醉时间 h 残糖 g L L 一 苏氨酸 g L 1 生物量乙酸 图4 通气量对溶氧的影响 g L 1 g L 2 9 0 1 21 8 0 2 2 3 3 p H值的影响 L 一 苏氨酸生产菌生长的最适 p H为7 0 菌体呼 吸作用最为旺盛 6 1 调整p H略偏离最适值 放慢菌 体的生长速率及对氧的需求量 在发酵的高峰期亦可 获得较好的溶氧效果 试验结果如表 3 所示 表3 对L 苏氨酸发酵的影响 1 0 4 9 6 2 4 0 2 4 6 2 4 9 一 L 苏氨酸 9 L 3 生物量 9 L DOMI N 乙酸乳酸 g L 1 g L 由表3 可知 L 一 苏氨酸生产菌在 p H 7 时生物 量为2 4 3 g L 高于在其他 p H条件下获得的生物 量 p H 7 0 的培养环境适于菌体生长 前期菌体生 长速率较快 对氧需求最高 由于设备条件的限制 在 发酵高峰期溶氧值偏低 代谢发生异常 基质中的碳 代谢流流向对氧需求较低的代谢支路 如乙酸 乳酸 和撷氨酸的生成量较高 而乙酸 乳酸的过量积累会 抑制菌体苏氨酸合成酶系的活力 造成产酸水平不 高 在p H 6 5 的培养情况下生物量虽然略低但副产 物生成较少 L 一 苏氨酸产量反而偏高 这说明在溶氧 受限的情况下调低p H有利于L 一 苏氨酸发酵的正常 进行 L 一 苏氨酸生产菌在低的葡萄糖浓度下生长速率 受限 当有葡萄糖补人时 生产菌的比摄糖速率增加 比摄氧速率也随之增加 溶氧值相应降低 补料过后 随葡萄糖浓度的降低 生产菌的比摄糖率下降 溶氧 值升高 但如果葡萄糖浓度过高 L 一 苏氨酸生产菌的 摄糖速率超过 T C A循环的周转能力时 涌向 T C A 循环的代谢流向乙酞磷酸途径溢流而产生乙酸 摄氧 能力饱和 溶氧水平较低且不随补料而振荡 3 由表 4 可知 残糖浓度在2 g L时溶氧水平虽然较高且乙 酸生成量少 但L 一 苏氨酸生产菌处于饥饿状态 生物 量和L 一 苏氨酸产量偏低 残糖浓度高于 1 0 g L时 整体溶氧水平偏低 乙酸生成量多且溶氧不随葡萄糖 的补人而振荡变化 当残糖浓度控制在5 g L时 发 酵高峰期溶氧值可维持 2 0 左右浓度 并随葡萄糖 的补人呈现节律性振荡 振幅为5 左右 即1 5 0 o 镇 高峰期溶氧 2 5 o a 由此可见 维持 5 g L的残糖 浓度既可维持较高的溶氧水平减少副产物乙酸的生 成 又可以根据溶氧的振荡情况对残糖浓度进行预测 并及时调整补料速率 2 4 2 脉冲周期的确定 3 4 2 0 0 7 V o l 3 3 N o 6 T o t a l 2 3 4 在流加培养过程中可以根据微生物细胞的需要 补充葡萄糖等营养成分并控制适宜的浓度 从而显著 提高营养物及能量代谢的利用率 减少甚至消除副产 物的生成和积累 有效解决营养物质耗竭和代谢副产 物积累的矛盾 提高细胞培养的经济性川 残糖浓度 维持在较低水平时菌体在较短时间内利用发酵液中 的糖份而处于饥饿状态 因而要求补料系统能够迅速 补人菌体消耗的糖分 本文采用脉冲方式补料 补料 液浓度为7 0 0 o 每次脉冲补人的糖液为1 m L 在 1 0 L 自 控发酵罐上进行补料分批发酵 确定脉冲流加的 控制周期 和乳酸所达到的最大浓度均低于0 5 g L 且能够很 快被菌体重新分解利用 表 5 三批补料分批发酵实验结果 批次 L 一 苏氨酸 g L 生物量 g L 发酵周期 h 1 1 0 1 1 2 3 2 3 8 L 4 33 6 538 3 1 1 8 2 5 6 3 7 3 结论 一2 5 s 脉冲 胡5 脉冲 r 9 0 s 脉冲 耳 654 刁21J0 一 二 已 卿铃暇越礼五 0 4 8 1 2 1 6 1 8 2 0 2 2 2 4 2 8 3 2 3 6 4 0 发酵时间爪 图5 脉冲周期对比产酸率的影响 由图5 可知 1 5 2 0 h 发酵高峰期 菌体快速增 殖 对氧需求旺盛 L 一 苏氨酸的平均比产酸率在整个 发酵过程中最高 耗糖耗碱速度较快 采用 2 5 s 的 脉冲周期 补人的糖量刚好满足菌体生长及产酸需 求 发酵液中残糖基本保持在 5 g L 当脉冲周期大 于2 5 s 补糖速率不能满足菌体需求 多次出现葡萄 糖耗竭现象 溶氧波动较大 2 0 2 6 h 菌体处于生长稳定期 增殖缓慢 摄入 的葡萄糖基本用于产酸 比耗糖速率及比产酸速率较 1 5 2 0 h已有所下降 采用 2 5 s 脉冲会出现糖过量 现象 取样检测乙酸含量较其他脉冲周期为高 4 0 s 脉冲对残糖 乙酸浓度控制较为理想 2 6 h 至发酵结束 菌体生长基本停止 产物合成 酶系活力衰退较快 耗糖速率进一步降低 9 0 s 左右 的脉冲周期较为合理 根据以上实验结果 在 1 0 L发酵罐上进行 3 批 补料分批发酵 实验条件为 转速 7 0 0 r m i n 通气量 为3 v v m 残糖浓度0 5 g L 初糖耗尽后进行脉冲流 加 1 4 2 0 h脉冲周期 2 5 s 2 0 2 6 h 脉冲周期4 0 s 2 6 h 至发酵结束脉冲周期 9 0 s 结果如表5 所示 由表5 可知 3 批发酵试验L 一 苏氨酸的产量均稳 定在 1 1 0 g L以上 最高产量可达 1 1 8 g L 生物量 较初始条件有很大提高 在培养过程中取样检测乙酸 1 利用高效液相色谱和氨基酸分析仪测定了 L 一 苏氨酸发酵液中的主要代谢副产物 结果表明 乙 酸 乳酸 撷氨酸 天冬氨酸和丙氨酸含量较高 2 研究了各副产物成分对 L 一 苏氨酸发酵的影 响 结果显示乙酸和乳酸浓度分别高于 2 g L和 1 0 g L时对L 一 苏氨酸生产菌存在抑制作用 3 分析了副产物生成的原因 发现溶氧和葡萄 糖浓度影响较大 通过调整发酵控制系统的转速和 通气量 降低发酵液的p H等措施提高了培养系统的 溶氧值 采用葡萄糖限制性脉冲流加方式使乙酸 乳 酸等有害副产物降低至极低的水平 解除了对发酵的 抑制作用 参考文献 D e b a b o v V G T h e t h r e o n i n e s t o r y J A d v B i o c h e m E n g B i o t e c h n o l 2 0 0 3 7 9 1 1 3 一1 3 6 Y a n g H o o n K I M J i n S e u n g P A R K J a e Y o n g C H O O P r o t e o mi c r e s p o n s e a n a l y s i s o f a t h r e o n i n e o v e r p r o d u c i n g m u t a n t o f E s c h e r i c h i a c o l i J B i o c h e m 2 0 0 4 3 8 1 8 2 3 一 8 2 9 郑志永 姚善径 应用溶氧反馈控制高密度培养大肠杆菌 过程中乙酸的产生 J 高校化学工程学报 2 0 0 6 2 0 2 2 3 3 2 3 8 冯志彬 孙玉华 陈宁 等 碳源对 L 一 苏氨酸发酵的研究 J 食品与发酵工业 2 0 0 6 3 2 8 1 5 1 7 成霞 刘登如 陈坚 等 高产量 高分子量透明质酸发酵条 件优化 J 过程工程学报 2 0 0 6 6 5 8 1 3 Ma n Hy o L e e Ho n g We o n L e e J i n H o P a r k e t a l I m p r o v e d L T h r e o n i n e P r o d u c t i o n o f E s c h e r i c h