保健食品用乳酸菌评价.docx

保健食品用乳酸菌评价前言本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准技术指标参照ISO 27205 IDF 149：2010用于发酵乳制品的细菌发酵剂中的技术指标。本标准由 提出。本标准由 归口。本标准起草单位：山东宝来利来生物工程股份有限公司、本标准主要起草人：保健食品加工用乳酸菌评价1范围 本标准规定了保健食品加工用乳酸菌的术语和定义、分类、要求、试验方法、检验规则和标志、包装、运输、贮存。本标准适用于以适宜的发酵用营养物质接种乳酸菌种，经发酵培养，浓缩等工艺制成的，用于乳及乳制品、肉制品、饮料、泡菜发酵及发酵剂以外的保健食品加工用乳酸菌。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。GB/T 191 包装储运图示标志GB/T 601 化学试剂标准滴定溶液的制备GB/T 602 化学试剂杂质测定用标准溶液的制备GB/T 603 化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备GB 4789.4 食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验GB 4789.10 食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验GB 4789.15 食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数GB 4789.30食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏检验GB 4789.35 食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验GB/T 6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法GB 7718 预包装食品标签通则SN/T 0738 出口食品中肠杆菌科检验方法3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1 乳酸菌（LAB）Lactic acid bacterium (LAB)能使糖发酵、并产生大量乳酸的细菌的通称，不能液化明胶、也不产生吲哚、呈格兰氏阳性、无运动、无芽孢、触酶阴性反应、硝酸还原酶阴性反应和细胞色素氧化酶阴性反应的细菌。注：本标准中所涉及的乳酸菌是食品加工业重要的食品原料，主要包括乳杆菌属（Lactobacillus）、双歧杆菌属（Bifidobacterium）、链球菌属（Streptococcus）、乳球菌属（Lactococcus）、明串珠菌属（Leuconostoc）和片球菌属（Pediococcus）等。4 分类4.1按菌种类型和菌株数分为：单菌株乳酸菌：只含有一种明确菌株的乳酸菌产品；单菌种多菌株乳酸菌：含有一株以上属于同一种的乳酸菌产品；多菌种乳酸菌：含有一个种以上的乳酸菌产品。4.2按使用温度分为：嗜温乳酸菌：使用温度在1837的乳酸菌产品；嗜热乳酸菌：使用温度在3045的乳酸菌产品。4.3 按物理形态分为：液体：以液体形式存在的乳酸菌产品；冷冻：以深度冷冻形式存在的乳酸菌产品；干燥：经冷冻或低温喷雾等方式以干燥形式存在的乳酸菌产品。5 要求5.1 乳酸菌种菌种除符合国家或行业相关规定外，还应符合表1规定。表1 菌种要求项目菌种要求属、种、株的鉴定鉴定到株表型实验基因分型实验安全性实验5.2 感官感官应符合表2规定。表2 感官要求项目要求液体冷冻干燥色泽白色至棕色气味具有乳酸菌特殊气味，无腐败，无异臭组织状态混悬液，可有沉淀不规则冻状固体粉末或颗粒杂质无肉眼可见异物5.3 理化理化要求应符合表3的规定。表3理化要求项目保健食品用液体冷冻干燥产酸能力/（h或pH）符合产品标称发酵酸度（以乳酸计）/%符合产品标称产过氧化氢能力符合产品标称产细菌素能力符合产品标称抗氧化能力符合产品标称对胃酸和胆盐的耐受性符合产品标称粘膜的黏附性或人上皮细胞的黏附性符合产品标称对条件致病菌的抗菌活性符合产品标称5.4 微生物5.4.1 乳酸菌微生物应符合表4的规定。表4 乳酸菌微生物要求项目保健食品用液体冷冻干燥乳酸菌活菌数/（CFU/g或CFU/mL）108注：乳酸菌活菌数是保质期内应达到的活菌数。5.4.2 其他微生物应符合表5的规定。表5 其他微生物要求项目保健食品用液体冷冻干燥酵母和霉菌/（CFU/g）1110肠杆菌科/（CFU/g）1110金黄色葡萄球菌/g不应检出沙门氏菌/g不应检出单核细胞增生李斯特氏菌/g不应检出是不是不用分液体、冷冻和干燥，直接是菌粉5.5 保健功能要求应符合表6的规定。表6 保健功能要求项目保健食品用液体冷冻干燥调节肠道菌群a具有提高免疫力b具有注：具有a或b中一项保健功能即可。6 试验方法本标准所用试剂和水,在没有注明其他要求时,均指分析纯试剂和符合GB/T 6682-2008规定的三级水。试验中所用溶液在未注明用何种溶剂配制时，均指水溶液。6.1 菌种鉴定6.1.1 16S rDNA序列同源性的鉴定方法6.1.1.1 原理 核糖体RNA（rRNA）等保守性生物大分子广泛存在于生物细胞中，功能稳定，核酸序列中既有高度保守区又有可变区，因此可利用这些序列的信息对细菌进行鉴定和分类学研究。16S rDNA是16S rRNA 的基因，长约1.5kb。利用细菌域的通用引物扩增16S rRNA基因，序列测序后，输入GenBank中进行同源性分析，判定某个分类单位在系统发育树上的分类级别。6.1.1.2 试剂和溶液1 TE溶液：10mmol/L Tris-HCl（pH8.0）、1mmol/L EDTA（pH8.0）。2 STE溶液：0.1mol/LNaCl、10mmol/L Tris-HCl （pH8.0）、1mmol/L EDTA（pH8.0）。3 溶菌酶储液：用水配制成50mg/mL的溶菌酶储液，分装成小份并保存于-20度。4 20%十二烷基硫酸钠（SDS）：在800mL水中溶解200g电泳级SDS，加热至68度助溶，加入几滴浓盐酸调节溶液的pH至7.2，加水定容至1L，分装备用。5 5moL/L高氯酸钠。6 氯仿：异戊醇（24：1）。7无水乙醇。8 3mol/L的乙酸钠（pH5.2）：在800mL水中溶解408.1g三水乙酸钠，用冰醋酸调pH至5.2，加水定容到1L，分装后高压灭菌。9 1Tris-乙酸（TAE）电泳缓冲液：40mmol/LTris-乙酸、1mmol/LEDTA，pH8.0。10 LB 液体或固体培养基。6.1.1.3 分析步骤1 菌体收集培养 将待鉴定菌在15mL适宜的培养基和生长温度下培养至对数生长后期，12000r/min离心5min，收集菌体。2 DNA提取 用细菌基因组DNA提取试剂盒。3 以提取的细菌基因组DNA为模板，PCR（聚合酶链式反应）扩增16S rDNA 细菌域的16SrDNA基因扩增的通用引物27F（5-AGAGTTTGATCC/ATGGCTCAG-3）和1541R（5-AAGGAGGTGATCCAG-3）分别位于大肠杆菌的16SrDNA的827位和15251541位核苷酸。PCR的反应体系为25L：模板DNA （大约80ng），100umol/L dNTP，1.5mmol/LMgCl2，正向和反向引物各0.4umol/L和1UTaq DNA聚合酶。PCR过程为95预变性5min后，进行下述30个循环：94变性30s，55退火1min；72延伸1.5min，最后72保温10min。4保存。PCR结束后，取2LPCR产物在1%（m/V）琼脂糖凝胶中电泳。电泳缓冲液为1TAE。电泳结束后，用0.5ug/g溴化乙啶溶液对凝胶染色10min，回收溴化乙啶溶液，用蒸馏水冲洗凝胶后，在紫外灯下观察。如果PCR扩增成功，则可见到相应大小为1.5kb的条带。4 16S rDNA PCR扩增产物的纯化浓缩16S rDNA的PCR产物：16S rDNA的PCR产物中加入1/10体积的3mol/L乙酸钠（pH5.2）和2倍体积的无水乙醇，混匀后置于-20度30min。12000r/min离心10min，弃上清液。自然晾干，加入15ul无菌双蒸水溶解DNA沉淀。利用商品化的DNA回收试剂盒对浓缩后的PCR产物进行回收。5 16S rDNA PCR扩增产物的克隆和测序 送去上海生工测序。6 16S rDNA 序列同源性分析及结果鉴定 将测得的16S rDNA长度约为500bp的部分序列提交到GenBank，使用Blast程序来寻找与其有最大同源性的序列如果两者之间的16S rDNA同源性大于97.5%，则可认为它们属于同一个种。6.1.2表型实验（1）糖发酵的生化反应（2）葡萄糖发酵终产物6.1.3基因分型实验6.1.3.1全基因组DNA脉冲场凝胶电泳（PFGE）的鉴定方法 按郭兴华主编的乳酸细菌现代研究实验技术中的操作进行。6.1.3.1.1 原理凝胶上至少有两个电场方向，时间与电流大小也交替改变，使得DNA分子能够不断地调整泳动方向，以适应凝胶中不规则的空隙变化，达到分离大分子线形DNA的目的。方法选用切割点较少的限制性内切核酸酶消化基因组DNA，产生的片段为1080kb，条带数目520个，易于对比和分析。6.1.3.1.2 试剂和溶液6.1.3.1.2.1 重悬缓冲液：10mmol/L Tris碱，20mmol/L NaCl，50mmol/LEDTA（pH7.2）。6.1.3.1.2.2 低熔点琼脂糖溶液。6.1.3.1.2.3 裂解缓冲液：6mmol/L、1mol/L NaCl，100mmol/LEDTA、1%十二烷基肌氨酸钠（sarcosyl）、1mg/mL溶菌酶、20U变溶菌素（mutanolysin）。6.1.3.1.2.4 蛋白酶K缓冲液：蛋白酶K（1mg/mL）溶解于100mmol/L EDTA，1%十二烷基肌氨酸钠。6.1.3.1.2.5 0.04mg/mL苯甲基磺酰氟。6.1.3.1.2.6 TE溶液：10mmol/L Tris-HCl（pH8.0）、1mmol/L EDTA（pH8.0）。6.1.3.1.2.7 5Tris-硼酸（TBE）缓冲液：Tris碱54g，硼酸27.5g，20mL 0.5mol/L EDTA（pH8.0），加水至1L。6.1.3.1.2.8 0.5ug/mL溴化乙锭。6.1.3.1.3 分析步骤6.1.3.1.3.1 DNA琼脂糖凝胶块制备1 待分型的乳酸细菌在适宜的培养基中生长至对数生长中期，加入青霉素使其终浓度为1030ug/mL，继续培养2h。2 3mL的培养物12000r/min离心10min收集细胞，用重悬缓冲液洗涤菌体2次后，悬浮在300uL的重悬缓冲液中。3 配制1.5%低熔点琼脂糖溶液。4 将等体积（各200uL）细胞悬液与琼脂糖溶液于室温下混匀，立即倒入凝胶块模具中，4度放置30min让琼脂糖固化。5 将凝胶块自模具中取出并置入裂解缓冲液中，37度孵育过夜。6 将凝胶块放置于蛋白酶K缓冲液中，于50度保持18h。7 蛋白酶K消化后，可将凝胶块保留在此缓冲液或0.5mol/L EDTA溶液中保存于4度。8 将凝胶块放入装有TE及0.04mg/mL苯甲基磺酰氟（PMSF）溶液的Falcon试管中，灭活残留的蛋白酶K。9 室温下用TE溶液漂洗凝胶块数次，将凝胶块放入另一干净的试管，可直接用于酶切反应或用0.5mol/LEDTA（pH8.0）4度保存凝胶块。10 若用EDTA保存凝胶块，取出后应用TE溶液室温下漂洗2次，每次30min。6.1.3.1.3.2 琼脂糖凝胶块中DNA限制性内切核酸酶的消化1 混合：酶反应缓冲液（高盐、中盐或低盐缓冲液），100mmol/L亚精胺（只用于高盐缓冲液状态），1020U的内切酶。20U的内切酶就足以过夜完全消化10ugDNA。2 设定一个除内切酶成分外含有混合物各组分的阴性对照，以检查是否有非特异性DNA 降解。3 将琼脂糖凝胶块加入反应混合溶液中：通常用消毒过的手术刀或套环将凝胶块移入，37度孵育12h。6.1.3.1.3.3 凝胶电泳1 将1%的低熔点琼脂糖在0.5TBE 中溶化后冷却至5060度，立即注入凝胶框架中，并插入梳子。2 凝胶固化后小心地拔出齿梳，用两把无菌手术刀将DNA 凝胶块上样。将DNA大小标准物上样至凝胶的两旁。3 用1%液态低熔点琼脂糖凝胶（0.5TBE配制）密封狭槽，若有气泡存在，用注射器驱赶气泡。4 一旦密封的低熔点琼脂糖已固化（大约10min），可将凝胶搁入腔室，并用电泳缓冲液覆盖过胶面。5 设定合适的电压及转换时间（脉冲时间为16s，电流6V/cm，温度为14度）并开始电泳，两个不同方向电泳的电流该相等。电泳总时间约22h。电泳结束后，凝胶用EB（0.5ug/mL）染色，254nm紫外灯下观察。注1：实验过程中应使用消毒溶液及带无菌手套以免DNA降解。注2: 限制性内切核酸酶消化前注意用1TE溶液仔细漂洗凝胶块，以去除EDTA，以免影响后续的酶消化反应。6.1.4 安全性实验6.1.4.1 抗生素耐药性谱测定6.1.4.1.1K-B纸片琼脂扩散法原理 通过测量含药纸片周围抑菌圈直径大小来判定细菌对药物的敏感水平。材料 菌种、抗生素药物纸片、MRS琼脂培养基、麦氏比浊管、游标卡尺、厌氧培养箱分析步骤 将菌种接种于MRS琼脂平板，37度厌氧培养24h，然后挑取单菌落，悬于3mL生理盐水中，混匀后通过比浊法测定其菌体密度，并调整菌体浊度为0.5麦氏单位（0.048mol/LBaCl2 0.5mL，0.36N H2SO4 99.5mL）用无菌棉拭子蘸取菌液，在管壁上挤压去掉多余菌液。用棉拭子涂布整个MRS培养基表面，反复几次，每次将平板旋转60度，最后沿周边绕2圈，保证涂布均匀。待平板上的水分被琼脂完全吸收后，用无菌镊子取药敏纸片贴在平板表面。每个平板贴5张纸片，每张纸片间距不少于24mm，纸片中心距平皿边缘不少于15mm。待菌接种后15min贴完纸片。将平板厌氧培养1824h后取出，用游标卡尺测量抑菌圈直径，从平板背面测量最接近的整数毫米数并记录。抑菌环的边缘以肉眼见不到细菌明显生长为限。有的菌株可出现蔓延生长，进入抑菌环，磺胺药在抑菌环内出现轻微生长，这些都不作为抑菌环的边缘。结果判断依据鉴定所药敏纸片判定标准。每次药敏实验同时用E.coli ATCC 25922做对照。只有当E.coli的抑菌圈直径在允许的范围内时测试菌株的结果才可以报告。E.coli ATCC25922的结果必须与测试菌株同时记录和报告。判定标准 参照乳酸细菌现代研究实验技术中列出标准表 乳杆菌KB纸片琼脂扩散法判定标准抗生素抑菌圈直径/mm耐药中介敏感青霉素G19202728氨苄西林12131516万古霉素14151617复方新诺明10141516利福平14151718甲硝唑14151718庆大霉素1213链霉素11121415四环素14151819氯霉素13141718红霉素13141718 菌株抑菌圈直径跟标准菌株对比。注：制备MRS琼脂平板应用直径90mm的平皿，在水平实验台上倾注。6.1.4.1.2 E-test法原理:E-test试条是商品化的细长形塑料试条，内含浓度呈指数梯度的某种抗菌药物。可用于常见细菌、苛氧菌、分枝杆菌、厌氧菌和真菌的药敏实验。将试条贴于接种好待测菌株的平板上，经过合适的条件孵育后，围绕着试条的周围可形成一个卵圆形的抑菌圈，而该抑菌圈与试条的横向相交处的读数，即为该药物对待测菌株的MIC。材料：MRS培养基、麦氏比浊管、E-test试条。分析步骤1菌液制备、平板制备，参见K-B纸片琼脂扩散法（厌氧菌、隐球菌和其他真菌菌悬液浓度为1个麦氏单位，其他细菌为0.5个麦氏单位）。2加贴试条：待已涂布的琼脂平板表面完全干燥后，用E-test加样器或镊子将试条的含药面贴于平板表面，浓度最大处靠近平板边缘。试条全长应与琼脂紧密接触，一旦放平就不能再移动。肠杆菌科细菌（352）度培养（182）h；葡萄球菌属细菌3335度培养（182）h（其中苯唑西林、甲氧西林、萘夫西林和万古霉素敏感性测定需培养24h）。培养过程中平板应单独摆放，不超过2个叠在一起。3结果观察及判读：按照产品说明书，在椭圆形抑菌环与E-test试条的交界点读取MIC值。若无抑菌环出现，则报告MIC大于刻度的最高值，若抑菌环与试条无交点，则报告MIC小于刻度的最低值。应读取所有的生长，包括薄雾状和散在微小菌落被抑制处的数值。将各抗生素药物的MIC（ug/mL）比对MIC解释标准，报告被测细菌对该抗生素敏感（S）、中敏（I）、耐药（R）。4质量控制同纸片法。结果判定：菌株抑菌圈直径跟标准菌株对比。6.1.4.2 硝基还原酶活性检测原理：检测细菌硝基还原酶活性主要是利用硝基还原酶催化底物硝基芳烃化合物，生成产物芳香胺；再通过后续的颜色反应检测产物芳香胺，确定细菌是否具有硝基还原酶活性。材料：BHI培养基、1-硝基芘、三氯乙酸、亚硝酸钠、0.5%氨基磺酸铵、0.1% 盐酸萘乙二胺、二甲基亚砜、对硝基苯甲酸、甲醇、Whitley DG250厌氧工作站、T6紫外可见分光光度计。分析步骤1接种细菌于含有1-硝基芘（1632ug/mL，二甲基亚砜溶解）的BHI培养基平板；接种后置37度黑暗中厌氧孵育48h。2向平板上加入13mL 0.21%三氯乙酸和0.007%亚硝酸钠混合液，室温孵育20min。3再加入1mL0.5%氨基磺酸铵，孵育3min；加入5mL0.1%NEDD（水溶），室温孵育；观察是否有菌落变成紫红色，是说明菌株具有硝基还原酶活性，否说明菌株不具有硝基还原酶活性。4、向细菌培养物中加入对硝基苯甲酸甲醇溶液，使其终浓度为10mg/mL，37度黑暗中厌氧孵育4h。5、加入终浓度为0.21%三氯乙酸，酸化生成产物对氨基苯甲酸。6、加入终浓度为0.007%的亚硝酸钠，室温孵育20min。7、加入终浓度为0.04%氨基磺酸铵；室温孵育3min后，加入终浓度为0.35%的NEDD，540nm波长处测定吸光度。8、根据对氨基苯甲酸540nm处标准曲线，计算每1010个细菌的硝基还原酶活性。注：厌氧孵育注意避光。6.1.4.3 D-乳酸含量检测原理D-乳酸在人血液中聚集过多会发生D-乳酸中毒。世界卫生组织建议限制D-乳酸的摄入量，规定成人每天摄入的D-乳酸不超过100mg/kg。分光光度法通过D-乳酸脱氢酶将D-乳酸转化为丙酮酸，同时，把等量的NAD转化为NADH；通过前后吸光度的变化测定样本中D-乳酸的含量。材料氧化型辅酶（NAD）、甘氨酸缓冲液（pH9.2；0.6mol/L甘氨酸和0.5mol/L、D-乳酸脱氢酶（D-lactate dehydrogenase）、硫酸铵（ammonium sulfate）、谷丙转氨酶（glutamate-pyruvate transaminase）、T6紫外可见分光光度计、FRESCO 17离心机。分析步骤将待测细菌接种到新鲜培养基，适宜条件培养若干时间，离心收取上清液。向0.2mL待测上清液中加入0.8mL甘氨酸缓冲液、NAD（终浓度1.3mg/mL）以及0.01mLD-乳酸脱氢酶硫酸铵混悬液（每5mgD-乳酸脱氢酶与1.5mL硫酸铵混合）和谷丙转氨酶（谷丙转氨酶/D-乳酸脱氢酶活性之比为11/38）；将上述混合物置于35度水浴45min。将相同处理但不加D-乳酸脱氢酶的上清液样本作为空白对照。测量已知D-乳酸标准品样品处理后340nm处OD值，绘制标准曲线。340nm波长处测量反应后混合物的OD值；根据标准曲线确定所测样本D-乳酸含量。注：样品数量较多时，注意控制加样时间。每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔；如果标本中待测物质含量过高，请先稀释后再测定，计算时请最后乘以稀释倍数。6.2 感官取适量样品，在自然光线下，用肉眼观察样品的颜色和形态，检查有无杂志。6.3 产酸能力6.3.1 仪器和设备 pH计：精度0.01。6.3.2 试剂和溶液6.3.2.1 乳酸菌培养液的制备（10%）将100g脱脂奶粉充分溶解于900mL 50度的水中，缓慢搅拌后稳定20min，密封置于适当的容器中，与高温灭菌釜中110度加热20min，待用。6.3.2.2 NaOH标准溶液(0.1mmol/L)6.3.2.3 发酵剂样品溶液的制备6.3.2.3.1 称取对应每100L奶接种量的菌粉，溶解于100mL相应发酵温度的乳酸菌培养液（6.3.2.1）中，摇动10min直到完全溶解。6.3.2.3.2 从上述菌液中用无菌移液管或移液枪均匀抽取10mL菌液，转移到90mL乳酸菌培养液（6.3.2.1）中，摇动1min直到分散均匀。6.3.3 分析步骤6.3.3.1 用0.1mol/LNaOH标准溶液调整待测乳酸菌培养液（6.3.2.1）的pH到6.6。6.3.3.2 从无菌脱脂复原乳（6.3.3.3.2）中取出10mL，转移到相应发酵温度的990mL的pH调整到6.6的无菌脱脂复原乳中（6.3.3.1），摇动1min后放置到相应发酵温度的恒温水浴锅或恒温箱中培养，开始计时。6.3.3.3 记录脱脂奶（6.3.3.2）达到标称pH的时间。6.3.3.4 记录脱脂奶（6.3.3.2）标称时间内达到的pH。6.3.4 结果判定产酸活力按下述方法进行判定：达到标称pH的时间；标称时间内pH的变化值。注1：冷冻和干燥产品需在室温下放置0.51h后方可使用。注2：根据产品标志，选择记录时间（6.3.3.3）或pH（6.3.3.4）。6.4 发酵酸度6.4.1 原理根据酸碱中和的原理，用碱液滴定试液中的酸，以酚酞为指示剂确定指示终点，按碱液消耗的量计算样品中总酸含量。6.4.2 仪器和设备除实验室常用仪器外，还需碱式滴定管：25mL。6.4.3 试剂和溶液6.4.3.1 1%酚酞指示剂：按GB/T 603配制。6.4.3.2 NaOH标准滴定溶液（0.01mol/L）：吸取10mL、0.1mol/L氢氧化钠溶液（按GB/T 601配制），稀释到100mL，用时当天稀释。6.4.4 发酵用乳酸菌剂溶液的制备称取或量取一定量的乳酸菌样品，溶解于80mL一定温度的水中，定容至100mL，使最终溶液的浓度控制在活菌数108CFU/mL。注：对于由多菌种发酵剂物理混合而成的产品，将单位包装产品充分溶解后，按规定量取样测定。6.4.5 发酵剂样品溶液的制备 同6.3.2.3。6.4.6 分析步骤取（6.4.5）中对应溶液50mL（g）到250mL三角瓶中，加入40mL60mL去二氧化碳的蒸馏水，加1%酚酞指示剂2滴，用0.01mol/L NaOH标准滴定溶液定至微红色，保持30s 不退色，即为终点。用无二氧化碳的水代替试样溶液进行空白实验。注：冷冻和干燥产品需在室温下放置0.5h1h后使用。6.4.7 计算发酵酸度（以乳酸计）按公式（1）计算： X1=c(V1-V2)0.090250/50m100%(1)式中： X1发酵酸度，以质量百分数（%）表示； c NaOH标准滴定溶液的摩尔浓度，单位为摩尔每升（mol/L）； V1样品滴定时消耗NaOH标准滴定溶液的体积，单位为毫升（mL）； V2空白滴定时消耗NaOH标准滴定溶液的体积，单位为毫升（mL）；0.090与1.00mL氢氧化钠标准滴定溶液c(NaOH)=0.01mol/L相当的乳酸的质量，单位为克（g）。 m称取样品的质量，单位为克（g）。结果保留两位小数。6.4.8 精密度 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不应超过算术平均值的5%。6.5产过氧化氢能力分光光度法-辣根过氧化物酶法6.5.1 原理6.5.2 材料试剂30%过氧化氢辣根过氧化物酶水溶液：辣根过氧化物酶以1mg/mL的浓度溶解于蒸馏水中制备过氧化物酶储液，该储液经滤膜过滤后，储存于5度直至使用。分析时该储液经1：100稀释后进行使用。2 仪器生化培养箱、恒温磁力搅拌器、生物洁净工作台、显微镜、高压灭菌器、各种规格手动移液器、高速冷冻离心机、分光光度计。6.5.3方法1、标准曲线的制备1）采用磷酸钠缓冲液（2mol/L，pH6.5）分别制备每毫升含1ug、2ug、4ug、5ug的过氧化氢溶液，分别取10mL上述溶液，再用10mL的磷酸钠缓冲液进行稀释，制备标准溶液。2）分别取5mL上述标准溶液，分别加入含有1mL浓度为0.01mg/mL的过氧化物酶溶液和0.1mL浓度为1%的邻联茴香胺溶液的试管中。3）空白对照管为5mL的磷酸钠缓冲液，1mL浓度为0.01mg/mL的过氧化物酶溶液和0.1mL浓度为1%的邻联茴香胺溶液的试管中.4）每个试管混合均匀后，在37度保温10min。5）每个试管中加入0.2mL的4mol/L的盐酸终止反应并稳定颜色。6）加入盐酸5min后，在400nm波长下测定密度值。7）以过氧化氢的浓度为横坐标，以光密度值为纵坐标绘制标准曲线。2、乳酸细菌培养液中过氧化氢含量的测定1）待测乳酸细菌在MRS液体培养基中于适温下培养适宜时间；2）取出后于12000g离心10min，收集上清液，用于分析过氧化氢的含量；3）取5mL上清液加入一干净试管中，然后加入0.1mL浓度为1%的邻联茴香胺溶液，混合，再加入1mL浓度为0.001mg/mL的过氧化物酶溶液；4）空白对照组采用5mL磷酸钠缓冲液代替样品溶液，其余同上。5）每个试管混合均匀后，在37度保温10min。6）每个试管中加入0.2mL的4mol/L的盐酸终止反应并稳定颜色。7）加入盐酸5min后，在400nm波长下测定密度值。8）与标准曲线对比后，确定待测样品中过氧化氢的含量。6.6 菌株产细菌素能力检测6.6.1原理：某些细菌产生的细菌素可作为生物防腐剂。细菌素高产菌株的筛选首先要选出具有抑菌活性的乳酸细菌，之后对乳酸发酵上清液进行处理，逐一排除非细菌素抑菌因素，再进行复筛，初步认为复筛后具有抑菌活性的乳酸菌为目的菌株。6.6.2 材料 指示菌：金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌、单核细胞增生李斯特氏菌、大肠杆菌、荧光假单胞菌和沙门氏菌等作为初筛指示菌。6.6.3分析步骤6.6.3.1 冻干菌种的活化1) 低温保存的菌种在室温放置几个小时，用70%乙醇棉擦拭冻干瓶的铝盖上部，用70%乙醇消毒后的剪子剥去铝盖；2)对胶塞及冻干瓶口周围进行消毒；3)用无菌镊子打开瓶塞，用接种环挑取少许菌粉接入适宜的液体培养基试管中；4)把接好菌的试管放入培养箱中37度培养3672h；5)连续传代活化3次。6.6.3.2有抑菌活性菌株的初筛1) 制备含1.2%琼脂的MRS琼脂培养基，培养基冷至50度左右，倾倒平板，放置干燥；2) 实验菌在适宜液体培养基中于37度培养过夜；3)平板上点种10uL实验菌液；4)干燥后放入适宜条件下培养24h左右，长出菌落取出；5)指示菌培养过夜；6)制备含0.7%琼脂的适宜软琼脂培养基(指示菌培养基)，冷至50度左右；7)每7mL软琼脂培养基接种300uL指示菌培养液；8)在长出菌落的实验菌平板上倾倒7mL 上述加入指示菌的软琼脂，放冷，干燥；9)指示菌适宜条件下培养过夜，产生的抑菌圈半径大于5mm认为有抑菌活性。6.6.3.3 具有抑菌活性菌株的复筛6.6.3.3.1无细胞发酵液的制备：1）纯化活化好的乳杆菌以1%的接种量接种于100mL液体培养基中，适宜温度下静止培养；2）培养到稳定期后（OD1.9），12000*g，4度离心15min，收集上清液；3）用6mol/L氢氧化钠调pH值到6.5，以中和有机酸的干扰；4）过氧化氢酶溶解在0.02mol/L乙酸盐缓冲液（pH6.5）中配成母液。5）加入无细胞发酵上清液使过氧化氢的终浓度为5.0mg/mL，37度水浴；6）水浴2h取出，7）上清液用0.22um滤膜过滤，除去菌体及其他杂质；8）无细胞上清液通过冷冻干燥的方法浓缩；9）冻干后加入原体积1/10超纯水（Milliq），溶解后放入-20冰箱中备用。6.6.3.3.2 具有抑菌活性菌株的复筛。 采用采用牛津杯双层平板法，步骤如下：1）2%的素琼脂灭菌冷到50度倒平皿晾干；2）无菌镊子取6个灭过菌牛津杯放入倒过琼脂的平皿；3）指示菌培养过夜；4）制备含0.7%琼脂的指示菌培养基，冷到50度；5）每100mL软琼脂培养基接种1mL的指示菌；6）在事先放好牛津杯的平板上倾倒10mL含有指示菌的软琼脂培养基，晾干；7）在牛津杯的空中加入100uL无细胞发酵上清液，在洁净工作台中鼓风扩散3h；8）置于指示菌适宜的培养条件下，培养一定时间后用游标卡尺测定抑菌圈的直径。6.6.3结果判定 测试菌株与标准菌株抑菌圈直径大小判定。6.7 抗氧化能力原理：材料：乳酸细菌、MRS培养基、PBS缓冲液（pH=7.4）；Tris-HCl（pH8.2）、过氧化氢酶、二苯代苦味肼基自由基（DPPH）、丁基化羟基甲苯（BHT）、二乙三胺五乙酸、铁氰化钾、硫代巴比妥酸（TBA）、SOD和GSH-Px检测试剂盒、亚油酸、L-半胱氨酸盐酸盐、过氧化氢、FeSO4、邻苯三酚、O-菲罗啉、三氯乙酸（TCA）、氢氧化钠、三氯化铁、抗坏血酸、亚油酸乳化液、三氯甲烷、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、硫酸亚铁、Tris、邻菲罗啉、甲醇、维生素C，均为分析纯。恒温培养箱、灭菌锅、超声破碎仪、分光光度计、分析天平、离心机方法步骤：乳酸细菌的培养及无细胞提取物的制备：供试菌于MRS培养基37度培养24h后，离心收集菌体，用PBS洗涤3次，重悬于PBS，调整菌数到1010/mL，冰浴超生破碎细胞，4度，12000g，离心30min，收集上清液，即为无细胞提取物。6.7.1 对过氧化氢的耐受能力 将乳酸细菌接种于MRS液体培养基，37度静置培养24h；离心收集菌体，用PBS洗涤并制备108CFU/mL的菌液，取0.5mL菌液，分别加入5mL含有0、0.2%、0.3%、0.5%、1%H2O2的PBS中；37度处理1min，再加入0.2mg/mL过氧化氢酶，将处理后的PBS梯度稀释，涂布于MRS固体培养基上，37度培养48h，计数并计算其存活率。以标准菌株作为对照。6.7.2 清除超氧自由基（O2-）能力的测定 吸取0.5mL无细胞提取液，分别Tris-HCl(pH8.2)、二乙三胺五乙酸和邻苯三酚，使其终浓度为150mmol/L 、3mmol/L和1.2mmol/L，总反应体积为3.5mL。25度恒温水浴反应10min后于325nm处测吸光度。 利用以下公式计算超氧自由基的清除率： O2-清除率（%）=1-（A11-A10）/（A01- A00） 100%式中，A00为不含样本和邻苯三酚；A01 为不含样品，含邻苯三酚；A10为含样本，不含邻苯三酚；A11为含样品和邻苯三酚。6.7.3 清除羟自由基（HO）的能力吸取0.5mL无细胞提取物和1mLO-菲罗啉，加入1mLPBS，1mL2.5mmol/L FeSO4，1mL20mmol/LH2O2；37度恒温水浴反应1.5h后，在536nm处测定吸光度。利用以下公式计算超氧自由基的清除率： 清除率（%）=（A2-A1）/（A0-A1）100%式中，A0为不含样品和H2O2；A1为不含样品，含H2O2；A2为含样品和H2O2。6.7.4螯合Fe2+能力的测定 加入0.1mL质量分数为1%的抗坏血酸，0.1mL质量分数为0.4%的FeSO4，1mL0.2mol/L，以及0.5mL实验菌无细胞提取物；混合液37度水浴20min，TCA沉淀蛋白，于4度，4500g离心10min；取0.2mL上清液，加入2mL质量分数为0.1%的O-菲罗啉，反应10min后，510nm测定吸光值。实验以PBS作为空白对照。6.7.5 还原活性吸取0.5mL无细胞提取物，加入0.5mL1%铁氰化钾，0.5mLPBS，50度水浴20min；冷却后加入TAC沉淀蛋白，4度，4500g，离心10min；取1mL上清液与1mL0.1%FeCl3反应后，于700nm处测吸光度。以L-半胱氨酸盐酸盐作为标准对照。6.7.6 抗脂质过氧化0.5mLPBS溶液中加入1mL亚油酸乳化液，加入0.2mL质量分数为0.01%的FeSO4和0.2mL 0.56mmol/LH2O2催化氧化，再加入0.5mL乳酸细菌菌体或乳酸细菌无细胞提取物，37度水浴反应12h；混合液中加入0.2mLTCA，2mLTBA，0.2mLBHT，100度反应30min；冷却后加入2.5mL三氯甲烷抽提，离心收集上清液，在532nm下测定吸光度。实验以PBS作为空白对照。利用以下公式计算抗脂质过氧化率：抗脂质过氧化率=1-A532（样品）/A532（空白）100%6.7.7 清除DPPH自由基的能力向1mLDPPH甲醇溶液（0.2mmol/L）中加入1mL乳酸细菌菌体或乳酸细胞提取液，室温下置黑暗环境中反应30min，用三氯甲烷抽提后，于517nm测吸光度。以去离子水为空白。利用以下公式计算DPPH自由基清除率： DPPH自由基清除率（%）=1-A517（样品）/A517（空白）100%注：接种量和培养条件要保持一致。制备无细胞抽提液时，菌体用量必须准确。菌细胞在低温下破碎。6.8 对胃酸和胆盐的耐受性6.8.1 原理乳酸细菌能安全通过消化道，保持较高的数量和活性是其充分发挥功效的重要一环。乳酸细菌要进入肠道发挥作用，首先要经过胃液的酸性环境。活菌能否顺利通过胃液，HCl的耐受能力强弱将是一个关键的因素。而胃液pH因饮食结构的不同而波动很大，通常pH为3左右，食物通过时间为12h。因此，国内外学者一般把pH3.0和120min作为体外初步筛选的一个基本标准。肠道胆盐对菌体也有毒性作用。胆盐可改变菌体外膜的通透性，对乳酸细菌起到抑制、杀灭作用，进而影响其存活。人体小肠中胆汁盐含量为0.33g/kg，尽管人体肠道胆盐浓度不断变化，但通常认为平均胆盐浓度为0.3%，因此0.3%的胆盐浓度可作为初筛的标准浓度。6.8.2 仪器和设备722 S分光光度计、pHS-25酸度计、超净工作台、高压灭菌锅和电热恒温培养箱等。6.8.3 培养基和试剂6.8.3.1 培养基 MRS液固培养基、改良MRS培养基（在固体改良MRS里加0.5% CaCO2。6.8.3.2 试剂 盐酸、牛胆酸钠和CaCO2等。6.8.4 分析步骤6.8.4.1 乳酸细菌培养液的制备 乳酸细菌采用MRS培养基，37度静止培养24h，所有菌株经过2次传代。6.8.4.2 初步筛选 把MRS培养基的pH调到3.0，121度，15min灭菌后按2%的接种量接入已经活化2代的液体培养物，37度培养24h，测定其在24h过程中吸光度的变化OD600，同时在MRS培养基中添加0.3%牛胆盐，121度，15min灭菌后按2%的接种量接入已经活化2代的液体培养物，37度培养24h，测定其在24h过程中吸光度的变化OD600，最后选取2个OD600相对大的10个左右的菌株进行下一步的实验。6.8.4.3 耐酸性实验 以pH7.0的PBS缓冲液为基础，再用37%的盐酸将其分别调至3.0，121度，15min灭菌后按10%的接种量接入已活化2代的液体培养物，37度条件下分别于0min、30min、60min、90min、120min取样测定活菌数。6.8.4.4 胆盐耐受性实验菌株活化2代后的液体培养物按2%接种量接入含不同胆盐浓度的改良液体MRS培养基中（培养基中分别含0.1%、0.2%、0.3%、0.5%、2%胆盐），同时以不含胆盐的改良MRS培养基作为对照。在37度恒温培养箱中培养24h后取样测定活菌数。6.8.5 结果判定耐酸、耐胆盐按下述方法进行判定： pH3.0和120min活菌数/不加盐酸对照活菌数胆盐浓度为0.3%时的活菌数/不加胆盐对照活菌数注1：实验过程中注意无菌操作。注2：酸度计必须用已知pH的缓冲液溶液进行定位校正。注3：分光光度计使用前要预热、调零和确定波长。6.9 黏附性测定6.9.1 乳酸菌黏附性测定6.9.1.1 原理在消化道内黏附和定植是乳酸细菌发挥益生作用的关键，由于体内测定黏附特性的困难，体外细胞培养方法是研究益生菌黏附最常用的方法。人结肠腺癌细胞Caco-2由于在体外生长所表现出的形态和功能特征能够模拟成熟肠道上皮细胞，经常作为体外模型用于评价益生菌的黏附和定植能力。6.9.1.2 材料Caco-2细胞、改良型RPMI-1640细胞培养液、胎牛血清、Hanks液、胰蛋白酶（0.25%）、水浴锅、离心机、吸管、血细胞计数板、倒置显微镜、MRS培养基、PBS缓冲液（pH7.4）、甲醇、Triton X-100。6.9.1.3 分析步骤6.9.1.3.1 将Caco-2细胞接种到含盖玻片的24孔培养板中，接种量为每孔2.0105个细胞，37度培养至完全分化。6.9.1.3.2 乳酸菌培养至稳定期，6000r/min离心5min收集菌体，用PBS缓冲液洗涤2次后，悬浮在不含胎牛血清的细胞培养液中，调整菌体浓度为1109个/mL。6.9.1.3.3 Caco-2单细胞层用PBS缓冲液洗涤2次，每孔添加1mL细菌悬浮液，37度培养1h。6.9.1.3.4 弃细菌悬浮液，单细胞层用无菌的PBS缓冲液洗涤5次，用甲醇固定10min，然后革兰氏染色。6.9.1.3.5 显微镜观察计数，10个随机视野中，每个细胞周围黏附的细菌个数的平均值记为菌株对Caco-2细胞的黏附值。注1：黏附实验中用不含胎牛血清的细胞液，血清中成分复杂可在一定程度上抑制细胞的黏附。注2：Caco-2单细胞层要清洗干净，以避免残留物质对黏附的干扰。注3：黏附完毕后要清洗干净，以便准确计数。注4：Triton X-100裂解细胞时作用时间不宜过长，以免影响细菌的存活率。6.9.2 黏附性双歧杆菌菌株的筛选6.9.2.1 原理黏附是细菌与宿主细胞相互作用的第一步，外源的双歧杆菌能否在肠道黏附和定植是评定双歧杆菌的保健效果的主要指标之一。双歧杆菌表面的疏水性在肠道上皮细胞的初始黏附中起重要作用，疏水性强的菌株对肠上皮细胞具有较高的黏附能力，并呈现一定的依赖性，即双歧杆菌的疏水性与其对肠上皮细胞的黏附力成正比。6.9.2.2 材料双歧杆菌菌株、改良MRS培养基、MEM培养液（含20%胎牛血清）、50mmol/L K2HPO4（pH6.5）缓冲液，二甲苯（分析纯）、SCL-1300型垂直流洁净工作台、722S分光光度计、倒置显微镜、二氧化碳细胞培养箱、亨盖特厌氧装置、厌氧箱。6.9.2.3 分析步骤6.9.2.3.1 菌株活化取活菌冻干粉少量于改良MRS液体培养基中活化，在37度下厌氧培养24h，传代23次后，镜检菌体生长良好再进行实验。6.9.2.3.2 菌液浓度调整将细菌培养物以12000r/min离心5min收集菌体，用缓冲液洗涤菌体2次，每次5 mL，离心6000r/min 2min。以缓冲液为空白对照，用缓冲液调整菌株菌体浓度，使其在600nm波长下A值为1.000（A600=1.000）。6.9.2.3.3 疏水性测定取2mL调整浓度后的菌液加入400uL 二甲苯，对照组不加二甲苯，振荡30S，停顿10S后再振荡30s，静置5min分层。取水相，以缓冲液为空白对照，在600nm下测定A值并记录，每株细菌平行做3管重复。细菌细胞表面疏水性计算：疏水率H%=(A0-A)/A0100 式中，A0和A分别是与二甲苯混匀前、混匀后菌液在600nm下测得的A值。6.9.2.3.4 黏附力测定采用体外细胞培养法1 细菌培养 双歧杆菌菌株接种于改良MRS培养基中厌氧培养24h，调节细菌浓度为108cfu/mL。 2 细胞培养Caco细胞株购自协和医科大学基础所。使用MEM细胞培养液（含20%的胎牛血清），37度下在5%CO2-95%空气的二氧化碳细胞培养箱中恒温孵育，待细胞生长良好时（70%融合时）用消化液消化传代。细胞贴壁生长，通常是12d更换营养液，4d传代1次。3 黏附实验将培养好的人肠道上皮细胞Caco株进行消化，制成细胞悬液（105个/mL），接种于含20%胎牛血清不含双抗的MEM培养液后，放置入含洁净细胞飞片的24孔板（Costa公司）中，每孔中加入1mL细胞悬液，于5%CO237度细胞培养箱中孵育至单细胞贴壁。无菌PBS液洗涤3次，每孔加入1mL菌液（含菌体108cfu/ml）与1mLMEM细胞培养液的混合液，37度，5%CO2-95%空气中孵育2h。无菌PBS洗涤细胞飞片以除去未结合的细菌。然后火焰固定