光合细菌的菌种分离和菌种保存技术.doc

4光合細菌的菌種分離和菌種保存技術菌種的分離，是從它生活的環境中，與混雜的微生物群分離出來。這是獲得優良菌株最基本且必要的手段。菌種大量培養目前應用於有機廢水淨化和水產養殖業上的光合細菌，主要是紅螺菌科中稱為紫色非硫細菌中的一些種類，包括紅螺菌屬（Rhodosirillum）、紅假單胞菌屬（Rhodopseudomonas）、和紅微菌屬（Rhodomicrobium）在內的三個屬，共同特徵是具鞭毛有運動性，不產生氣泡，細胞內不積累硫化物。採樣：光合細菌生長條件，主要有水、有機質和厭氧環境。因此，在河底、海底的泥土及水田、溝渠等經常含有有機物的泥土上，有著呈橙黃色、粉紅色塊狀沉積物的泥土，都可以採取分離光合細菌的樣品。培養方式：目前在水產養殖上應用的光合細菌，主要是光合異營型紅螺菌科，其中以紅假單胞菌屬（Rhodopseudomonas）為主。採用的養殖方法有兩種，全封閉的厭氣光照培養方式，開放式的微氣光照培養方式。全封閉式的厭氣光照培養採用無色透光的容器，消毒後裝入培養液，接入2050%的菌種母液，將容器中灌滿培養液，加蓋造成厭氣的培養環境。，置於有陽光的地方或用人工光源進行培養，達到指數生長期高峰時，可作為菌種器液接種。 開放試微氣光照培養可採用100-200L容量的的塑膠桶或500L容量的豐年蝦孵化桶為培養容器。在底部裝打氣石，培養時微充氣，使桶內光合細菌上下緩緩翻動。在桶的正上方約30cm左右加裝人工光源，使液面照度達2000lux。容器消毒後裝入培養液，接入2050%的菌種母液，照明，微充氣培養。 培養基對培養光合自營型細菌，一般用無機鹽為基礎培養基，加入適量的碳酸氫鹽作為二氧化碳的來源，用磷酸調整pH 7.08.0，然後加入0.050.1%的Na2S9H2O作為電子供體和供氫體，在光照厭氣環境，2030培養。培養光合異營型的細菌則需在無機鹽培養基中再加入0.2%酵母膏、0.25%乙酸鈉、0.02%丙酸鈉和5%NaHCO3，調整其pH至7.0-8.0，根據環境需求而定。紅螺菌科配方NH4Cl1.0gNaCl0.5-2.0gNaHCO3 *11.0Tm儲液 *210mlK2HPO40.2生長素輔助因子儲液 *31mlCH3COONa1-5g蒸餾水 *41000mlMgSO47H2O0.2gpH *47.0著色菌科配方NH4Cl1.0gMgCl0.2gNaHCO31.0gTm儲液 *210mlK2HPO40.5g蒸餾水 *41000mlNa2S *51.0gpH *48.0-8.5綠桿菌科配方NH4Cl1.0gMgCl0.2gNaHCO31.0gTm儲液 *210mlK2HPO40.5g蒸餾水 *41000mlNa2S *51.0gpH *47.3*1 事先製備5%NaHCO3水溶液，經過濾除菌，取20ml與另外經高壓滅菌的培養基混合*2 微量元素儲液：FeCl3 5mg、CuSO45H2O 0.05mg、H3BO3 1mg、MnCl25H2O 0.05mg、ZnSO47H2O 1mg、CO（NO3）26H2O 0.5mg、蒸餾水 1000ml*3 生長輔助因子：維生素B1、P-胺基苯甲酸、根據不同菌種加入。*4 光合細菌如為海水種，改用人工海水，並調整pH值*5 事先製備10% Na2S水溶液，經過濾除菌，取10ml與另外經高壓滅菌的培養基混合。培養紅硫菌（Chromatium）時，可再Na2S水溶液中加入0.2%馬來酸鈉等有機酸來促進生長。培養方法光合細菌的培養，按次序分為容器、工具的消毒，培養基的製備，接種和培養管理四個步驟。容器、工具的消毒，參考微藻培養方法部分。培養基的製備淡水種光合細菌使用消毒過的淡水製備，生產培養可用消毒的自來水（或井水）配製。如果培養海水種光合細菌則用天然海水配製培養基，在海水中加入磷元素時，不能用K2HPO4，應用KH2PO4，不然會產生大量沉澱。 滅菌和消毒菌種培養用的培養基應連同培養容器用高壓蒸氣滅菌鍋滅菌。大型生產性培養則把經沉澱砂濾後的水用漂白液消毒後使用。 培養基配製根據所培養種類的營養需要選擇合適的培養基配方。按培養基配方把所需物質稱量，逐一溶解，混合，配成培養基。也可先配成母液，使用時按比例加入一定的量即可。 接種培養基配好後，應立即進行接種。光合細菌生產性培養的接種量需求較高，一般為2050，即菌種母液量和新配培養液雖之比為1：41：1，不應低於20，尤其是微氣培養，接種量更應高些，否則光合細菌在培養液中很難佔絕對優勢，影響最終產量和質量。培養管理光合細菌的培養過程中，管理工作包括日常管理操作和測試，生長情況的觀察、檢查以及出現問題的分析處理等三個方面。日常管理和測試 攪拌和打氣：光合細菌培養過程中必須幫助沉澱的光合細菌上浮獲得光照，保持菌細胞的良好生長。大型厭氣培養則用機械攪拌或使用小型沉水馬達使水緩慢循環，保持菌體懸浮。微氣培養是通過打氣幫助菌體上浮，因為打氣會使溶氧含量增加，光合細菌繁殖受到抑制，所以必須嚴格控制供氣量。一般採用定時斷續充氣，充氣量控制在11.5L（L*hr）之間，溶解氧量保持在1ppm以下。 調節光照度：培養光合細菌需要連續進行照明。白天可利用日光培養，晚上則使用人工光源，或完全利用人工光源培養。一般培養光照強度應控制在20005000 lx之間。如果光合細菌細胞密度高，則光照強度應提高到500010000 lx。 調節溫度：光合細菌對溫度的適應範圍在2339內，均能正常生長繁殖，可不必調整溫度。 常溫下培養也可通過調整，將溫度控制在光合細菌生長繁殖最適宜的範圍。 酸鹼度的測定和調整：培養光合細菌必須注意酸鹼度的變化。 光合細菌大量繁殖時，菌液pH值上升，此時為指數生長期。但當pH 值超過生長的適應範圍時，光合細菌生長下降。 如果能及時調整，使pH值保持在最適範圍，則光合細菌能繼續生長繁殖。測定和調整pH值，可以讓光合細菌保持在指數生長期。一般採用加酸的辦法來降低酸鹼值。醋酸、乳酸和鹽酸均可使用，最常用的是醋酸。日常管理工作中，必須每天或隔天測定pH值，當pH值上升超出最適範圍，即加酸調整。 生長情況的觀察和檢查光合細菌生長情況的好壞是培養成敗的標準。在培養過程中，可以通過觀察菌液的顏色及其變化來了解光合細菌生長繁殖的大體情況，菌液的顏色是否正常，接種後顏色是否由淺變深，均反映光合細菌是否正常生長繁殖以及繁殖速度的快慢。 必要時可通過顯微鏡檢查，了解情況。問題的分析和處理通過日常管理、檢測、檢查，了解光合細菌的生長情況，就可以結合當時環境條件的變化進行分析，找出影響光合細菌生長繁殖的原因，採取相應的措施。 影響光合細菌生長的原因很多，內因是菌種是否優良，外因是光照、溫度、營養、敵害和厭氣程度等。溫度、光照和pH值都能影響著光合細菌的生長，而且溫度、光照和pH值之間是互相制約的，溫度與光照的強弱是對立統一的，所以光合細菌生長的最適條件應是互應的，即溫度高，光照應弱；溫度低，光照應強。 如果是溫度