固体测糖方法.doc

苯酚-硫酸法两种测量固体含糖量的方法选择一种比较适合的自己的方法两种方法可以对比下那种更好苯酚-硫酸法是利用多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物。再以比色法测定。 编辑本段原理多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物。再以比色法测定。 编辑本段试剂1 浓硫酸：分析纯，95.5% 2 80%苯酚：80克苯酚（分析纯重蒸馏试剂）加20克水使之溶解，可置冰箱中避光长期储存。 3 6%苯酚：临用前以80%苯酚配制。（每次测定均需现配） 4 标准葡聚糖（Dextran,瑞典Pharmacia）,或分析纯葡萄糖。 5 15%三氯乙酸（15%TCA）：15克TCA加85克水使之溶解，可置冰箱中长期储存。 6 5%三氯乙酸（5%TCA）：25克TCA加475克水使之溶解，可置冰箱中长期储存。 7 6mol/L 氢氧化钠：120克分析纯氢氧化钠溶于500ml水。 8 6mol/L 盐酸 编辑本段操作1制作标准曲线：准确称取标准葡聚糖（或葡萄糖）20mg于500ml容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1.8ml,各以蒸馏水补至2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却，室温放置20分钟以后于490nm测光密度，以2.0ml水按同样显色操作为空白，横坐标为多糖微克数，纵坐标为光密度值，得标准曲线。 2样品含量测定： 取样品1克（湿样）加1ml 15%TCA溶液研磨，再加少许5TCA溶液研磨，倒上清液于10毫升离心管中，再加少许5TCA溶液研磨，倒上清液，重复3次。最后一次将残渣一起到入离心管。注意：总的溶液不要超出10毫升。（既不要超出离心管的容量）。 离心，转速3000转/分钟，共三次。第一次15分钟，取上清液。后两次各5分钟取上清液到25毫升锥形比色管中。最后滤液保持18毫升左右。（测肝胰腺样品时，每次取上清液时应过滤。因为其脂肪含量大容易夹带残渣。） 水浴，在向比色管中加入2毫升6mol/L 盐酸之后摇匀，在96水浴锅中水浴2小时。 定容取样。水浴后，用流水冷却后加入2毫升6mol/L 氢氧化钠摇匀。定容至25毫升的容量瓶中。吸取0.2 ml的样品液，以蒸馏补至2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却室温放置20分钟以后于490nm测光密度。每次测定取双样对照。以标准曲线计算多糖含量。 编辑本段注意（1）此法简单、快速、灵敏、重复性好，对每种糖仅制作一条标准曲线，颜色持久。 （2）制作标准线宜用相应的标准多糖，如用葡萄糖，应以校正系数0.9校正g数。 （3）对杂多糖，分析结果可根据各单糖的组成比及主要组分单糖的标准曲线的校正系数加以校正计算。 （4）测定时根据光密度值确定取样的量。光密度值最好在0.10.3之间。比如：小于0.1之下可以考虑取样品时取2克，仍取0.2ml样品液，如大于0.3可以减半取0.1ml的样品液测定。实验五 总糖的测定蒽酮比色法一、目的：1.掌握蒽酮法测定可溶性糖含量的原理和方法。2.学习植物可溶性糖的一种提取方法。二、原理：糖类在较高温度下可被浓硫酸作用而脱水生成糠醛或羟甲基糖醛后，与蒽酮(C14H10O)脱水缩合，形成糠醛的衍生物，呈蓝绿色。该物质在620 nm处有最大吸收，在150 g/ml范围内，其颜色的深浅与可溶性糖含量成正比。这一方法有很高的灵敏度，糖含量在30 g左右就能进行测定，所以可做为微量测糖之用。一般样品少的情况下，采用这一方法比较合适。三、仪器、试剂和材料 1.仪器：电热恒温水浴锅，分光光度计，电子天平，容量瓶，刻度吸管等2.试剂：(1)葡萄糖标准液：l00 g/ml(2)浓硫酸(3)蒽酮试剂：0.2 g蒽酮溶于100 ml浓 H2SO4中。当日配制使用。3.材料：甜糜秸秆四、操作步骤 1.葡萄糖标准曲线的制作取7支大试管，按下表数据配制一系列不同浓度的葡萄糖溶液： 管号 1234567葡萄糖标准液（ml） 00.10.20.30.40.60.8蒸馏水（ml）10.90.80.70.60.40.2葡萄糖含量（g）0102030406080在每支试管中立即加入蒽酮试剂4.0m1，迅速浸于冰水浴中冷却，各管加完后一起浸于沸水浴中，管口加盖，以防蒸发。自水浴重新煮沸起，准确煮沸l0 min取出，用冰浴冷却至室温，在620 nm波长下以第一管为空白，迅速测其余各管吸光值。以标准葡萄糖含量（g）为横坐标，以吸光值为纵坐标，作出标准曲线。2.植物样品中可溶性糖的提取：将样品剪碎至2 mm以下，105 C烘干至恒重，精确称取15 g，置于50 ml三角瓶中，加沸水25 m1，加盖，超声提取10 min，冷却后过滤（抽滤），残渣用沸蒸馏水反复洗涤并过滤（抽滤），滤液收集在50 m1容量瓶中，定容至刻度，得提取液。3.稀释：吸取提取液2 m1，置于另一50 m1容量瓶中，以蒸馏水稀释定容，摇匀。4.测定吸取1 ml已稀释的提取液于试管中，加入4.O ml蒽酮试剂，平行三份；空白管以等量蒸馏水取代提取液。以下操作同标准曲线制作。根据A620平均值在标准曲线上查出葡萄糖的含量（g）。五、结果处理 C V总 D样品含糖量（%）= 100 W V测 106其中：C在标准曲线上查出的糖含量（g），V总提取液总体积（ml），V测测定时取用体积（ml），D稀释倍数，W样品重量（g），106样品重量单位由g换算成g的倍数六、注意事项： 该法的特点是几乎可测定所有的碳水化合物，不但可测定戊糖与已糖，且可测所有寡糖类和多糖类，包括淀粉、纤维素等（因为反应液中的浓硫酸可把多糖水解成单糖而发生反应），所以用蒽酮法测出的碳水化合物含量，实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量。在没有必要细致划分各种碳水化合物的情况下，用蒽酮法可以一次测出总量，省去许多麻烦，因此，有特殊的应用价值，但在测定水溶性碳水化合物时，则应注意切勿将样品的未溶解残渣加入反应液中，