植物基因工程下VIP

第六章植物基因工程 下 三 改进转基因的技术转基因植物中外源基因的沉默提高外源基因表达水平的策略四 农作物基因工程五 生物反应器六 转基因植物的安全性 三 改进转基因的技术 在转基因研究中经常碰到一种引起基因失活的现象称为基因沉默 genesilencing 基因沉默可以发生在染色体DNA 转录和转录后3种不同的层次上 1 发生在染色体DNA水平上的转基因沉默叫位置效应 2 发生在RNA转录水平上的转基因沉默叫转录失活 3 发生在转录后水平的转基因沉默叫共抑制 一 转基因植物中外源基因的沉默 1 位置效应 位置效应是指基因受寄主染色体基因组上的插入部位及周围核苷酸组成的影响 如果整合发生在转录活跃的常染色体上 毗邻寄主基因的调控系列将影响到外源基因的表达 如果插入到重复DNA或异染色体中或旁边 外源基因可能会失活 2 DNA甲基化 植物DNA甲基化程度是较高的 核基因组中几乎20 30 的胞嘧啶处于甲基化状态 外源基因编码区域的甲基化对基因表达的作用不明显 通常检测不到对转录的影响 外源基因启动子区域或5 端非编码区域的甲基化会引起启动子失活或不能起始转录 在转录水平上诱导了外源基因的沉默 3 重复序列诱发基因沉默 通过电击法等将DNA直接导入植株 外源基因往往以多拷贝串联的方式整合在寄主的基因组内 重复序列诱发的基因沉默 repeatinducedgenesilencing RIGS 与重复序列间的异位配对和DNA的甲基化相关 一般一个位点插入的外源基因的拷贝数越多 失活的程度越高 3 重复序列诱发基因沉默 解决方案有 对外源基因及启动子进行改造 保证设计的序列与植物基因组有很短的同源序列 避免异位配对的发生 使用基因枪法及电击法等直接DNA导入法容易引起多拷贝基因的插入 而使用农杆菌转化法可在一定的程度上避免多拷贝基因的插入 在筛选作为育种材料的转基因植物时 尽量选择单拷贝插入的个体 采用RT PCR法可以筛选到单拷贝插入的个体 4 共抑制 共抑制是一种基因间相互作用引起的沉默现象 当引入一个与植物内源基因有部分同源性的DNA时 不但外源基因不能高效表达 反而抑制了内源基因的表达 二 提高外源基因表达水平的策略 1 转化方法的影响 基因直接转化法容易引起多拷贝转基因在寄主细胞中的整合 导致转基因沉默 而农杆菌介导的遗传转化法由于产生的拷贝数相对较少 可以在一定的程度上避免这个问题 2 使用信号肽 植物蛋白质分子的定向运输需要特殊多肽信号的引导作用 为提高转基因在植物的专门组织中的表达 除使用专门的启动子外 使用特定的信号肽序列是必需的 3 选择强启动子和诱导型启动子 选择合适的植物启动子是增强外源基因表达的一个有效手段 通常来源于双子叶植物的启动子 在双子叶植物中的表达效率要比在单子叶植物中高得多 反之亦然 有时人们并不需要外源基因在受体植物中的高效表达 而要求其能够在转基因植物中实现特异的时空表达 这就需要使用诱导型启动子 其在特定的条件下诱导在某些器官组织中特异性地启动目的基因的表达 4 强终止子 在植物转化的研究中 两个常用的终止子是CaMV35S启动子和根瘤土壤杆菌T DNA的胭脂氨基酸合成酶基因的nos终止子 其PolyA尾巴和其中的茎 环结构 可有效地抵御核酸酶的水解作用 使mRNA分子保持稳定性 5 消除甲基化的影响 已知用5 氮胞嘧啶处理植株具有很好的抑制甲基化和脱甲基化作用 人们还试图在载体上加上去甲基化功能的序列来防止甲基化 6 使用植物偏爱的密码子 转基因的密码子和植物基因组DNA的不同容易引起甲基化和表达效率低 在遗传转化前有必要优化转基因的密码子 尽量使用一些植物偏爱的密码子 7 使用MAR序列 基质结合区 matrixattachmentregion MAR 也叫核骨架结合区 scaffoldattachmentregion SAR 长度一般为300 1000bp 它可以与核骨架结合 在两个MAR间的染色质区域可形成DNA环 环的大小为5 200kb 每一个环为一个独立的表达结构 利用MAR的这一特性 可创造一个独立的结构域 减少了插入位点附近染色质的影响 从而可以避免位置效应的影响 还可以提高外源基因在转化细胞中的稳定性和表达水平 8 使用增强子 动物免疫球蛋白K链基因的增强子可在细胞发育的特定阶段指导该基因区段的去甲基化 启动基因的转录 在植物中分离相应的增强子 并和外源基因重组 可确保转基因按合适的调控模式表达 9 外源基因的修饰和改造 1 避免基因间的同源性 2 避免重复序列的出现 3 在载体上加增强翻译序列和核糖体结合位点 1 避免基因间的同源性 重复或同源序列是基因沉默的诱因 在构建表达载体时 应尽量降低所设计的序列与内源基因的同源性 以减少或避免配对 应尽量使外源DNA碱基组成与植物DNA碱基组成一致 避免被植物限制修饰机制所识别 也可采用定点插入方法 将外源基因插入到具有与其相似碱基组成的染色体区域 2 避免重复序列的出现 在筛选作为育种材料的转基因植物时 应尽量选择单拷贝插入的个体 来减少重复序列的存在 3 在载体上加增强翻译序列和核糖体结合位点 基因5 端和3 端非翻译序列及密码子周边序列都影响到基因的高效表达 起始密码子周边序列对翻译水平有明显影响 通常植物起始密码子周边序列有如下特征 AACAAUGGC 起始甲硫氨酸后紧跟丙氨酸 10 以叶绿体作为转化受体 叶绿体的基因转录和翻译机制类似于原核生物 在叶绿体内的转化有如下优点 A 可能大量表达外源基因 B 叶绿体结构简单 背景清楚 便于体外遗传操作 C 能更有效的控制外源基因 防止向环境释放 11 使用一些病毒编码蛋白 最近研究证明一些病毒能编码某种抑制寄主基因沉默的蛋白质 克隆这些蛋白的基因 改造后与目的基因相连 转入植物时同时表达 可在一定程度上抑制基因沉默的出现 12 在有性生殖后代中筛选单拷贝植株 可在分子水平和育种过程中筛选单拷贝的转基因植株 通过PCR技术 Southern杂交等方法进行筛选 四 农作物基因工程 一 利用转基因植物来生产蛋白药物 哺乳类动物细胞产生蛋白药物极其昂贵 而植物生长成本较低可换得大量蛋白质药物 在实验室里进行的有 如人的脑腓肽 人血清蛋白 及小鼠的单克隆抗体等 例如将小鼠的抗体轻链和重链基因分别在两种烟草植物中表达 转基因植物由根瘤农杆菌介导的基因转化方法构建 然后两种植物品系杂交 产生的子代植物表达小鼠的重链轻链两种蛋白 从烟草的叶子里可检测到完整的抗体分子 含量为叶细胞蛋白总量的1 5 二 抗虫转基因作物 天然的微生物杀虫剂如苏云金芽孢杆菌 Bacillusthurigiensis Bt 该细菌能产生晶体毒蛋白 对许多昆虫的幼虫有毒性 但对成虫和脊髓动物无作用 Bt合成的只是无活性的毒素原蛋白 幼虫接触毒素原蛋白后 其消化道中的蛋白酶便将毒素原蛋白水解成毒性片段 并与幼虫中肠细胞表面的受体结合 从而干扰细胞的正常功能 最近含修饰的Bt毒蛋白的转基因棉花已问世 三 抗病毒作物 转基因植物利用一些病毒包衣蛋白基因构建了抗病毒优良品种 如 烟草花叶病毒基因组编码四种多肽 两个复制酶亚基 一个包衣蛋白 一个与细胞结合有关的蛋白 由根瘤农杆菌介导的基因转化构建了表达 TMV包衣蛋白CP的转烟草植物 该转基因植物在TMV存在时 能抗病毒感染30天左右 正常植物3 4天之后使被TMV感染 最近的实验结果表明 CP表达抵御病毒侵袭也在其它谷物中成功 如马铃薯 番茄 苜蓿等 四 抗除草剂转基因作物 杂草的存在可使农作物减产10 1 强化表达除草剂的靶蛋白 酶 基因 5 烯醇式丙酮莽草酸 3 磷酸盐合成酶 EPSPS 是植物叶绿体中芳香族必需氨基酸生物合成中的一个酶 而除草剂glyphosate通过抑制该酶而杀死植物的 很少的剂量就能杀灭广谱杂草 将来自矮牵牛花的EPSPScDNA转入植物中 转基因酶活比非转基因植物提高了20倍 使得转基因植物较好地耐受glyphosate的存在 2 表达除草剂的突变靶蛋白 酶 基因 溴腈衍生物 Bromoxynil 是一种抑制光合成反应的除草剂 Klebsiellaozaenae有一基因编码一种腈水解酶 能将Bromoxynil降解为3 5 二溴 4 羟 苯甲酸 将该基因转入烟草中已获成功 四 抗除草剂转基因作物 环境大气层中的氧自由基 超氧化物负离子 对植物的损伤是严重的 在生理状况下 植物体内的超氧化歧化酶 SOD 将之转化为过氧化氢 后者经过过氧化氢酶作用后 分解释放出水和氧气 但过量的氧自由基则对植物的某些组织如花卉的寿命有所影响 将SOD基因转入花卉植物中 可以节省氧气的需求量 以增加鲜花的保存期 另外 抗盐 抗碱 抗寒 抗旱抗热的转基因植物也在研究中 五 抗环境压力的转基因作物 五 转基因植物的安全性 从20世纪70年代重组DNA技术创建到1983年第一株转基因烟草获得以来 国际上对转基因作物就存在着截然不同的观点 有人认为转基因作物造福于人类 有人认为转基因作物可能给人类带来环境 健康与生态的危险 基因工程技术在整个世界引起极大的关注与争议 并且随着转基因作物的成功获得 商品化 负面现象频繁出现等 甚至有完全拒绝转基因食品进入市场的举措 一 转基因植物的安全性评价 转基因植物技术相关事件 纽约大学研究人员发现 在室内种植的转基因B2玉米植株中的杀虫毒素可以渗入到土壤中 在玉米根系周围土壤提取物中仍含有Bt毒素 可以杀死幼虫 其活性可持续25天 研究人员认为此毒素普遍地影响土壤生态学 1999年 孟山都公司培育的抗虫转基因棉花在1996年进行大规模种植 部分地区出现大量存活的棉铃虫 导致棉花不同程度地受害 需要追喷杀虫剂 孟山都公司开发的抗除草剂草甘膦转基因棉花于1997年大规模种植 棉花主产区Detta收获的棉花多大量落铃或棉桃畸形 1994年美国第一个批准商品化的延迟成熟期的转基因番茄也因种种原因停止了生产 转基因植物技术相关事件 苏格兰P owett研究所用转凝集素基因的马铃薯喂饲大鼠 在电视上宣传大鼠食用后引起器官生长异常 体重和器官重量减轻 破坏免疫系统 引起国际轰动 1998年 印度于1998年11月焚烧了美国孟山都公司的两块实验地 反对该公司的 终止技术 即转基因作物雄性不育 农民不能自己留种 这实际上涉及到的是垄断问题 种植抗虫转基因玉米的地区 1999年 发现马利筋峡蝶大量减少 是蛱蝶因吮食花粉过度而死 丹麦国立利索研究所把耐除草剂的转基因油菜籽