PCR原理与操作

聚合酶链式反应 2 3 生命现象是自然界最复杂的现象 Whatislife ThefeatureofthelifeThelifeontheEarth科学认识生命 4 现代生命科学研究的里程碑之一 1839年细胞学说19世纪30年代 德国植物学家施莱登 MatthiasJacobSchleiden 1804 1881 首先指出 所有植物体都是由细胞构成的 他的这个观点被德国动物学家施旺 TheodorSchwann 1810 1882 在动物组织和细胞研究中证实 所有动物也是由细胞构成的 施旺指出 细胞是有机体 整个动物或植物体乃是细胞的集合体 它们依照一定的规律排列在动物体内 在此基础上他们创立了细胞学说 5 细胞学说将植物学和动物学联系在一起 论证了整个生物界在结构上的统一性 以及在进化上的共同起源 有力地推动了生物学向微观领域的发展 尽管细胞学说的某些部分已成为历史的陈迹 然而其中心思想仍广泛而深刻地影响了后来生物学的发展 任何生物学的重要问题都必须从细胞中寻求最后的解答 6 现代生命科学研究的里程碑之二 1859年Darwin进化论 达尔文 CharlesDarwin 1809 1882 发表 物种起源 指出生物变异的普遍性 变异与遗传的关系 提出了生存竞争和自然选择学说 系统地论述了物种形成的机制 7 达尔文在1859年出版的 物种起源 一书中系统地阐述了他的进化学说 其核心自然选择原理的大意如下 生物都有繁殖过剩的倾向 而生存空间和食物是有限的 所以生物必须 为生存而斗争 在同一种群中的个体存在着变异 那些具有能适应环境的有利变异的个体将存活下来 并繁殖后代 不具有有利变异的个体就被淘汰 如果自然条件的变化是有方向的 则在历史过程中 经过长期的自然选择 微小的变异就得到积累而成为显著的变异 由此可能导致亚种和新种的形成 8 达尔文的进化理论还存在着若干明显的弱点 他的自然选择原理是建立在当时流行的 融合遗传 假说之上的 按照融合遗传的概念 父 母亲体的遗传物质可以像血液那样发生融合 这样任何新产生的变异经过若干世代的融合就会消失 变异又怎能积累 自然选择又怎能发挥作用呢 达尔文过分强调了生物进化的渐变性 他深信 自然界无跳跃 用 中间类型绝灭 和 化石记录不全 来解释古生物资料所显示的跳跃性进化 他的这种观点近年正越来越受到间断平衡论者和新灾变论者的猛烈批评 9 1871年 达尔文又发表了 人类的由来及其性选择 描述了人类进化的过程 他的结论是 人类和其他物种同是某一种古老 低级 早已灭绝了的生物类型的同时并存的子孙 伟大革命导师马克思对进化论给予了很高的评价 把它与能量守恒和转换定律 细胞学说并列为19世纪的三大自然科学发现 10 一 基因及DNA双螺旋结构 二 DNA复制 转录及翻译 三 PCR原理 四 PCR操作 11 一 基因及DNA双螺旋结构 1 基因 gene 遗传因子 是DNA或RNA分子上具有遗传信息的特定核苷酸序列 基因通过指导蛋白质的合成来表达自己所携带的遗传信息 从而控制生物个体的性状表现 2 基因概念的提出 19世纪60年代 遗传学家孟德尔提出了生物的性状是由遗传因子控制的观点 20世纪初期 遗传学家摩尔根通过果蝇的遗传实验 认识到基因存在于染色体上 并且在染色体上是呈线性排列 从而得出了染色体是基因载体的结论 12 1865年 孟德尔发表了 植物杂交实验 首次阐述了生物界有规律的遗传现象 遗传因子 1900年 孟德尔遗传规律被证实 成为近代遗传学基础 遗传学是分子生物学发展的基础 13 3 DNA双螺旋结构的提出 1953年 JamesWatson和FrancisCrick发现了DNA双螺旋的结构 开启了分子生物学时代 使遗传的研究深入到分子层次 生命之谜 被打开 人们清楚地了解遗传信息的构成和传递的途径 1962年 共同荣获了诺贝尔生理学或医学奖 14 15 中心法则 Thecentraldogma microRNA小分子RNA NcRNA非编码RNA tRNA rRNA 复制 二 遗传信息的传递 16 1 复制 是以母链DNA为模板合成子链DNA的过程 实质是在酶促作用下 单个的脱氧核苷酸通过3 5 磷酸二酯键聚合的过程 在复制过程中 DNA双螺旋解开成为两条单链 亲代链 以每一条单链为模板 按照碱基配对规律 各自合成一条与之互补的新链 子代链 形成两个结构和碱基序列完全一致的子代DNA 其中每一个子代DNA分子中都保留一条来自亲代的链 一 DNA的复制 半保留复制 17 1958年 Meselson和Stahl证明DNA半保留复制 Meselson Stahl实验 米西尔逊 斯塔尔实验 被称为 生物学中最漂亮的实验 18 复制过程简图 19 按半保留复制方式 子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致 2 半保留复制的意义 遗传的保守 物种的稳定 决定后代的生物学性状和代谢类型 20 二 转录 RNA的生物合成 1 转录 生物体以DNA为模板合成RNA的过程 即以双链DNA中的一条链为模板 以ATP CTP GTP和UTP4种核苷三磷酸为原料 在RNA聚合酶催化下合成RNA的过程 是mRNA tRNA rRNA等的合成步骤 包括起始 延伸 终止3个步骤 21 翻译 即蛋白质的生物合成 是将核酸RNA中密码子破译的方式解读为蛋白质一级结构中20种氨基酸的排列顺序 翻译过程从5 AUG开始 按mRNA模板三联体密码的顺序延长肽链 直至终止密码出现 三 翻译 蛋白质的生物合成 22 23 1 定义 聚合酶链反应 PCR 是在DNA聚合酶催化下 以母链DNA为模板以特定引物为延伸起点 通过变性 退火 延伸等步骤 体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程 是一项DNA体外合成放大技术 能快速特异地在体外扩增任何目的DNA 可用于基因分离克隆 序列分析 基因表达调控 基因多态性研究等许多方面 三 PCR原理 PCR是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术 24 1953年 Watson和Crick提出DNA双螺旋结构及半保留复制模型 1958年 Meselson和Stahl用实验证实DNA半保留复制模型 70年代以来 人们采用两种思路去尝试建立基因的无性繁殖体系 一是基因克隆技术 二是体外扩增技术 1971年 Khorana 美国 1968年诺贝尔医学奖得主 经过DNA变性 与合适引物杂交 用DNA聚合酶延伸引物 并不断重复该过程便可克隆tRNA基因 核酸体外扩增最早设想被遗忘原因 1 很难进行测序和合成寡核苷酸引物 2 1970年Smith等发现了II型限制性内切酶 体外克隆基因已成为可能 2 PCR技术的发展历程 25 1976年 台籍科学家钱嘉韵 AliceChien 从黄石国家公园的嗜热菌Thermusaquaticus中分离出对热稳定的TaqDNA聚合酶 1985年 美国Cetus公司人类遗传研究室的Mullis发明PCR Saiki等首次应用PCR法成功地扩增了人 珠蛋白的DNA 并应用于镰刀状红细胞贫血的产前诊断 1985年 Science 杂志报道了耐热性DNA聚合酶Taq酶 生活在温泉中的水生嗜热杆菌内提取到的一种耐热的DNA聚合酶 整个反应只加一次酶即可 扩增特异性和效率都明显改善 操作大为简化 此酶的发现 预示着分子时代的到来 1989年被誉为 分子年 列PCR为十余项发明之首 1993年 Mullis荣获诺贝尔化学奖 26 3 PCR的原理 遗传物质 细胞核 染色体 DNA 脱氧核糖核酸 磷酸链和碱基构成 碱基 A T C G 是按双链螺旋排列的 碱基序列的长度和排列顺序决定了生物的多样性 PCR的基本工作原理 以拟扩增的DNA分子为模板 以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物 在DNA聚合酶的作用下 按照半保留复制的机理沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成 27 PCR反应的基本成分 模板DNA 特异性引物 热稳定DNA聚合酶 脱氧核苷三磷酸 dNTP Mg2 等 基本反应步骤 变性 退火 延伸 最后通过染料 如EB染色DNA后在紫外灯下显色检出 28 温度与时间的设置 4 PCR的反应流程 变性温度与时间 一般93 94 1min足以使模板变性 若低于93 则需延长时间 但温度过高对酶的活性有影响 退火 复性 温度与时间 取决于引物的长度 碱基组成及其浓度 还有靶基因序列的长度 对于20个核苷酸 G C含量约50 的引物 55 作为选择最适退火温度的起点较为理想 按下公式计算 Tm 解链温度 4 G C 2 A T 复性温度 Tm值 5 10 在Tm值允许范围内 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合 提高PCR反应的特异性 一般为30 60s 29 延伸温度与时间 延伸温度 一般选在70 75 之间 常用温度为72 过高的延伸温度不利于引物和模板的结合 延伸反应时间 1Kb以内的DNA片段 延伸时间1min 3 4kb的靶序列需3 4min 扩增10kb需延伸至15min延伸时间过长会导致非特异性扩增 但是对低浓度模板的扩增 延伸时间要稍长些 循环次数 循环次数决定PCR扩增程度 主要取决于模板DNA的浓度 一般选在30 40次之间循环次数越多 非特异性产物的量亦随之增多 30 重复1 3步25 35轮 目的DNA片段扩增100万倍以上 DNA双螺旋 DNA单链与引物复性 DNA变性形成2条单链 子链延伸DNA加倍 31 PCR的三个反应步骤反复进行 使DNA扩增量呈指数上升 反应最终的DNA扩增量的计算 Y 1 X nY代表DNA片段扩增后的拷贝数 X表示平 Y 均每次的扩增效率 n代表循环次数 平均扩增效率的理论值为100 但在实际反应中平均效率达不到理论值 反应初期 靶序列DNA片段的增加呈指数形式 随着PCR产物的逐渐积累 被扩增的DNA片段不再呈指数增加 而进入线性增长期或静止期 即出现 停滞效应 这种效应称平台期数 PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素 大多数情况下 平台期的到来是不可避免的 5 PCR的反应动力学 32 PCR反应曲线 33 6 标准的PCR反应体系 10 扩增缓冲液10 l4种dNTP混合物各200 mol L引物10 100pmol模板DNA0 1 2 gTaqDNA聚合酶2 5uMg2 1 5mmol L加双或三蒸水至100 l 34 7 PCR产物的检测 将反应产物取3 8 l作2 0 琼脂糖凝胶电泳 定性检测目的基因的扩增水平 35 四 PCR反应特点 特异性强 遵循碱基配对原则 忠实的复制模板链 灵敏度高 指数方式增加的 能将pg 10 12 量级的起始待测模板扩增到ug 10 6 水平 可从100万个细胞中检出一个靶细胞 简便 快速 PCR反应用耐高温的TaqDNA聚合酶 一次性地将反应液加好后 即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性 退火 延伸反应 一般在2 4h完成扩增反应 扩增产物一般用电泳分析 不一定要用同位素 无放射性污染 易推广 对标本的纯度要求低 不需分离病毒或细菌及培养细胞 DNA粗制品及总RNA均可作为扩增模板 可直接用临床标本如血液 体腔液 洗嗽液 毛发 细胞 活组织等粗制的DNA扩增检测 36 五 PCR技术的局限性 为了构建特定引物 使特定DNA序列的选择性扩增 必须有一个庞大的已知序列的数据库 聚合酶链反应效率差异很大 根据不同的因素需要优化反应条件 PCR技术扩增产物的长度有限 37 六 PCR技术的注意事项 防止污染 建立良好的质量控制 操作时避免气溶胶产生 特别注意阳性样品的拿放 使用一次性耗材 穿戴手套并经常更换 永远在最后一步才加核酸 液体分装使用等 引物设计合理 Taq酶扩增错误率较高 大约1 100对碱基 20个循环 镁离子浓度对反应效率的影响 仪器稳定性 升降温速率 管子的密合度等 38 电泳技术 带电颗粒在电场作用下 向着与其电性相反的电极移动 称为电泳 electrophoresis EP 利用带电粒子在电场中移动速度不同而达到分离的技术称为电泳技术 1809年俄国物理学家Pe ce首先发现了电泳现象 但直到1937年瑞典学者A W K 蒂塞利乌斯设计制造了移动界面电泳仪 分离了马血清白蛋白的3种球蛋白 创建了电泳技术 39 本世纪60 70年代 当滤纸 聚丙烯酰胺凝胶等介质相继引入电