实时荧光定量PCR的标记分类及应用.doc

实时荧光定量PCR的标记分类及应用 张莹（温州医学院仁济学院生物技术三班，0819040062）摘要：实时荧光定量PCR（real-time,quantitative PCR）技术是在PCR技术基础上发展起来的一种高度灵敏的新型核酸定量检测、分析技术。它通过在PCR扩增反应过程中加入荧光物质，使得对反应过程的实时监控成为可能。它具有实时监测、定量准确、灵敏度高、反应速度快、重复性好及反应后不需电泳检测等优点，已逐步成为分子生物学研究中的重要工具。 关键字：荧光定量 PCR 应用 聚合酶联反应（polymerase chain reaction, PCR）技术是1985年开始出现的一项基因检测技术。由于PCR技术简便易行、灵敏度高等优点，该技术被广泛应用于基础研究，成为分子生物学必不可少的研究工具。由于传统的PCR技术存在，不能准确定量，且操作过程中易污染而使得假阳性率高等缺点，使其应用受到局限。对PCR产物进行准确定量成为PCR技术发展的重要方向1-3。定量PCR（quantitative PCR,Q-PCR）先后出现了多种方法，目前为止，其中结果最为可靠的就是实时荧光定量PCR（Real time fluorescent quantitative PCR,Real-time Q-PCR）。1996年，实时荧光定量PCR技术由美国Applied Biosystems公司首先推出。这项技术是指在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光集团，利用荧光信号来实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板浓度进行定量分析。其特点有：(1)用产生荧光信号的指示剂显示扩增产物的量，进行实时动态连续的荧光监测，避免终点定量的不准确性，并且消除了标本和产物的污染，且无复杂的产物后续处理过程。(2)荧光信号通过荧光染料嵌入双链DNA，或荧光探针特异结合木得检测物等方法获得，打打提高了检测的灵敏度、特异性和精确性4,5。Real-time O-PCR可以应用于mRNA表达的研究、DNA拷贝数的检测、单核苷酸多态性的测定、细胞因子的表达分析、肿瘤耐药基因表达的研究以及病毒感染的定量监测。1、 实时荧光定量PCR技术的基本原理在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光基团，这些荧光物质 有其特定的波长。仪器可以自动检出，利用荧光信号积累，实时监测整个PCR进程，在PCR循环中，测量的信号将作为荧光阈值的坐标。并且引入一个Ct值（Threshold cycle）概念，Ct值是指产生可被检测到得荧光信号所需的最小循环数，是在PCR循环过程中荧光信号由本底开始进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数5。荧光阈值相当于基线荧光信号的平均信号标准偏差的10倍。一般认为在荧光阈值以上所测出的荧光信号是一个可信的信号，可以用于定义一个样本的Ct值。通常用不同浓度的标准样品的Ct值来产生标准曲线，然后计算相对方程式。方程式的斜度可以用来检查PCR的效率，所有标准曲线的线性回归分析需要存在一个高相关系数（R0.99），这样才能认为实验的过程和数据是可信的，使用这个方程式计算出未知样本的初始模板量57。实时荧光定量PCR仪都有软件，可以从标准曲线中自动地计算出未知样本的初始模板量。2、 实时荧光定量PCR技术中荧光标记方法的分类目前，Real-time Q-PCR所使用的荧光化学方法主要有四种，也主要有四种方法可用于DNA扩增产物的检测，这些方法有着相近的灵敏度。分别是DNA结合染料法、水解探针法、杂交探针法、荧光引物法。2.1 SYBR green I染料反应体系中，加入过量SYBR 荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的扩增完全同步。其优点是对模板没有选择性，使用方便，非常方便，但也易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性，可以通过溶解曲线的分析，优化反应条件8。2.2 Taqman 探针目前在Real-time Q-PCR中最广泛使用的Tagman系统就是运用了这个原理。它能被DNA合成酶（例如Taq酶）的5-3活性所降解，探针的5端有一荧光报告基团，3端有一荧光淬灭基团，当两个基团相互先靠近的时候，由于发生能量传递作用，报告基团不能发出荧光，但随着扩增反应的进行，5端得报告基团随着探针的水解而脱落下来，不再与淬灭发生能量传递作用，从而能发出荧光，被信号探测器所捕获，针对Taqman探针荧光淬灭不彻底的问题，2000年美国ABI公司推出了一种新TaqMan探针-MGB探针。探针3端采用了非荧光性的淬灭基团，吸收报告基团的能量后并不发光，大大降低了本底信号的干扰。此外，MGB探针的3端还连接了一个二氢环化吲哚卟啉-三肽，可以大大稳定探针与模板的杂交，升高探针Tm值，使较短的探针同样能达到较高的Tm值并且短探针的荧光报告基团和淬灭基团的距离更近，淬灭效果更好，荧光背景更低，使得信噪比更高9 。2.3 Scorpions它由两个寡核苷酸分子组成，一个是引物，另一个是带荧光分子的探针，但是此探针也具有引物的功能。引物与形成发夹结构的探针相连，在探针上由于荧光报告基团与淬灭基团相互靠近，不发荧光。变性阶段，探针的发夹结构会解开，在退火时则与模板相结合，形成线性分子，报告基团同淬灭基团分离而发射荧光。在探针的设计上，要求绝对保守，长度为25-32bp，Tm在68-70度之间，探针的5端不能为G，避免多个碱基同时出现，尤其要避免4个G同时出现，另外，探针应靠近上游引物。2.4 分子信标分子信标是（Molecular beacon）是一种呈发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补配对，因此标记在一端的荧光基团与标记在另一端的淬灭基团紧紧靠近。荧光基团被激发后产生的光子被淬灭剂淬灭，由荧光基团产生的能量以红外光而不是可见光形式释放出来。在复性温度下，因为模板不存在时形成茎环结构。当加热变性会互补配对的茎环双链解开，如果有模板存在环序列将与模板配对。与模板配对后，分子信标将成链状而非发夹装，使得荧光基团与淬灭剂分开。当荧光基团被激发时，淬灭作用被解除，发出激光分子10。3、 实时荧光定量PCR技术的应用3.1基因工程研究领域（1） 基因表达研究 对地中海贫血症患者与珠蛋白mRNA水平进行检测，其结果特异性强、定量准确，为了解地中海贫血的分子病理机制及其临床诊断提供了可靠的检测数据11。（2） 转基因研究 利用两种发光探针及适当的循环阈值，扩增一个转移后的基因和一个对照基因，以分析转基因老鼠接合性。该方法为45个转基因动物的同型结合及异质结合提供了明确的鉴定结果12。通过实时定量PCR检测，同型结合的异质接合动物交配后其子代中转基因的传递情况符合孟德尔遗传规律。这项技术在转基因动物繁育及基因剂量功能效应实验中将有很大的用途13。（3） 单核苷酸多态性（SNP）及突变分析 实时荧光定量PCR一个诱人的应用前景是用于检测基于两条探针和基因组的不稳定性。基因突变基于两条探针，一条探针横跨突变点，另一条为锚定探针，与无突变位点的靶序列杂交。两条探针用两种不同的发光基团标记。如靶序列中无突变，探针杂交便完全配对，如有突变，则探针与靶序列不完全配对，会降低杂交体得稳定性，从而降低其熔解温度（Tm）。这样便可对突变和多态性进行分析14。 3.2 医学研究领域（1）病原体检测 由于实时荧光定量PCR方法可靠性和重复性好，并且操作简便、快速、结果判断客观，目前，人们用此方法对人类免疫缺陷病毒、肝炎病毒、结核杆菌、巨细胞病毒、EB病毒、流感病毒A、流感病毒B等病原体的检测15。荧光定量PCR问世后的几年中，积累了大量有关病原体核酸量与感染性疾病发生、发展和预后之间关系的资料，这些研究资料不断丰富，将形成感染性疾病的临床分子诊断标准。（2）药物疗效考核 利用实时荧光定量PCR技术检测临床样品中与抗药性相关的基因的表达。结果证明，实时荧光定量PCR系统是定量检测抗药基因表达的可靠方法，应用这种技术可以预测化疗将引起的反应16。（3）肿瘤基因检测 肿瘤的本质是细胞内基因发生了变化，是一种多基因异常的疾病，这些异常变化用实时荧光定量PCR方法都可以检测出来。目前用此方法进行过端粒酶hTERT基因、慢性粒细胞性白血病bcr/abl融合基因、肿瘤MDRI基因、白血病WTI基因、肿瘤ER基因、前列腺癌PSM基因、肿瘤相关的病毒基因等多种基因的表达检测。随着与肿瘤相关的新基因的不断发现17。荧光定量PCR技术将会在肿瘤的研究中发挥更大的作用。3.3其他领域用实时荧光定量PCR方法对免疫组分进行分析是其应用的重要方面。1997年Lang等用实时荧光定量PCR技术对T细胞群V-的分析，在反应系统中引入荧光探针，将下游引物与探针固定，然后，针对不同的V-成分，选择特异的上游引物进行扩增，再对反应中产生的荧光信号进行处理，便获得了各个成分的数据。日本Isono利用实时荧光定量PCR对叶绿体成熟度与其基因组拷贝数关系进行了研究，发现子叶出现以后，叶绿体基因拷贝数显著增加，进而把光诱导的叶绿体成熟过程与叶绿体的基因拷贝数增加联系起来11。4、 结语与展望随着科技的发展，功能更加强大、操作更方便的实时定量PCR仪不断推出，更特异、更灵敏的荧光标记材料的不断出现，数据分析软件的不断改进更新，使得实时定量PCR技术的应用前景更加广泛，使之成为生物定量分析的强有力手段。TaqMan和分子信标荧光探针是目前用于荧光定量PCR检测的主流，但都存在各自的优缺点，其他荧光探针都是在此基础上为了克服它们的不足而设计出来的，随着探针技术的发展，更特异更稳定的探针将会出现。参考文献：1 邓文星，张映。实时荧光定量PCR技术综述J。生物技术通报，2007,27（5）:93952 栗文凯，张智勇，胡建和。实时荧光定量PCR应用技术综述J。中国畜禽种业，2008,10:71723 朱水芳。实时荧光聚合酶链式反应检测技术M。北京：中国计量出版社，2003，:33494 帅小蓉，夏庆友。定量PCR技术的研究现状及应用概述J.蚕学通报，2002,22（4）：2028.5 赵焕英，包金凤。实时荧光定量PCR技术的原理及其应用研究进展J。中国组织化学与细胞化学杂志，2007,16（4）：4924976 王梁燕，洪其华。实时定量PCR技术及其应用J。细胞生物学杂志，2004,2（2）：62677 李文涛，王俊东，杨利峰，等。实时荧光定量PCR技术及其应用J。生物技术通讯，2006,17（1）：1121148 张贺，李波，周虚，谭建华。实时荧光定量PCR技术研究进展及应用J。动物医学进展，2006,27（曾）：5129 王爱民。实时荧光定量PCR（TaqMan）法测定外源基因的拷贝数J。广西植物，2009,29（3）：40841210 胡骑，程安春，汪铭书。荧光定量技术的研究进展及应用J。Heilong jiang Animal Science and Veterinary Medicine,2006(11):323411 欧阳松应，杨冬。实时荧光定量PCR技术及其应用J。生命的化学，2004,24（1）、；747612 敖金霞，高学军，仇有文，郭世成。实时荧光定量PCR技术在转基因检测中的应用J。东北农业大学学报，2009,40（6）：14114413 An N, Zhan G .Expression level of detecting vgb gene by fluorescence realtime quantitative PCR in cottonJ. Journal of Xinjiang Agricultural University,2007,30(3):6914 郭扬，