实验二差速离心法分离纯化蛋白质.doc

实验二 差速离心法分离纯化蛋白质一、实验目的1、了解离心机的种类及结构，并能熟练操作。2、掌握离心机的使用方法及注意事项。3、掌握差速离心法分离纯化可溶蛋白质的原理及技术。4、掌握电子天平的使用方法。二、实验原理1、离心技术：根据颗粒在作匀速圆周运动时受到一个外向的离心力的行为而发展起来的一种分离技术。当物体围绕一中心轴做圆周运动时，运动物体就受到离心力的作用。旋转速度越高，运动物体所受到的离心力越大。如果装有悬浮液或高分子溶液的容器进行高速水平旋转，强大的离心力作用于溶剂中的悬浮颗粒或高分子，会使其沿着离心力的方向运动而逐渐背离中心轴。在相同转速条件下，容器中的大小不同的悬浮颗粒或高分子溶质会以不同的速率沉降。经过一定时间的离心操作，就有可能实现不同悬浮颗粒或高分子溶质的有效分离。离心技术是蛋白质、酶、核酸及细胞亚组分分离纯化的常用方法之一。2、沉降系数 ：（sedimentation coefficient，S），1924年Svedberg（离心法创始人-瑞典蛋白质化学家）对沉降系数定义：颗粒在单位离心力场中粒子移动的速度。沉降系数以时间表示。 用离心法时，大分子沉降速度的量度，等于每单位离心场的速度。即s=v/2r。s是沉降系数，是离心转子的角速度（弧度/秒），r是到旋转中心的距离，v是沉降速度。沉降系数以每单位重力的沉降时间表示，并且通常为120010-13秒范围，10-13这个因子叫做沉降单位S，即1S=10-13秒. 沉降系数对于生物大分子来说，多数在(1500)10-13秒之间。为应用方便起见，人们规定110-13秒为一个单位（或称1S）。一般单纯的蛋白质在120S之间，较大核酸分 子在4100S之间，更大的亚细胞结构在30500S之间。生物大分子的沉降系数可通过离心技术进行测定。对于沉降系数已知的物质，可预计沉降时间。沉降系数计算公式：（1）、S=（ln(rmax)-ln(rmix)）/（2T）S：沉降系数，10-13s；：角速度，rad/s；rmax：外半径；rmix：内半径；T：离心时间，s。（2）、沉降系数经验公式（适用于任何大分子）：S20,w0.00242Mr 0.6673、离心力和相对离心力：溶液中的固相颗粒做圆周运动时产生一个向外离心力，其定义为： F = m2r,式中： F 为离心力的强度； m 为沉降颗粒的有效质量； 为离心转子转动的角速度，其单位为rad/s； r 为离心半径(cm)，即转子中心轴到沉降颗粒之间的距离。很显然，离心力随着转速和颗粒质量的提高而加大，而随着离心半径的减小而降低。目前离心力通常以相对离心力Fcf 表示，即离心力F 的大小相对于地球引力(G)的多少倍，单位为g，其计算公式如下： Fcf = 1.119105(h)2rg可以看出，在同一转速下，由于f 的不同，Fcf相差会很大，实际应用时一般取平均值。在离心实验的报告中，Fcf、r 平均、离心时间t 和液相介质等条件都应表示出来，因为它们都与样品的沉降速度有直接的联系。显然Fcf是一个只与离心机相关的参数，而与样品并无直接的关系。4、沉降速度与沉降系数一个颗粒要沉降，它必须置换出位于它下方等体积的溶液，这只有当颗粒的质量大于被置换出的液体的质量时才能通过离心的手段达到，否则，在离心过程中颗粒将发生向上漂浮，而不是下沉。当颗粒在运动时，不论方向如何，它都要穿过溶剂分子，所产生的摩擦力总是与颗粒运动的方向相反。摩擦力的大小与颗粒的运动速度成正比，并且受颗粒的大小、形状及介质性质的影响。由于离心力的存在，颗粒将加速运动直到摩擦力与离心力相等。在这种情况下，颗粒所受到的净作用力为零，颗粒将以最大速度运动。沉降系数定义为沉降速度与离心力的比率或单位离心场中颗粒的沉降速度，它以svedberg单位计算，1S110-13 s。例如，核糖核酸酶A 的沉降系数为18510-13 s，即可记作185S。近年来，在生物化学、分子生物学及生物工程等书刊文献中，对于某些大分子化合物，当它们的详细结构和分子量不很清楚时，常常用沉降系数这个概念去描述它们的大小。如核糖体RNA(rRNA)有30 s 亚基和50s 亚基，这里的s 就是沉降系数，现在更多地用于生物大分子的分类，特别是核酸。考马斯亮蓝G250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。它和蛋白质通过范德华力结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律（Beers law）。此染料与蛋白质结合后颜色有红色形式和蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595nm，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。三、实验器具与材料1、 Sigma1-14小型台式离心机，紫外分光光度计，比色皿，烧杯，玻璃棒，量筒，电子天平，移液器，1.5mL 离心管 2、 待测蛋白，蒸馏水四、实验步骤1、在电子天平上精确称取约1mg左右样品，加入4ml纯水充分混匀后静置。自然沉降待上部分清澈后，吸取上清液体至比色皿测定其吸光度值。2、将上清液转至1号离心管，400rpm条件下离心3min。吸取上清至比色皿测定其吸光度值。 3、将上清液转至2号离心管，10000rpm条件下离心5min。吸取上清至比色皿测定其吸光度值。 4、将上清液转至3号离心管，12000rpm条件下离心15min。吸取上清至比色皿测定其吸光度值。 五、实验数据记录 波长A2800.7900.7460.4180.403A2600.8830.8300.4780.461六、结果分析与讨论根据实验一结果选用双波长紫外分光光度法-280nm和260nm的吸收差法,由公式蛋白质浓度（ug/ul）=(1.45A280 )-(0.74A260 )计算得出:C1=0.492，C2=0.468，C3=0.252，C4=0.243。利用低速和高速离心交替进行，用不同强度的离心力场使不同物理性质的蛋白颗粒分批分离。适用于沉降速度差别大的混合样品的分离。利用样品中各组分沉降系数的差异，通过多次对沉淀和上清液选速离心，达到组分的分离提纯。离心时，通常先选择一个较低的离心速度和时间，把大部分不需要的较大蛋白颗粒沉淀弃去，收集上清液用较高的转速和选择适宜的离心时间，把需要的蛋白粒子沉降下来。接着把沉淀悬浮起来，再一次用较低的速度离心。如此反复低速高速离心，直至达到所需粒子的纯度为止。七、注意事项1.离心时必须配平对称放入，如果离心机声音异常，肯定没配平；离心过程中，实验者不得离开。2启动离心机时，应盖上离心机顶盖后方可慢慢转动；分离结束后，先关闭离心机，在离心机停止转动后，方可打开离心机盖，取出样品，不可用外力强制其停止运动。3.转子的保管和使用要严格