特有濒危植物八角莲遗传多样性RAPD分析.doc

特有濒危植物八角莲遗传多样性特有濒危植物八角莲遗传多样性 RAPDRAPD 分析分析 李忠超 1 2 邱英雄 1 周新闻1 傅承新1 1 浙江大学生命科学学院植物研究所 杭州 310029 2 中国科学院华南植物研究所 广州 510650 1 1 引言引言 目前 人们已认识到现代物种灭绝的第一位原因是人为影响的作用 尤其是生境丧失 生境破坏 及过度利用 遗传多样性的丧失可能是物种濒危的症状 而不是濒危的病因 Hamrick 等 1990 综 合分析了 662 种植物的等位酶多样性与系统位置 分布范围 分布地区 生活型 繁殖系统 种子传 播方式 生殖类型和演替阶段 8 个特征的相互关系的结果 概括的估测了植物种内遗传变异的水平和 分布 但 Schoen 和 Brown 1991 认为这种概括性的估测应用于保育策略可能导致严重的错误 特别 是自交物种 越来越多的研究结果表明 保育计划的制定必须以遗传多样性为依据 对特有濒危植物 遗传多样性的研究 不仅关系到能否采取科学有效的措施来保育濒危物种 以最小的努力得到遗传多 样性监测或保存的最大效果 而且可以了解物种的演化历史以及稀有和濒危机制 祖元刚等 2000 过去 100 年中国大陆社会 经济 人口的变化使动植物的生境片段化和异质化 许多物种的数 量和规模越来越小 居群间地理隔离越来越大 基因流因增大的地理隔离而降低 现存居群经历的 规模的缩小和地理隔离的增大 对其遗传多样性和遗传结构产生了重要影响 虽然遗传漂变是选择 中性的 但它可能会通过自交和自交衰退而带来负面影响 对于孤立居群的作用则更加强烈 进一 步降低物种的遗传多样性水平 最终导致每个位点仅含一个等位基因 目前在这方面已有较多报道 因此 对遗传多样性的研究可以了解物种的遗传结构和分化状况 随机扩增的多态性 DNA 标记 RAPD randomly amplified polymorphic DNA 克服了同功酶标 记位点偏少和 RFLP AFLP 标记操作复杂的弊端 虽然具有对反应条件敏感 重复性不高 共迁移条 带可能无同源性等缺点 但简单易掌握 周期短 花费低 因而在短期内取得了迅速发展和广泛应 用 人们也已发现 对反应条件和反应体系进行优化和严格化 上述问题能够得到很好解决 成功 应用于遗传多样性检测 基因定位 品系鉴定 遗传图谱的构建和系统学研究等领域 汪小全等 1996 胡志昂 恽锐 1997 戴思兰等 1998 邹喻苹等 2001 Aagaard et al 1998 E J Esselman 2000 Kur Ta Cheng 2000 Markus Fischer 2000 M Sun and K C Wong 2001 八角莲 Dysosma versipellis Hance M Cheng 和六角莲 D pleiantha Woods 隶属小檗科 Berberidaceae 鬼臼亚科八角莲属 是中国南方特有的多年生草本植物 分布于秦岭 淮河以南 在 1984 年第一批国家珍稀濒危保护植物名录中被列为三级保护对象 傅立国等 1992 目前多存 在于亚热带常绿阔叶林 阔叶针叶混交林 竹林下的荫湿处 八角莲根状茎作药用 具很高的清热解 毒 抗毒 State Key Basic Research and Development Plan of China G2000046806 Corresponding author Tel 86 571 86971576 Fax 86 571 86971634 E mail fucxsmi 蛇咬伤等价值 近年来的研究表明 其活性成分有抗癌活性 特别用于治疗食道癌 子宫癌 由于八 角莲和鬼臼亚科植物药用价值较高 花和叶较美丽 可供观赏 虽然可用分株和播种繁殖 但栽培条 件下生产周期太长 5 8 年 难以满足医药等领域的需要 人们逐年采挖 资源已近枯竭 近年来 滥挖乱采现象更趋严重 加上可能自身生殖机制的限制和荫暗潮湿的森林生境遭到人类强烈破坏 八 角莲的栖息地面积逐渐缩小 造成严重的分布片段化 资源量锐减 物种濒于灭绝 亟待保育 至今为止 对该种在分类和演化 应俊生 1979 李林初 1986 Henry et al 1989 马绍宾 胡志浩 1997 生物学 庄平等 1993 生态学 庄平等 1993 细胞学 张定成等 1991 形 态解剖学 苏应娟等 1994 孢粉学 张金谈 1983 苏应娟等 1994 小孢子发育 黄衡宇 马 绍宾等 2001 植物化学 药剂有效成分 药理药效 药材品种鉴定 Fu Rongzhao et al 2000 和栽培技术 黄国林 1999 等方面 已有一些研究报道 但对于八角莲的基础性研究 如确切分布 区 资源量与破坏程度 居群生态学 繁育生物学 尤其是居群内 居群间的遗传多样性及遗传结构 分布区狭小 稀有濒危的原因及机制 如何就地和迁地保育 如何取样等 尚未见报道 本研究选取长江流域作为居群采样地区 长江流域不仅在中国乃至世界生物多样性中都独具特色 它还是中国国民经济发展 自然资源利用与生物多样性保育之间矛盾最为冲突的地区 因此 选取这 一区域开展生物多样性保育具有重大科学和现实意义 本研究的对象八角莲在分类上明确 具有一定 居群和个体数量 但已处于濒危状态 也具有一定的研究背景 较适合特有濒危植物遗传多样性和濒 危机制及保育策略的研究 而且 近年来人们对濒危植物的研究多集中在高大乔木 对林下的草本研 究不多 但林下的草本植物对生态系统的维护具有不可替代的重要作用 所以 对八角莲遗传多样性 和保育生物学的研究 无论是在理论价值还是在实际应用上 都是非常重要和有意义的 本研究旨在在长江中下游流域有代表性地选取 5 个八角莲居群和浙江天目山六角莲居群 基于 RAPD 分析 探讨八角莲的遗传多样性 遗传结构及八角莲与六角莲的关系 提出八角莲的保育和取样 策略 并结合已有物种的研究数据 探讨我国珍稀濒危植物就地保育的有效性 迁地保育中生活力衰 退 遗传多样性丧失的原因 为迁地和就地保育中取样的策略等基础问题提供理论指导 2 2 材料与方法材料与方法 2 12 1 材料材料 通过广泛的野外居群资源调查 在长江中下游地区有代表性地选取安徽天堂寨 AH 江西彭泽县 JX 湖北神农架 HB 湖南天平山 HN 四川峨眉山 SC 5 个八角莲居群和浙江天目山 ZJ 1 个六角莲居群 每居群随机采样 15 20 株 每株间隔 20 米以上 见图 1 表 1 叶片经硅胶迅速干燥 保存至 DNA 提取 标本存放于浙江大学植物标本室 图图 1 1 八角莲和六角莲长江中下游取样示意图八角莲和六角莲长江中下游取样示意图 Fig 1Fig 1 LocalitiesLocalities ofof populationspopulations sampledsampled inin thethe YangziYangzi RiverRiver drainagedrainage ofof D versipellisD versipellis andand D pleianthaD pleiantha 2 22 2 DNADNA 提取 检测与扩增提取 检测与扩增 2 2 12 2 1 基因组基因组 DNADNA 的提取的提取 应用 CTAB 法提取八角莲和六角莲的总 DNA Doyle 1991 2 2 22 2 2 DNADNA 浓度测定及纯度检测浓度测定及纯度检测 取各样品 DNA 提取液 2 l 稀释至 100 l 并用 100 l TE 溶液作空白对照校零点 在紫外分 表表 1 1 八角莲和六角莲取样居群产地及生境八角莲和六角莲取样居群产地及生境 TableTable 1 1 TheThe localitylocality andand habitathabitat ofof populationspopulations sampledsampled populationpopulationlocalitylocalityhabitathabitatVouchersVouchers HNHNTianping Mt Under deciduous broadleaf forest Li200140801 16 HBHBShengnongjia Mt Under deciduous mixed coniferous broadleaf forest Li200140401 20 JXJXPengzhe Under bamboo forest Zhou200172801 15 AHAHTiantangzhai Mt Under bamboo and deciduous broadleaf forest Li200092001 20 SCSCEmei Mt Under bamboo and evergreen broadleaf forest and mixed coniferous broadleaf forest Li200081001 20 ZJZJTianmu Mt Under deciduous broadleaf forest and mixed coniferous broadleaf forest Li200150401 16 光光度计 751 型 上海第三光学分析仪器厂生产 上测定 DNA 的浓度和纯度 根据 OD260 OD280和 OD230 OD280的比值判断 DNA 样品的纯度 通过 0 8 琼脂糖凝胶电泳估测 DNA 分子量大小和降解程度 2 2 32 2 3基因组基因组 DNADNA 扩增扩增 引物购自上海 Sangon 公司 为十聚体寡核苷酸随机引物 本实验选用三个居群各一个样本从 100 个引物中筛选了扩增效果良好的 16 个引物 条引物序列见表 2 用于八角莲遗传多样性检测 PCR 试剂购自宝生生物工程 大连 有限公司 PCR 反应总体积为 25 l 其组成如下 Primer 20ng ul 1 5 l MgCL2 2 5mmol L dNTPs 0 8mmol L 10 PCR buffer 2 5 l Taq DNA 聚合酶 5U ul 0 24 l 模板 DNA 10ng ul 4 0 l ddH2O 无菌 12 26 l 每次按 100 个反应 管配制 PCR 反应体系 然后分装 再仔细地分别加入各 DNA 模板 扩增反应在 PTC 200 型扩增仪 MJ Research Lt USA 上进行 扩增条件为 94 变性 4Min 94 变性 15s 38 复性 30s 72 延伸 75s 45 个循环 72 延伸 7min 反应产物在 4 下短期保存或 20 长期保存至电泳检测 2 2 42 2 4 电泳及电泳及 DNADNA 多态性的观察多态性的观察 PCR 产物在 1 5 琼脂糖凝胶中电泳分离 EB 0 5mg L 直接加在凝胶中 在 3 4V cm 电压下 电泳 3h 左右 用数码紫外观察仪记录结果 2 2 52 2 5 扩增产物的分析方法扩增产物的分析方法 2 2 5 12 2 5 1 带的记录带的记录 电泳图谱中的每一条带均为一个分子标记 Marker 并代表一个引物的结合位点 按凝胶同一 位置上 DNA 带的有无进行统计 有带 包括弱带 的记为 1 无带的记为 0 2 2 5 22 2 5 2 遗传多样性分析方法遗传多样性分析方法 在所有条带的 1 0 数据矩阵基础上 用 Popgene 分析软件 Baranek M 2001 分析各引物每居 群和物种的多态性条带数和多态带百分率 统计每居群的平均多态性条带数和平均多态带百分率 并 得到居群和物种的观测等位基因数 Na 有效等位基因数 Ne Nei s 遗传多样性指数 H 及 表表 2 2 十聚体随机引物及序列十聚体随机引物及序列 TableTable 2 2 RandomRandom OligonucleotideOligonucleotide pimerpimer sequencesequence PimerPimerpimerpimer sequencesequencepimerpimerpimerpimer sequencesequencepimerpimerpimerpimer sequencesequence S15 GTTTCGCTCC 3 S425 GGACCCAACC 3 S605 ACCCGGTCAC 3 S25 TGATCCCTGG 3 S435 GTCGCCGTCA 3 S665 GAACGGACTC 3 S215 CAGGCCCTTC 3 S455 TGAGCGGACA 3 S715 AAAGCTGCGG 3 S225 TGCCGAGCTG 3 S515 AGCGCCATTG 3 S765 CACACTCCAG 3 S255 AGGGGTCTTG 3 S525 CACCGTATCC 3 S33CAGCACCCACS55CATCCGTGCT shannon 多样性指数 I 得到 Nei s 遗传一致度 I 和遗传距离 D 值矩阵 在遗传距离的基础 上 采用非加权配对算术平均法 通过 Treeview 软件绘出各居群关系图 并计算出居群遗传分化指 数 Gst 和基因流 Nm 值 为了更加清楚地了解八角莲的遗传结构 对所有条带的 1 0 数据矩阵 进行欧氏距离系数平方处理 在此基础上采用 AMOVA 分析软件 Zhang fu Min Ge Song 2002 分析 八角莲和六角莲之间 八角莲长江以南居群和长江以北居群之间的遗传变异 3 3 结果与分析 结果与分析 3 13 1 八角莲遗传多样性水平分析八角莲遗传多样性水平分析 多态位点百分率是遗传多样性的一个粗略估计 虽然随引物选择标准会有较大差异 但若测试的 引物较多时 也可以显示物种水平和居群水平的遗传多样性高低 八角莲和六角莲各居群的 DNA 多态 位点百分率及总多态位点百分率见表 3 表表 3 3 1616 条引物检测的八角莲和六角莲六个居群的多态位点及多态率条引物检测的八角莲和六角莲六个居群的多态位点及多态率 Tab 3Tab 3 PolymorphicPolymorphic lociloci detecteddetected byby 1616 primersprimers forfor fivefive populationspopulations ofof D versipellisD versipellis andand a a populationpopulation ofof D pleianthaD pleiantha PolymorphicPolymorphic bandsbands andand polymorphismpolymorphism ratioratio ofof individualindividual populationpopulation pimerpimer codecode TotalTotal bandsbands ZJZJHNHNAHAHHBHBSCSCJXJX TatalTatal polymorphismpolymorphism S1S113 2 0 15 3 0 23 2 0 15 1 0 08 1 0 08 2 0 15 9 0 69 S2S214 2 0 14 4 0 28 4 0 24 2 0 14 2 0 14 2 0 14 11 0 79 S21S2124 7 0 29 5 0 21 0 5 0 21 6 0 25 3 0 13 17 0 71 S22S2211 4 0 36 3 0 27 3 0 27 2 0 18 1 0 08 3 0 27 8 0 73 S25S2514 3 0 21 2 0 14 3 0 21 3 0 21 2 0 14 4 1 0 07 11 0 79 S33S3313 1 0 08 00 1 0 08 2 0 16 1 0 08 7 0 56 S42S42142 0 14 1 0 07 02 0 14 2 0 14 2 0 14 5 0 0 36 S43S431802 0 11 5 0 28 1 0 06 4 0 22 1 0 06 11 0 61 S45S45191 0 05 6 0 32 01 0 05 1 0 05 5 0 26 11 0 58 S51S5123 4 0 17 1 0 04 4 0 17 5 0 22 3 0 13 3 0 13 17 0 74 S52S5216 4 0 25 5 0 31 5 0 31 5 0 31 7 0 44 4 0 25 14 0 88 S55S5521 1 0 05 0 2 0 10 1 0 05 5 0 24 2 0 10 16 0 76 S60S6017 4 0 24 0 3 0 18 2 0 12 2 0 12 1 0 06 6 0 36 S66S6692 0 22 2 0 22 2 0 22 1 0 11 01 0 11 6 0 67 S71S7118 2 0 11 5 0 28 3 0 17 1 0 06 2 0 11 2 0 11 10 0 56 S76S7611 2 0 18 1 0 09 2 0 18 2 0 18 5 0 45 1 0 09 6 0 55 summasumma tiontion meanmean 255 16 41 0 16 40 0 16 38 0 15 35 0 14 45 0 18 34 0 13 165 0 65 从表 3 可知 16 个引物检测的位点数从 9 到 24 不等 平均每条引物约检测 16 个位点 不同引 物检测的总多态位点比率从 36 到 88 不等 平均总多态位点比率为 65 多态性随引物和居群变化较 大 居群内平均多样性位点从 13 JX 居群 到 18 HN 居群 平均为 15 说明遗传变异主要存在 于居群间 居群内遗传多样性水平较低 且不同居群遗传多样性水平相差不大 六个居群根据 Popgene 分析软件得出的观测等位基因数 Na 有效等位基因数 Ne Nei s 遗传多样性 H 及 shannon 信息指数 I 如表 4 六个居群观测等位基因数 Na 有效等位基因数 Ne 相差不大 分别从 1 1373 JX 至 1 2000 HN 和从 1 1054 JX 至 1 1432 HN 总的观测等位基因数 Na 有效等位基因数 Ne 分别为 1 7020 1 4156 说明各居群纯和体过量 杂和体不足 与其自交的授粉机制一致 表 4 显示了六个居群的遗传多样性 H 值从 0 0586 JX 到 0 0802 HN 不等 种水平为 0 240 说明江西居 群的遗传多样性最低 湖南居群的遗传多样性最高 其它居群相互接近 同时显示了六个居群的 Shannon 值在 0 0845 0 1167 之间 总体为 0 3603 并表现出与 H 值一致的特点 即江西居群的 Shannon 值最低 湖南居群最高 其它的居群较为接近 在去除浙江 ZJ 的六角莲居群后 八角莲 五个居群计算的各项指标在数值上稍有降低 说明六角莲具有独特的基因序列 基于 Nei s 1972 遗传距离 采用非加权配对算术平均法 UPGMA 用 PHYLIP Version 3 5 和 Treeview 软件分析各居群 RAPD 条带 计算出八角莲各居群与六角莲居群 ZJ 的遗传一致 度 I 和遗传距离 D 表 5 并得出各居群的聚类图 图 2 表表 4 4 Popgene32Popgene32 软件对八角莲软件对八角莲 5 5 个居群和六角莲居群的遗传多样性分析统计个居群和六角莲居群的遗传多样性分析统计 Tab 4Tab 4 AnalysisAnalysis ofof geneticgenetic diversitydiversity statisticsstatistics byby popgenepopgene softwaresoftware Population SampleSample SizeSizeNaNaNeNeH HI IPPBPPB SCSC131 18041 13500 07370 106417 65 JXJX151 13731 10540 05860 084513 37 HBHB151 19221 11780 07000 104513 73 HNHN131 20001 14320 08020 116715 69 AHAH141 14901 10730 05970 086914 91 ZJZJ151 16081 11630 06480 094116 08 SixSix populationspopulations 851 70201 41560 24070 360364 71 FiveFive populatinspopulatins 701 66671 39400 22800 341564 14 图图 2 2 八角莲各居群和六角莲居群基于八角莲各居群和六角莲居群基于 RAPDRAPD 遗传距离 遗传距离 Nei sNei s 的 的 UPGMAUPGMA 聚类图聚类图 Fig 2Fig 2 DendrogramDendrogram basedbased onon Nei sNei s GeneticGenetic distancedistance ofof D versipelliD versipellis andand D D pleianthapleiantha 从聚类图可以看出 六角莲与八角莲明显形成 2 支 四川峨眉山居群和安徽天堂寨居群首先聚 在一起 湖北神农架居群和江西居群遗传距离较近 八角莲各居群并不表明出分布特点 3 23 2 八角莲遗传结构分析八角莲遗传结构分析 根据 Popgene 分析软件得出的总遗传变异 Ht 遗传分化指数 Gst 基因流 Nm 如表 5 从表 5 数据可知 八角莲物种遗传多样性水平较高 居群内遗传多样性水平较低 居群遗传分 化较大 与我们观察到所研究的居群在形态性状上都互相表现出某些独特的特征 而且不同居群具 有不同特异形态的个体的情况符合 在欧氏距离系数平方的基础上 把 5 个八角莲居群和六角莲居群按不分组 分为八角莲和六角 莲两组和分为长江以南 长江以北两组 以及将 5 个八角莲居群分为长江以南 长江以北两组 然后 表表 5 5 基于基于 Nei sNei s 1972 1972 上的八角莲各居群遗传一致度和遗传距离上的八角莲各居群遗传一致度和遗传距离 Tab 5Tab 5 Nei sNei s OriginalOriginal MeasuresMeasures ofof GeneticGenetic IdentityIdentity andand GeneticGenetic distancedistance populationpopulationSCSCJXJXHBHBZJZJHNHNAHAH SCSC 0 80510 78630 78050 77860 8098 JXJX0 2168 0 80700 78520 78480 7569 HBHB0 24040 2144 0 73840 77870 7673 ZJZJ0 24780 24190 3033 0 77520 7515 HNHN0 25030 24240 25020 2546 0 7710 AHAH0 21090 27850 26490 28570 2601 Nei s genetic identity above diagonal and genetic distance below diagonal 表表 5 5 由由 P PO OP PG GE EN NE E 软软件件计计算算的的遗遗传传分分化化 Tab 5Tab 5 AnalysisAnalysis onon gengticgengtic variationvariation ofof D versipellisD versipellis andand D pleianthaD pleiantha byby POPGENEPOPGENE softwaresoftware H Ht tG Gs st tN Nm m Six populations0 24020 7170 0962 five populations0 22900 70120 1066 用 AMOVA 软件进行的巢式分析 Nested Analysis 结果如表 6 Tab 6Tab 6 NestedNested AnalysisAnalysis onon gengticgengtic variationvariation ofof D versipellisD versipellis andand D pleianthaD pleiantha inin differentdifferent groupinggrouping methodsmethods byby AMOVAAMOVA softwaresoftware GroupingGrouping methodsmethods GeneticGenetic variationvariation SixSix populationspopulations andand nono groupinggrouping SixSix populationspopulations divideddivided intointo D versipellisD versipellis andand D pleianthaD pleiantha SixSix populationspopulations divideddivided intointo southernsouthern thethe yangzhiyangzhi riverriver andand northernnorthern thethe yangzhiyangzhi riverriver fivefive populationspopulations divideddivided intointo southernsouthern thethe yangzhiyangzhi riverriver andand northernnorthern thethe yangzhiyangzhi riverriver BetweenBetween groupgroup 2 17 1 60 2 22 BetweenBetween pop withinpop within groupgroup 68 84 69 47 72 56 TheThe thirdthird layerlayer InIn pop pop 28 99 28 92 29 66 withinwithin pop pop 29 11 29 40 29 11 29 40 TheThe secondsecond layerlayer BetweenBetween pop pop 70 89 70 60 70 89 70 60 withinwithin groupgroup 64 43 76 26 73 47 TheThe firstfirst layerlayer BetweenBetween groupgroup 35 57 23 73 26 51 当把 6 个居群分为分为八角莲 六角莲两组时 组间遗传变异为 2 17 组内居群间为 68 84 居群内为 28 99 当把 6 个居群分为长江以南 长江以北两组时 组间遗传变异为 1 60 组内居群间为 69 47 居群内为 28 92 当去除六角莲居群 把 5 个八角莲居群分为长江以南 长江以北两组时 组间遗传变异为 2 22 组内居群间为 72 56 居群内为 29 66 上述结果说 明分布长江以南和长江以北的八角莲居群分化很小 居群内虽存在一定的遗传变异 但遗传变异主 要存在于八角莲居群间 另外 AMOVA 软件不同分组方法居群内遗传变异为 29 11 29 40 居 群间遗传变异为 70 60 70 89 与 POPGENE 软件分析的居群间遗传分化一致 4 4 讨讨论论 4 4 1 1 影影响响八八角角莲莲遗遗传传多多样样性性和和遗遗传传结结构构的的因因素素 一般认为 地理隔离和生殖隔离会引起近交 近交的繁殖方式将引起近交衰变 从而降低居群 内的遗传多样性 同样会降低居群间基因流 加剧居群间的分化 Tianhua He et al 2000 Maile C Neel et al 2001 而无性繁殖则会降低居群的有效大小 降低居群内的遗 传多样性 而且同样会降低居群间基因流 增加居群间分化 G Young 2002 Sedonia D Sipes 1998 八角莲的居群内低遗传多样性和很大的居群分化 与它的内繁殖特性 自花授粉 营养繁殖 有着密切的关系 与现有小居群的建群效应 founder effects 和相似的生境选择压 力紧密相关 而且遗传漂变对该物种的现有遗传结构起了重要作用 也说明在八角莲的进化历史 中曾经存在或正在经历小居群效应 致使其丧失了大量的遗传多样性 与周长征等 2000 报道 的细辛 Asarum sp L 和孙梅等 2001 报道的白花线柱兰 Zeuxine strateumatica 遗传多 样性低 居群间遗传分化大的情况极为相似 张大勇等 1999 认为 特有种 孑遗种并不一定表现为遗传多样性的缺乏 而广布种也可能 由于特殊原因正处在受威胁之中 最近才出现大的居群波动导致遗传变异急剧下降的物种 比历史 上长期处于稀有状态的物种灭绝的危险性要大得多 从八角莲属极其近缘类群的演化研究表明 马 绍宾 1997 Jianquan Liu et al 2002 首先是山荷叶属 Diphylleia 因第三纪及第四纪地 球生态环境急剧变化 分布上逐渐向南退却 只在某些冰川达不到的地方得以保存下来 冰期以后 由于山荷叶属缺乏有效的种子散布方式 使它不能重新占领在冰期间失去的分布区 这种变化的结 果形成了山荷叶属今天这种岛状分布格局 由于东亚地域广大 环境条件多样 中华山荷叶 D sinensis 在这里分化形成了各种八角莲 而后八角莲属的某个种在青藏高原和喜马拉雅抬升过 程中 逐渐适应了高海拔寒冷与干早的气候条件而分化为桃儿七 Sinopodophyllum hexandrum Royk Ying 然而 人类上百年的过度干扰 使八角莲生境岛屿化 居群片段化 近交衰退和遗传 漂变现象增加 降低了其遗传多样性 作者认为 八角莲由于有性繁殖能力较弱 为了扩大居群竞 争力和增强个体适合度 利用营养繁殖来消除一些遗传漂变的负面效应 反过来又促进了居群内的 近交 以维系居群内的遗传多样性 从生态学角度看 八角莲对生境要求严格 生长于肥沃 近中性的黄棕壤和潮湿遮荫的植被环境 居群间生境具有较高相似性 相对单一 可以认为这是一种干扰较少的环境 调查发现 八角莲座果 率和结实率低下 也就意味着产生新的遗传变异的机会很少 从而使其在进化过程中丧失了对新环境 的适应性 而且 在无干扰的环境中 营养繁殖在选择上占有优势 这些因素可能导致了八角莲居群 水平遗传多样性低 居群分化大的现状 同时也可能是八角莲分布局限和生长在相对简单的生境的主 要原因 4 4 2 2 八八角角莲莲与与其其他他物物种种基基于于 RAPD 标标记记研研究究结结果果的的比比较较 利用 RAPD 标记对多年生植物遗传多样性研究的工作已有较多报道 魏伟 王洪新等 1999 对毛乌素沙地柠条 Caragana spp RAPD 分析发现 82 4 的变异存在居群内 只有 17 6 的 变异存在群体间 戴思兰 王丽霞等 1998 对刺五加 Eleutherococcus senticosus RAPD 标 记表明 刺五加居群内和居群间的遗传多样性均较为丰富 李峰等 1999 用 RAPD 标记对不同生 境的 3 个北黄花菜 Hemerocallis lilioasphodelus L 居群的遗传多样性研究表明 RAPD 多态 性位点平均为 56 67 其中 82 35 位于居群内 居群间遗传分化指数 Gst 为 0 231 并认为居群 的遗传多样性水平与其生境具有相关性 且居群间的遗传距离与其地理分布也具有相关性 Ester Sales等 2001 对巴利亚利群岛特有的小洋地黄 Digitalis minor 的居群遗传变化的 RAPD 分 析显示 该物种具有较高的遗传多样性和较低的 居群间遗传分化 与其远缘杂交的特点相符合 Markus Fischer等 2000 对松叶毛茛 Ranunculus reptans 的研究结论为 由于松叶毛茛的自 交不育和基因流较小 Nm 0 70 无论是地区间 居群间还是个体间都存在显著的遗传差异 而且 差异大小与居群大小成正相关 M Sun and K C Wong 2001 对远交的Zeuxine gracilis 和 Eulophia sinensis 及单性生殖的 Zeuxine strateumatica RAPD 研究结果表明 如果不考虑繁育系 统的差别 三个种的遗传变异主要存在于居群间 各个种的遗传结构与其授粉机制和克隆特性密切 相关 Chengxin Fu 等 2003 通过对 Changium smyrnioides 的 RAPD 研究认为其居群间的变异大 于居群内 居群内遗传变异与居群生境有直接关系 研究结果为该植物的保护和取样策略提供了一 个重要的基础 并认为 RAPD 对评价珍稀特有植物的遗传多样性和揭示居群间关系提供了一个很有 用的工具 而自花受粉兼有异花授粉的桃儿七 Podophyllum hexandrum B M Singh et al 2000 在7 个特意挑选的 RAPD 引物中的多态率达 100 但聚类图显示个体既不按外部形态聚在 表表 7 7 相关物种基于相关物种基于 RAPDRAPD 标记研究结果比较标记研究结果比较 Tab 7Tab 7 Comparison with relationalrelational speciesspecies studiedstudied resultsresults basedbased onon RAPDRAPD SpeciesSum of population individuals Sum of primer Tptal bands and polymorph ism ratio Variance among populations Variance within populations gene flow Relation To geography Caragana spp6 9 13 pop 5154 99 4 17 6 82 4 5 96 positive correlation Eleutherococcus senticosus 3 49 8 127 94 5 highhigh Hemerocallis lilioasphodelus 3 23 16180 56 7 17 66 82 34 1 67 positive correlation Digitalis minor17 162 6 141 96 28 6 71 4 NO correlation Ranunculus reptans 14 127 36 124 30 6 5 26 3 73 7 0 70 NO correlation Zeuxine gracilis6 74 1677 53 0 17 positive correlation Zeuxine strateumatica 10 50 1471 49 0 02 positive correlation Eulophia sinensis7 38 1497 79 0 13 NO correlation Changium smyrnioides 5 35 13 92 69 51 2 48 8 0 24 Podophyllum hexandrum 2 30 776 100 NO correlation Dysosma versipellis 6 85 16251 64 14 70 34 29 66 0 11NO correlation 表表 8 8 Comparison with s st tu ud di ie ed d r re es su ul lt ts s o of f Nybom 2000 Variable NstudiesHpopN STNGst dicotyledons 270 191590 36190 32 short lived perennial 130 207320 39130 30 endemic range50 191140 2050 19 narrow range4 0 233150 34 70 22 Regional range160 222270 4390 35 widespread range150 208190 429 0 33 Selfing breeding system80 091120 7050 59 Gravity Seed dispersal160 212360 44160 30 Early Successional status100 166200 458 0 50 mid Successional status190 195310 40130 23 Late Successional status120 287220 2190 20 Dysosma versipellis0 150 70 一起也不按地理位置聚在一起 从表 7 和表 8 可知 八角莲物种的遗传多样性水平处于以上物种的中间水平 具有一定的变 异潜力 可能在历史上具有较大适应性而得以广泛分布 同时也可发现 物种的生物学性质 特别 是繁育方式和生活型 对物种的遗传多样性水平和遗传结构有着重大影响 与Nybom 等 2000 对 RAPD 研究数据和 Hamrick 等 1990 对等位酶研究数据总结得到的结论一致 八角莲居群间遗传多样性水平差异不大 与相似的生境有一定关系 与 北黄花菜的研究结论一致 而八角莲的基因流较小 仅为 0 2131 居群间应存在较大的遗传差异 与 松叶毛茛的情况相似 但八角莲虽被认为是自花授粉 而野外和我们移栽的植株均表现出座果率低下 8 据我们初 步的授粉实验表明 八角莲为自交可育但座果需要外界媒介的物种 因此 野外小居群的建群效应 和遗传漂变就比较明显 导致实验的 居群内取样可能为近交繁殖的植株或同一植株散落种子的实生 植株 在本研究数据中则表现出较低的居群遗传多样性和很高的居群遗传分化 4 34 3 遗传距离与地理分布关系遗传距离与地理分布关系 虽然有研究表明遗传距离与地理分布有相关性 Hamrick Godt 1990 Ayres D R and F J Ryan 1999 李峰等 1999 周长征等 2000 但也有研究证明 选择 突变和基因流等的作用产 生了遗传分化 而空间距离并不一定产生遗传分化 Markus Fischer et al 2000 Leeton and Fripp 1991 M Fischer and D Matthies 1998a Berge Nordal and Hestmark 1998 Schmidt and Jensen 2000 李昂等 2000 这些一方面说明 即使存在不断的基因流 强有力的选择也能使彼此相距很 近的群体保持遗传上的差别 另一方面也说明 当选择作用不那么明显时 只要有很小量的基因流便 可有效地阻止群体分化 只有在基因流只因地理上的隔离而阻碍 而且这种基因流不被强大的遗传漂 变所覆盖时 地理与遗传变异的关系才有密切联系 Markus Fischer et al 2000 通过 RAPD 标记对八角莲居群的遗传结构进行检测的结果表明 八角莲居群具有较低水平的遗传 多样性水平和较高的遗传分化 根据遗传距离得出的居群间关系图与地理分布并无关系 说明本研究 的八角莲居群取样地理距离较大 基因流不仅因地理上的隔离而阻碍 并且居群内存在很强的遗传漂 变 这种随机的漂变很可能固定了有害的阻碍自交繁殖的基因 而自然和人类的选择又保存了这样的 植株 根据 Aide T M 和 Rivera E 1998 对等位酶以及 Nybom 等 2000 对 RAPD 数据研究的结 论 较大的居群取样地理距离 也是形成居群遗传变异参数较大的主要原因 特别是自交植物 4 44 4 八角莲与六角莲的关系八角莲与六角莲的关系 稳定的形态变异是建立在一定的遗传基础上的 并能在基因水平的检测中反映出来 根据花的 着生位置把八角莲和六角莲划分为两个种 尽管存在一些过渡 但分子标记体现了八角莲和六角莲划 分的依据 鬼臼类植物的叶裂反映了其对气候条件的适应 马绍宾 胡志浩 1997 作者发现六角莲叶裂 较浅 与其多分布在我国降水较多的东部一致 在安徽 叶裂较深的八角莲主要分布在安徽北部和南 部山区 而叶裂较浅的六角莲在安徽南部山区 在安徽天堂寨居群中发现的具有两种着生位置花的植 株 也表明了二者的联系 RAPD 标记显示 六角莲居群与八角莲居群的遗传距离较大 在聚类图中六 角莲居群与八角莲居群形成明显的两支 支持六角莲是一个独立种 而且 在 RAPD 扩增条带中六角 莲居群独有或缺失的 4 个条带 分别为 S25 bp S43 bp bp S71 bp absence 4 54 5 保育策略保育策略 通过对八角莲居群生态 繁育生物学特性和遗传多样性与遗传结构 3 个方面的综合分析 可以 认为八角莲目前的濒危状况是许多因素的叠加效应 既有来源于该种本身进化中的系统压力 也有外 界环境灾害随机因素的作用 八角莲濒危最主要的内在因素是其繁殖能力与繁殖效率低 居群复壮最 主要的途径就是要提高其繁殖能力与繁殖效率 促进基因流动 增加远交机会 减少自交衰退 具体 措施是人工促进居群内与居群间的传粉 增加后代的基因杂合度 八角莲较高的遗传变异存在居群间 也要求只有迁地保育才能保存最大的遗传多样性 另外 促进种子在居群内与居群间的散布也是促进 基因流动的有力措施 人工苗移植到适宜的原生境中也是促进居群发展的有效途径 因此 迁地保育 对于八角莲具有更直接 更重要的意义 而且 遗传学 繁育生物学和栽培学已经证明这是可行的 由于八角莲遗传多样性主要保持在各居群之间 而居群内则较低 迁地保育时应考虑在较多居群取样 每个居群可少取样 参考文献 参考文献 Aagaard JE Krutovskii KV Strauss 1998 RAPDs and allozymes exhibit similar levels of diversity and differentiation among populations and races of Douglasfir Heredity 81 69 78 Aide T M RAPD marker diversity within and divergence among species o