（微生物学专业论文）一株赤潮异弯藻溶藻细菌的分离与溶藻特性研究.pdf

硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 摘要 有害赤潮的频繁爆发造成海洋渔业的严重损失 也严重影响人们的生活和健 康 已成为全球性的环境问题 为了治理赤潮 人们采用了很多方法 在利用化学 物理 其它生物方法治理赤潮不很理想的情况下 溶赤潮藻微生物的研究逐渐进入 人们的视野 本研究从武汉市沿东湖湖岸土壤中分离到一株对赤潮异弯藻 h e t e r o s i g m aa k a s h i w o 有溶解效果的细菌 编号为f 5 2 并对其溶藻方式进行了研 究 同时对该菌溶解海洋卡盾藻 c h a t t o n e l l am a r i n a 海洋原甲藻 p r o r o c e n t r u m m i c a n s 微小原甲藻 p r o r o c e n t r u mm i n i m u m 金藻 c h r y s o p h y t a 牟氏角毛藻 c h a e t o c e r o sm u e l l e r i 锥状斯克里普藻 s c r i p p s i e l l at r o c h o i d e a 的溶解效果进行了研 究 结果表明 该菌株对赤潮异弯藻 h a k a s h i w o 有良好的溶藻效果 并对锥状斯 克里普藻 t r o c h o i d e a 海洋原甲藻僻m i c a n s 微小原甲藻 p m i n i m u m 也有溶藻 效果 但是对海洋卡盾藻 c m a r i n a 牟氏角毛藻 c m u e l l e r 金藻 c h r y s o p h y t a 的生长却没有影响 该菌溶藻无需菌体与藻细胞直接接触 是通过分泌某种胞外溶 藻物质溶藻 通过乙醇沉淀 透析等相关试验 初步认为该菌可能是通过胞外释放 的一种多糖或其他物质进行溶藻 该菌革兰氏染色呈阴性 并进行了相关生理生化 试验 利用1 6 s r d n a 序列分析对其进行了鉴定表明 f 5 2 菌株与多株铜绿假单胞 菌 p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a 的1 6 s r d n a 核苷酸序列的同源性均在9 9 以上 归属于假单胞菌属 关键词 赤潮藻 溶藻细菌 异弯藻 假单胞菌 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s a b s t r a c t t h ei n c r e a s e dt o x i cd i n o f l a g e l l a t eb l o o m sh a v ei n f l u e n c e dt h ep e o p l e sl i r ea n d h e a l t h a n di th a sb e c o m et h es e r i o u sp r o b l e mi nt h ew h o l ew o r l d r e c e n t l y a l g i c i d a l b a c t e r i ah a v ea t t r a c t e dw i d ea t t e n t i o n sa sp o s s i b l ea g e n tf o ri n h i b i t i n ga l g a lb m o m s t h e a i mo ft h i ss t u d yw a st oi s o l a t ea n di d e n t i f ya l g i c i d a lb a c t e r i aa g a i n s tt h ed i n o f l a g e l l a t e h e t e r o s i g m aa k a s h i w o a n dt od e t e r m i n et h ea l g i c i d a la c t i v i t ya n da l g i c i d a lr a n g e a n a l g a e l y s i n gb a c t e r i u ms t r a i nf 5 2w a si s o l a t e df r o my a n d o n gl a k ei nw u h a nc i t y w h i c hh a sa l g i c i d a le f f e c t st oh a k a s h i w o f 5 2s h o w e ds i g n i f i c a n ta l g i c i d a la c t i v i t i e s a g a i n s th a k a s h i w oa n dt h r e eo t h e rd i n o f l a g e l l a t e s i n c l u d i n gs c r i p p s i e l l at r o c h o i d e a p r o r o c e n t r u mm i c a n s p r o r o c e n t r u mm i n i m u m b u ts h o w e dn oe f f e c t so i lc h a t t o n e l l a m a n n a c h a e t o c e r o sm u e l l e r i c h r y s o p h y t a o nt h eb a s i so fb i o c h e m i c a la n d c h e m o t a x o n o m i cc h a r a c t e r i s t i c s a n da n a l y s i so f16 s r d n as e q u e n c e s f 5 2b e l o n g e dt o t h eg e n e r ap s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a f 5 2w a sag r a m n e g a t i v eb a c t e r i a a n di tw a s a s s u m e dt ol y s ea l g a eb ys e c r e t i n ga l le x t r a c e l l u l a rp o l y s a c c h a r i d e sa l g i c i d a ls u b s t a n c e s o ro t h e ra l g i c i d a ls u b s t a n c e s t a k e nt o g e t h e r o u rr e s u l t ss u g g e s tt h a tf 5 2c o u l db ea c a n d i d a t ef o rc o n t r o l l i n gr e dt i d e s k e y w o r d s r e d t i d e s a l g a e l y s i n gb a c t e r i u m h e t e r o s i g m a a k a s h i w o p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a 华中师范大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明 所呈交的学位论文 是本人在导师指导下 独立进行研究工作 所取得的研究成果 除文中已经标明引用的内容外 本论文不包含任何其他个人或 集体已经发表或撰写过的研究成果 对本文的研究做出贡献的个人和集体 均已在 文中以明确方式标明 本声明的法律结果由本人承担 作者签名 组硷衿 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留 使用学位论文的规定 即 学校有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版 允许论文被查阅和借 阅 本人授权华中师范大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索 可以采用影印 缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文 同意华中 师范大学可以用不同方式在不同媒体上发表 传播学位论文的全部或部分内容 作者签名 弥论诌 导师签名 益t 勾1 l 允许北京万方数据电子出版社出版的 中国学位论文全文数据库 将本人论文 以电子 网络 镜像及其他数字媒体形式公开出版 作者签名 你辁於 本人已经认真阅读 c a l i s 高校学位论文全文数据库发布章程 同意将本人的 学位论文提交 c a l i s 高校学位论文全文数据库 中全文发布 并可按 章程 中的 规定享受相关权益 回童途塞握童卮溢卮 旦圭生 鱼兰生 旦三生筮查 作者签名 孑未税旋 日期 彬年彳月毋日 e 6 i liil j r j口翘月关 办 各 加 签 师期 争日 一 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 1 赤潮的危害 第一章文献综述 近年来 由于人类的活动以及对海洋开发的日益增多 造成海洋的污染日益严 重 海洋的富营养化导致的赤潮也呈现直线上升的趋势 赤潮 r e dt i d e 是指在一 定环境条件下 海水中的某些浮游生物在短时间内高度聚集或突发性繁殖使海水变 色并造成危害而引发的一种生态异常现象 2 0 0 8 年我国海域共发生赤潮6 8 次 累计 发生面积1 3 7 3 8 平方公里 赤潮已经成为了一个世界性的问题 它已经波及到欧洲 亚洲 美洲的太平洋沿岸区域 赤潮的发生 不仅破坏了海洋的生态环境 危害海洋渔业和水产资源 而且还 可以通过食物链危害人类的健康 表1 显示了赤潮的危害 表1 赤潮的危害 h b 1t h eh a r mo f t h er e dt i d e s 赤潮的危害 2 3 4 赤潮对海水养殖的危害 有些赤潮生物能向体外分泌粘液或者在死亡分解 后产生粘液 当鱼类 贝类等海洋动物滤食或呼吸时 这些带粘液的赤潮 生物就可以附着在这些海洋动物的鳃上 阻碍它们的呼吸 使之窒息死亡 赤潮威胁人类的健康和生命安全 有的赤潮生物能分泌毒素 还有的赤潮 生物死后能分解出有毒物质 从而毒害和杀死其他的海洋生物 通过食物 链也能威胁到人类的健康 赤潮影响海洋环境 损害滨海旅游事业 有些赤潮藻能分泌有害物质如氨 硫化氢等 由赤潮引起死亡的海洋生物 死亡后能被需氧微生物分解 不 断消耗水中的溶解氧或被厌氧微生物所分解 不断产生硫化氢等气体 使 水体恶化发臭 污染了海洋生态环境 损害滨海旅游事业 赤潮给当地经济带来巨大损失 2 赤潮的治理 2 1 赤潮的理化治理 为了治理赤潮 不少的控藻技术也已经应用到赤潮的治理之中 主要分为物理 治理 化学治理和生物治理 由于物理化学方法都有其局限性 如表2 所以生物 控藻技术凭借其自身的优越性 越来越受到人们的青睐 主要的生物控藻技术有微 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 生物除藻 人工栽培大型海藻除藻 浮游动物除藻等 表2 赤潮的理化治理方法 t a b 2t h ep h y s i c a la n dc h e m i c a lm e t h o d st ot r e a t i n gr e dt i d e s 2 2 赤潮的微生物治理 微生物在所有生物种类中所占的比例是巨大的 3 1 但微生物已知种占估计种的 比例却还很小 目前 据估计海洋微生物可达0 1 2 亿种 4 海洋微生物因其具有 的生态系统多样性和遗传多样性 特有的识别能力和强防御力使得海洋中某些微生 物能在局部环境的特定条件下更好地生存和繁殖 海洋微生物的这种性质显示了用 微生物治理赤潮的可能性 现阶段 研究最多的溶藻微生物主要是细菌 病毒 其 次放线菌 真菌溶藻也有报道 2 2 1 细菌 细菌在海洋中的数量是很丰富的 并且在赤潮的生消过程中所起的作用也是不 容忽视的 5 d o u c e t t ee ta 1 曾于1 9 9 9 年提出假设 他认为溶藻细菌的相对数量和种 类会随着赤潮的发生 增殖 维持而变化 最后 随着溶藻细菌菌落数量和种类的 变化 这些细菌会阻碍赤潮的正常生长 或者与赤潮藻竞争营养 进而引起赤潮的 消退 细菌对藻类的影响主要体现在 一方面细菌能为藻类的正常生长提供营养物 质 促进藻类的生长 另一方面 细菌也可能会通过直接或间接的作用抑制藻类的 生长 从而表现为杀藻效应 郑天凌等 6 提出了 以茵治藻 的策略 同时作者所 在实验室从厦门西海域分离筛选到几株x e i a l e x a n d r i u mt a m a r e n s e 具有明显抑制作用 的海洋细斟 7 1 2 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 溶藻细菌按它们溶藻方式的不同可以分为直接溶藻和间接溶藻 8 1 具体溶藻方 式如表3 据文献 不完全统计 至少已经有5 6 株溶藻细菌已经进行了分离鉴定 绝大多数已经鉴定的溶藻细菌都显示属 c y t o p h a g a f l a v o b a c t e r i u m b a c t e r o i d e t e s c f b 或者属于伽 阳6 口c 绍r 缸 1 2 目前已报道的抑藻细菌主要有粘细菌 弧 菌 蛭弧菌 荧光单胞菌 交替单胞菌 交替假单胞菌等 表3 溶藻细菌的溶藻方式 t a b 3t h ep a t t e no ft h ea l g i c i d a lb a c t e r i a 2 2 1 1 粘细菌 粘细菌是最早被报道和报道较多的主要溶藻细菌 h i l o d r a f 李勤生和黎尚豪 分别报道粘细菌蓝藻细胞相互接触 1 3 导致藻细胞溶解 d a l e 1 4 分离出9 种粘细菌 发现它们能溶解a n a b a e n aa z o l l a e a p h a n i z o m e n o n f l o s a q u a e m i c r o c y s t i sa e r u g i n o s a 及o s c i l l a t o r i as p 并有文献报道 1 5 粘细菌可能还有降解藻毒素的功能 2 2 1 2 蛙弧菌 蛙弧菌具有寄生和裂解细菌的生理特性 并且它广泛分布于近海海洋环境中 c a i o l a 1 6 1 9 8 4 于瓦雷泽湖爆发的水华中 观察到直接攻击m i c r o c y s o e sa e r u g i n o s a k i i t z i n g 的类蛙弧菌 c l i v e 1 9 7 9 在n e o n b u a r i a i r a t a 和j a s p i s s t e l l i f e r a 海峡分离到一种 类蛙弧菌生物 它能够感染单细胞的共生蓝藻 当把从细胞中提取的热稳定物质添 加到户协d 删胁册印的培养液中 藻细胞都将逐渐完全裂解 这很有可能是蛙弧菌的 分泌物启动 j p h o r m i d i u m s p 与s y n e c h o c o c c u s 的细胞凋亡程序 2 2 1 3 弧菌 s h i o t l 7 等从海洋污水中分离的一株弧菌v i b r i o a lg o i n f e s t u s 可以分泌一种 甲 藻生长抑制剂d g i 它能够杀死c h a t t o n e l l aa n t i q u a b a n i n 1 8 报道一株珊瑚褪色弧 菌能合成并分泌一种胞外多肽毒素p 该毒素能够抑制与珊瑚共生的z o o x a n t h e l l a 的 光合作用 导致z o o x a n t h e l l a 死亡 从而引起珊瑚褪色 2 2 1 4 交替假单胞菌 黄姿 李春强 1 9 等从海南洋浦港沉积物中分离到一株具有较强溶藻活性的 p s e u d o a l t e r o m o n a ss p z 3 该菌x f a l e x a n d r i u mc a t e n e l l a 和a l e x a n d r i u mt a m a r e n s e 有 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 溶藻活性 对s c r i p p s i e l l at r o c h o i d e a 和s k e l e t o n e m ac o s t a t u m 的生长无影响 表明此菌 株溶藻活性具有种属特异性 通过该菌的菌体悬浮液和除去菌体滤液f f i a l e x a n d r i u m c a t e n e l l a 试验表明 此菌株既具有直接溶藻作用又有间接溶藻活性 苏建强 杨晓 如 郑天凌等 2 0 发现从中国东海海域分离到一株海洋p s e u d o a l t e r o m o n a ss p s p 4 8 2 e l a l e x a n d r i u mt a m a r e n s e 有溶藻效果 并且研究表明它是通过释放胞外活性物质溶 藻 2 2 1 5 荧光假单胞菌 j e o n g d o n g k i m b o r a k i m c h o u l g y u n l e e 等 2 1 j k m a s a n 分离到的一株溶藻 p s e n d o m o n a sf l u o r e s c e n s h a k 1 3 通过释放胞外溶藻物质对处于各个生长时期的 h a k a s h i w o 都有强烈的抑藻作用 研究还发现h a k 一1 3 对彳砌汜玎d h lt a m a r e n s e c o c h l o d i n i u mp o l y k r i k o i d e s 也有溶藻效果 其他一些属的菌株对赤潮也有溶藻效果 c l i n t o n e h a r e e l i t d e m i r k a t h r y n j 等 2 2 在d e l a w a r ei n l a n db a y s 分离到一株对噬鱼费氏藻有溶藻效果的细菌耐一 1 6 0 t 2 3 1 m i n j u k i m s e o n g y u r d e o n g s a n g j o o n l e e 发现s y 一1 3 生成的次级代谢物 对c o c h l o d i n i u mp o l y k r i k o i d e s 有溶藻效果 有文献报道溶藻细菌通过直接接触或释放 溶藻物质 在 r e n i ab r e v i s 藻的控制中显示出t好的前途 z 4 j 以上的研究尚处于实验研究阶段 其是否能应用到赤潮的治理中 还需要进一 步的研究 特别要对细菌的种类 投放量作进一步研究 现阶段研究重点要放在筛 选能规模化生产的菌株 2 2 2 病毒 在海洋水体系统中 存在于海水表层的病毒数量可以高达1 0 1 吮 2 5 1 可见其存 在的丰富性 因此对于维持海洋生态系统的动态平衡是必不可少的 2 6 关于藻类病 毒最早的报道出现在蓝藻中 1 9 6 3 年 s a f f e r m a n 和m o r r i s 首先报道了同时感染 l y n b y a p h o r mi d i u m 和p l e c t o n e m a 3 个属的病毒 因此命名为 l p p 型病毒 2 1 9 7 1 年 l e e 等 报道了真核藻类的病毒粒子 随后g i b b s 掣2 9 最早对真核藻类病毒进行 鉴定 提出用病毒控制赤潮的方法是由日本的k e i z on a g a s a k i 等t 3 0 于1 9 9 9 年提出来 的 藻类病毒一般包括原核藻类病毒 真核藻类病毒和一些尚未定性的病毒类似颗 粒 v l p s 除了蓝藻病毒为原核藻类病毒之外 海洋藻类病毒多为真核藻类病毒 3 l 自1 9 6 3 年s a f f e r m a n 和m o r r i s 报道了第1 株蓝藻病毒以来 淡水噬蓝藻体的研究 工作已经进行得比较深入了 而海水中噬蓝藻体的研究相对比较有限 真核藻类病毒是一类比蓝藻病毒大得多的d s d n a 病毒 1 9 7 1 g i b b s 等发现能 4 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 特异性感染c h l o r o p h y t a 的c h a r ac o r a l 2 l i n e 病毒 并将之取名为 c c v 1 9 9 9 k e i z o n a g a s a k i 等从日本n o m i 海湾分离到一种病毒 h a k a s h i w o 病毒纯系0 1 h a y 0 1 这 种病毒能够感染h a k a s h i w o 该病毒颗粒可以专一性地感染并裂解h a k a s h i w o h 9 3 6 1 6 对h a k a s h i w o 具有较高的特异性 不会感染c h a t t o n e l l a 册幻u a c v e r r u c u l o s a f i b r o c a p s a a p o n i c a 等1 5 种其他种类的浮游植物 k e i z o n a g a s a k i y u j it o m a t o 等 3 2 在日本a r i a k es e a 分离到一株对c l a d o p h o r a 有侵染的s s r n a 二十面体结构 无尾 侵染细胞后复制 a c b a u d o u x c p d b r u s s a a r d 3 3 1 2 0 0 0 2 0 0 1 在北海南部海域分离到了1 2 株对赤潮藻一一有毒 p h a e o c y s t i sg l o b o s a 跏e 咖隋特异裂解的病毒p g v 并且其相应的特征也得到了鉴 定 2 2 3 放线菌 早在1 9 6 2 年 放线菌溶藻的研究已经开始了 从土壤和水体中均分离到了 c y a n o b a c t e n a 的放线菌拮抗物 s a f f e r m a n 和m o r r i s 研究了从土壤中分离到的4 0 3 株放 线菌的培养物滤液的溶藻效果 其中2 1 3 株有抑藻效果 s i g e e t 圳等分离到的 s t r e p t o m y c e se x f o l i a t u s 可以使9 种c y a n o b a c t e r i a 裂解 其中包括可形成水华的 a n a b a e n aa z o l l a e m i c r o c y s t i s 和o s c i l l a t o r i as p a 1 一t a i 分离到的2 5 种可以抑制 c y a n o b a c t e n a 生长的放线菌 肖慈琼 3 5 等从土壤中分离到具有溶藻活性的放线菌菌 株a n 0 2 其胞外代谢产物又e i m i c r o c y s t i sa e r u g i n o s a 具有较好的抑杀作用 崔妍等 3 6 从土壤中分离至 l j s t r e p t o m y c e sg r i s e i n u sy c 0 4 1 2 对m i c r o c y s t i s 有强烈抑杀作用的菌 株 进一步实验表明这株放线菌溶藻的活性产物应该是一种弱极性脂溶性物质 并 且这株菌株对其它富营养水体中常见藻类 c h l o r e l l a s c e n e d e s m u s a n a b a e n aa z o l l a e 和s y n a h o c y s t i ss p 也有不同的抑杀作用 从以上研究可以看出 现在溶藻放线菌的研究主要集中在水华的治理上 但是 放线菌溶赤潮藻的报道还是极为少见的 我们相信随着研究的深入 放线菌在赤潮 的治理中也会有重要作用 2 2 4 真菌 k r e d h e a d s j l w r i g h t 3 7 发现真菌对蓝绿藻有溶藻效果 真菌主要通过释放 放抗生素或抗生素类的物质或者寄生的方式溶藻 有报道证明浓度仅0 0 2 u f m l 的青 霉素就足以抑 1 j a n a c y s t i sn i d u l a n s 的生长 3 8 真菌在藻类的寄生是比较普遍的 报 道最多的寄生宿主是s p i r o g y r as p 的藻类 寄生物有q o m y c e t e s p y t h i u mg r a c i 跆 a p h a n o m y c e sp h y c o p h i l u s 和s a p r o l e g n i aa s t e r o p h o r a 等真菌 同时发现z y g o r h i z i d i u m p l a n k t o n i c u m 对a s t e r i o n e l l af o r m o s a 有很强的寄生溶藻效果 是所记录到的最高感染 硕士学位论丈 m a s t e r st h e s i s 的例子 例如 在合适的环境条件下 它z e a s t e r i o n e l l af o r m o s a r 扣的寄生和繁殖使 该藻的生长受到强烈的抑制 并使水华很快消失 v a nd o n k r i n g c l b e r g 于1 9 8 3 曾 发现d i a t o m 水华中有v i b r i o 的寄生 3 9 虽然真菌能够释放多种多样的抗生素类的物 质溶藻或者寄生溶藻 但是毕竟真菌溶赤潮藻的报道还是极其少见的 3 本文研究的目的 内容和意义 目前国内外对溶藻细菌控制赤潮的研究尚处于起步阶段 细菌广泛分布于自然 环境中 具有成为生物防治赤潮的重要潜力 分离得到高效的溶藻细菌是微生物防 治赤潮的基础和关键 本论文结合赤潮爆发的严重现状 希望筛选出对h a k a s h i w o 有溶藻作用且溶藻能力稳定的溶藻细菌 并通过对溶藻细菌对多种赤潮藻的溶藻效 果的研究 以及溶藻物质理化活性的摸索 为赤潮的微生物防治以及新型杀藻剂的 研发提供科学依据 6 硕士学位论丈 m a s t e r st h e s i s 第二章溶藻细菌的筛选及初步鉴定 1 材料与方法 1 1 材料 1 1 1 供试藻种及菌种 选用异弯藻 a k a s h i w o 锥状斯克里普藻 t r o c h o i d e a 海洋原甲藻僻m i c a n s 海洋卡盾藻 c m a r i n a 牟氏角毛藻 c m u e l l e r 微小原甲藻 p m i n i m u m 金藻 c h r y s o p h y t a 为供试藻种 藻种来源于中国海洋大学 牟氏角毛藻 c m u e l l e r 用 8 5 1 液体培养基 其余藻种用f 2 液体培养基 在2 0 全光照条件下培养 细菌菌种直接分离于武汉市沿东湖湖岸土壤中 1 1 2 培养基 1 藻培养基 藻培养基使用8 5 1 液体和舵液体培养基 具体配方如下 8 5 1 液体培养基 n a c i 1g m g s 0 4 7 h 2 0 0 2 3 9 k n 0 3 0 5 0 5 9 n a h c 0 3 0 4 2 9 c a c l 2 2 h 2 0 0 0 0 3 9 f e c l 3 6 h 2 0 0 0 0 4 9 k h 2 p 0 4 0 2 0 7 9 n a 2 e d t a 0 0 0 18 9 a 5 溶液 l m l 人工海水 1 0 0 0 m l 化液体培养基 n a n 0 3 7 4 8 m g n a h 2 p 0 4 4 4 m g n a s i 0 3 9 h 2 0 1 2 m g 舵微量元素溶液 1 0 0 1 11 化维生素溶液 1u1 人工海水 1 0 0 0 m l 7 a 5 溶液配方 h 3 8 0 3 m n c l 2 4 h 2 0 z n s 0 4 7 h 2 0 c u s 0 4 5 h 2 0 n a m 0 0 4 5 h 2 0 c o r n 0 3 2 6 h 2 0 单蒸水定容 f 2 微量元素溶液 e d t a f e c l 3 6 h 2 0 c u s 0 4 5 h 2 0 z n s 0 4 7 h 2 0 c o c l 2 6 h 2 0 m n c l 2 4 h 2 0 n a 2 m 0 0 4 2 h 2 0 单蒸水定容 舵维生素溶液 v m v a l 2 生物素 单蒸水定容 人工海水 删 n a c i n a 2 s 0 4 k c i k b r s 疋1 2 m g c l 2 6 h 2 0 c a c l 2 h 2 0 n a h c 0 3 h 3 8 0 3 n a f 单蒸水定容 2 细菌培养基 2 8 6 m g 1 8 1m g 2 2 2 m g 7 9 m g 3 9 m g 4 9 4 m g 1 0 0 m l 4 3 6 9 3 1 6 9 0 0 1 9 0 0 2 3 9 0 0 1 2 9 0 1 8 9 0 0 7 9 1 0 0 m l 0 0 1 9 0 0 5 9 o 0 5 9 1 0 0 m l 2 4 4 7 7 9 3 9 1 7 9 0 6 6 4 9 0 0 9 6 9 0 0 2 4 9 4 9 8 1 9 1 1 0 2 9 0 1 9 2 9 o 0 2 6 9 0 0 0 3 9 9 1 0 0 0 m l 8 硕士学位论文 m a s t e r st h e i s 牛肉膏蛋白胨液体培养基 牛肉膏 蛋白胨 n a c i 单蒸水定容 5 9 1 0 9 5 9 1 0 0 0 m l 固体培养基加入2 0 9 琼脂 1 1 3 试剂 培养基中使用的试剂均为分析纯 1 1 4 主要仪器 岛津u v 2 4 0 1 紫外分光光度计 日本 h e a l f o r c e 生物安全柜 德国 s a r t o r i u sb p l1 0 s 电子分析天平 德国 h e r a e u sd 3 7 5 2 0 高速冷冻离心 德国 r e 5 2 旋转蒸发器 中国上海 h z q c 空气浴振荡器 中国哈尔滨 8 5 2 型 恒温磁力搅拌器 中国上海 s h z i i i 型循环水真空泵 中国上海 美国n u a i r d s 7 2 g d 光照培养箱 h e r a c e l l 细菌培养箱 日本n i k o n e 6 0 0 相差显微镜 n o n 9 2 0 数码相机 1 2 方法 1 2 1 样品的处理 采集的土样自然风干1 0 d 称取1 9 土样加到试管中 然后加入5 m l 灭菌的单蒸 水 再加入5 m 1 0 2 n a a p 2 0 7 最后加入玻璃珠 置于摇床中 3 7 2 1 6 0 r m i n 震 荡l h 然后静置2 h 备用 1 2 2 溶藻细菌的初筛与分离 对于处理过的土样 先取l m l 土样上清用液体牛肉膏蛋白胨培养基扩大培养 2 4 h 然后把上清按1 比例加入到预培养的处于对数生长期的赤潮藻液中 然后放 于2 0 2 控温培养箱中 混合静置培养观察 取有溶藻效果的培养液 设定不同浓度 进行梯度稀释 平板涂布 3 7 2 培养2 4 h 划线分离 多次划线培养 获得纯培养的 菌株 进行溶藻试验以确定其溶藻效果 1 2 3 溶藻细菌的保藏 对具有溶藻效果的细菌采用甘油法进行保藏 具体做法 o 8 m l 菌液加0 2 m 1 8 0 甘油 8 份甘油和2 份生理盐水 加入到冷冻管中 8 0 c 冷冻即可 1 2 4 溶藻试验 将h a k a s h i w o 培养至对数生长期 4 1 1 再将分离的细菌接种于牛肉膏蛋白胨液体 培养基中 于3 7 培养2 4 h 培养的菌液按1 接种量接种至h a k a s h i w o 中 设对 9 硕士学位论文 m a s t e r 8t h e s i s 照 对照中加入1 牛肉膏蛋白胨液体培养基 每组3 个平行 定时观察 测定 h a k a s h i w o 的叶绿素 a b 含量 叶绿素 a b 含量的测定用丙酮比色法 4 2 取 5 m l 藻液3 5 0 0 r m i n 1 0 m i n 离心洗涤 得沉淀 在沉淀中加入等量8 0 的丙酮 放 于4 冰箱提取2 4 h 再离心取上清测6 6 3 n m 6 4 5 n m 处的o d 值 叶绿素 a b 含量 8 0 2 o d 6 6 3 2 0 2 唪o d 6 4 5 1 2 5 菌株对其它赤潮藻的溶藻效果 把有溶藻效果的细菌 接种于液体牛肉膏蛋白胨中 3 7 培养2 4 h 取培养的 菌液 6 0 0 0 r m i n 离心1 0 m i n 取菌液上清 按1 的比例加入到处于对数生长期的 s t r o c h o i d e a p m i c a n s c m a r i n a c m u e l l e r p m i n i m u m c h r y s o p h y t a 的培养液中 每组3 个平行 设对照 对照中加入1 牛肉膏蛋白胨液体培养基 2 0 培养5 天 分别测定叶绿素 a b 含量 记录结果 1 2 6 菌株的形态及生理生化观察 对分离的菌株进行革兰氏染色 4 3 1 显微观察 记录观察到的结果 观察细菌在 平板上的生长状态 色素产生情况 参照菌种保藏手册进行明胶穿刺 石蕊牛奶实 验 吲哚亚硝酸盐还原实验等生理生化 删鉴定 1 2 7 菌株的分子鉴定 用试剂盒 北京普博欣生物科技有限责任公司g d x 2 0 1 0 提取细菌总d n a 用细菌引物p r i m e r a 5 a g a g t t t g a t c a t g g c t c a g 3 和p r i m e r b 5 g g t l a c c t t g t t a c g a c t t 3 4 5 扩增菌株的1 6 s r d n a p c r 循环参数 9 4 热变性5 m i n 9 4 变性l m i n 1 5 6 退火2 r a i n 3 0 个循环 7 2 延伸2 r a i n j 最后7 2 延伸2 m i n 取5ul 反应液经2 的琼脂糖凝胶电泳 e b 染色 紫外检测并拍照 p c r 产 物的纯化与测序由南京金思特科技公司完成 然后在g e n b a n k 核酸序列数据库中进 行b l a s t 比对 1 2 8 试验数据处理 采用g r a p h p a dp r i s m4 软件进行作图与数据统计分析 1 0 2 结果与讨论 2 1 溶藻细菌的分离结果 本研究从土壤中初筛到了5 0 多株细菌 然后对它们进行了多次的溶藻试验 得到了一株有较好溶藻效果的细菌f 5 2 采用甘油法进行了保藏 并以它为研究对 象进行以下的试验 2 2f 5 2 对异弯藻的溶藻效果 f 5 2 对h a k a s h i w o 的溶藻效果如图1 所示 h a k a s h i w o 的细胞形态的变化如图 2 所示 从图中可以看到一开始 f 5 2 对h a k a s h i w o 的生长就有作用 随着时间的 延长 作用效果更加明显 在第6 天去除率达到了7 0 以上 对数据进行了单因素 方差分析 p 0 0 5 说明对照组和实验组有显著性差异的 从图2 可以看出 加入 f 5 2 共培养后 异弯藻细胞的形态发生了明显的变化 可以看到某些藻细胞发生了 破裂 帮 岔 i 日 联 强 占 o12 34567 时间 c k f 5 2 图1f 5 2 对异弯藻 h a k a s h i w o 溶藻效果 f i g 1t h ea l g a e l ys i n ge f f e c t so f t h ea l g a e l y s i n gb a c t e r i af 5 2t oh a k a s h i w o 蹦2f 5 2 对异弯藻 日a k a s h i w o 藻细胞形态的影响 f i g2 t h ea l g a e q y s i n ge f f e c t s o f t h ea l g a e q y s i n gb a c t e r i a f 5 2 t o ha k a s h i w oc e l l 注 左图为正常藻细胞 矗图为加入f 5 2 共培养5 天时的藻细胞 23f 5 2 对其他赤潮藻的5 夭溶藻效果 图3 显不的是f 5 2 时st r o c h o i d e a l m i c a n s p m i n i m u m c m a r i n a c m u e l l e r c h r y s o t h v t a 生长的影响 r 以看到f 5 2 对s t r o c h o i d e a p m i c a n s p m i n i m u m 的生 长具有抑制作用 但是对c m u e h e r 和c m a r i n a c h r y s o p h y t a 的生长却没有影响 f 5 2 对s t r o c h o i d e a 的溶藻效果能达到8 7 对p m i c a n s 的溶藻效果达到了9 0 对p m i n i m u m 的溶藻效果也达到了8 0 对c m a r i n a c h r y s o p h y t a 的生长没有明 娃影响 同时f 5 2 对c m u e l l e r 的生长似乎还有促进作用 下表4 对f 5 2 的溶藻范 围进行丁归纳 由表4 可以看出 f 5 2 对于实验中选用的甲藻 的藻类都有溶藻效 果 对其他的门一些藻类则没有溶渫效果 说明f 5 2 对宿 i 三藻的溶藻作用是有一定 选择性的 麟麟麟麟错麟 缸 壬旺 师逛嘲 噩 l隧曦援半 豫灶 监 灶 壕嫩 稽瓣燎 葵 蟮 皿c k 盈盈f 5 2 图3f 5 2 对其他赤潮藻的5 天作用效果 f i g 3t h ea l g a e l y s i n ge f f e c t so ft h ea l g a e l y s i n gb a c t e r i af 5 2t oh a b 8 表4 f 5 2 对不同赤潮藻的溶藻能力 t a b 4t h er e s u l t so ff 5 2t od i f f e r e n th a b s 注 为有溶藻效果 一 为无溶藻效果 2 4f 5 2 的形态及生理生化观察结果 f 5 2 在牛肉膏蛋白胨固体平板上能产生绿色色素 随着培养时间的延长 能使 平板呈现深绿色 菌落形态成圆形空泡状 结果如图4 显微观察 杆状 革兰氏 1 3 栅如 q 侣一般繇蕾 染色阴性 结果如图5 能使明胶迅速液化 使石蕊牛奶形成凝块 还原石蕊 吲 哚试验阴性 能还原硝酸盐 k 一 一 图4 溶藻细菌f 5 2 的甲板菌落形态 f i g4 t h ec o l o n y f e a t u r eo f a l g a e l y s i n gb a c t e r i af 5 2 i s o l a t e d f r o ms o i l 注 左图为 i f 面罔 右图为反面图 护 5 图5f 5 2 的革兰氏染色结果 4 0 倍物镜观察 f i g5 t i l e g r a ms t a i nr e s u l to f t h e a l g a e q y s i n gb a c t e r i a f 5 2 25f 5 2 的分子鉴定结果 f 5 2 的p c r 扩增产物的长度大致在1 5 k b 电泳图谱如图6 对f 5 2 测序结 果进行b l a s t 比对 序列号为g q 9 2 1 9 4 5 1 6 s r d n a 测序结果见附录 结果发现f 5 2 和铜绿假单胞菌 p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a 的同源性很高 结合形态学 生理牛 化和测序比对结果 初步鉴定细菌f 5 2 为p a e r u g i n o s a 选取 部分已经报道的溶 藻菌 对f 5 2 进行了系统发育分析 如图7 所示 可以看到f 5 2 和p s e u d o m o n a s r 厂 a e r u g i n o s a l 8 g u 5 8 6 1 3 9 p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a a s 2 4 4 7 2 3 8 的相似性 很高 和其他溶藻菌株的亲缘性要远一些 f 5 1 2m o c r i 一 一 2 0 0 0 b p 1 0 0 0 b p 7 5 0 b p 5 0 0 b p 图6 菌株f 5 2 的1 6 s r d n a p c r 扩增产物电泳图 f i g6 t h ea m p l i f i c a t i o no f t h ea l g a e l y s i n g b a c t e r i a f 5 21 6 s r d n a r a 日0 1 7 叫6c y i o p i 峥s p 到l a f 4 2 7 4 7 9 c y t c p h a p4 1 0 b g 2 刮l a b 0 1 7 m 7q t o p h a g as ps t r 目n a a s 2 i r 一a f wp d d l m s pa 2 5 刊 爿 一a b 0 1 7 5 9 7 m t s p 5 3 l r 一 o w p s a m d i s p r 厂 i l 一a f 2 2 7 2 3 8 p s e u d o a l t s a 2 8 j 叫l 一a f 2 2 8 6 9 4 g p e a c e h k l l 广 一g u 5 8 6 1 掬p s 剖d 0 t l a 虮 帖蚰1 0 l i l 一n a m 一s t v l r 一f 5 2 一 1 r 一g u 4 4 7 2 3 8 p s d d m g a s 2 n l 一a b g 5 8 8 9 9 s f 日s p s s 9 0 1 卜 面1 图7 菌株f 5 2 的系统发育树 f i g7 p h y l o g e n e t i c t r e e o f a l g i c i d a l b a c t e r i a f 5 2 3 本章小结 本实验从土壤中分离到了一株具有溶赤潮藻效果的细菌f 5 2 通过形态学 生 理生化 1 6 s r d n a 细菌通用引物进行扩增和b l a s t 比对 综合分析 初步断定该菌属 于假单胞菌属 p a e r u g i n o s a 假单胞菌属是研究的比较多的溶藻细