抗稻瘟病水稻材料谷梅2号中主效抗稻瘟病基因的成簇分布.pdf

中国水稻科学 C h i n e s e J R i c e S c i 2 0 0 4 1 8 6 5 6 7 5 6 9 抗稻瘟病水稻材料谷梅 2号中主效抗稻瘟病基因的成簇分布 5 67 吴建利 3 柴荣耀2 樊叶杨 李德葆 郑康乐 He i L E U N G 庄杰云 中国水稻研究所 国家水稻改良中心 水稻生物学国家重点实验室 浙江 杭州 3 1 0 0 0 6 浙江省农业科学院 植物保护研究所 浙江 杭州 3 1 0 0 2 1 3 浙江大学 生物技术研究所 浙江 杭州 3 1 0 0 2 9 国际水稻研究所 菲律宾 马尼拉 通讯联系人 E m a i l j z 1 8 0 3 h z c n c c o rn C l u s t e r i n g o f Ma j o r Ge n e s C o n f e r r i n g B l a s t Re s i s t a n c e i n R i c e C u l t i v a r Gu me i 2 W u J i a n l P 3 4 C HA I Ro n g y a o 2 F A N Ye y a n g LI De b a o Z H E N G Ka n g l e He i LE UN G Z HU A N G J i e y u n t S t a t e Ke y L a b o r a t o r y o f R i c e B i o l o g y C h i n e s e Na t i o n a l C e n t e r f o r Ri c e I mp r o v e me n t C h i na Na t i o nal Ri c e R e s e a r c h I n s t i t u t e Ha n g z h o u 3 1 0 0 0 6 C h i na e P l a n t Pr o t e c t i o n I n s t i t u t e Z h e j i a n gAc a d e my o fAg r i c u l t u r a l S c i e n c e s Ha n g z h o u 3 1 0 0 2 1 C h i na I n s t i t u t e o fBi o t e c h n o l o g y Z h e j i a n g Un i v e r s i t y Ha n g z h o u 3 1 0 0 2 9 C h i n a E n t o mo l o g y a n d Pl a n t P a t h o l o g y Di v i s i o n I n t e r n a t i o nal Ri c e R e s e a r c h I n s t i t u t e D AP O P o Bo x 7 7 7 7 Me t r o Ma n i l a P h i l i p p i n e s C o r r e s p o n d i n g a u t h o r E m a i l j z 1 8 0 3 h z c n c c o r n Ab s t r a c t B y u s i n g 3 0 4 r e c o mb i n a n t i n b r e d l i n e s d e r i v e d f r o m in d i e a r i c e c r o s s Z h o n g 1 5 6 Gu me i 2 fl l i n k a g e ma p c o n s i s t i n g o f 1 7 7 ma r k e r l o c i a n d c o v e r i n g 1 2 r i c e c h r o mo s o me s wa s c o n s t r u c t e d a n d e mp l o y e d f o r ma p p i n g g e n e s c o n f e r r i n g b l a s t r e s i s t a n e e i n r ic e Ge n o mi c l o e a t i o n o f g e n e P 2 5 t c o n f e r r i n g n e c k b l a s t r e s is t a n c e t o C h i n e s e i s o l a t e 9 2 1 8 3 r a c e Z C1 5 wa s v e r i f i e d t o b e l o c a t e d b e t we e n ma r k e r s A7 a n d R G4 5 6 o n c h r o mo s o me 6 wi t h g e n e t i c d i s t a n c e s o f 1 7 e M a n d 1 5 e M t o A7 a n d RG4 5 6 r e s p e c t i v e l y L e a f b l a s t r e s i s t a n c e o f Gu me i 2 t o P h i l i p p i n e i s o l a t e Ca 8 9 1 i n e a g e 4 wa s f o u n d t o b e c o n t r o l l e d b y a s i n g l e g e n e Th e g e n e t e n t a t i v e l y d e s i g n a t e d fl s P i 2 6 t wa s l o c a t e d b e t we e n ma r k e r s B 1 0 a n d R6 7 4 o n c h r o mo s o me 6 wi t h g e n e t i c d i s t a n c e s o f 5 7 e M a n d 2 5 8 e M t o B 1 0 a n d R6 7 4 r e s p e c t i v e l y Re s i s t a n t a l l e l e s a t b o t h g e n e l o c i we r e d e r i v e d f r o m Gu me i 2 i n d i c a t i n g a n e x i s t e n c e o f r e s i s t a n c e g e n e c l u s t e r s i n Gu me i 2 Ke y w o r d s b l a s t r e s i s t a n c e mo l e c u l a r ma p p i n g g e n e c l u s t e r r i c e 摘要 应用由籼稻组合中 1 5 6 谷梅 2 号衍生的 3 0 4 个重组 自交系 构建了由 1 7 7个标记组成 覆盖 1 2条水稻染色体 的连锁图谱 定位控制水稻稻瘟病抗性的主效基因 前期定位的控制对中国稻瘟菌菌系 9 2 1 8 3 小种 Z C t s 穗瘟抗性 的基因 P 5 t 的位置得到进一步确认 位于第 6 染色体标记 A 7 和 R G 4 5 6 之间 与 A 7 和 R G 4 5 6的遗传距离分别为 1 7 和 1 5 e M 发现群体对菲律宾稻瘟菌菌系 C a 8 9 4谱系 的叶瘟抗性由单基因控制 将该暂命名为 P 6 t 的基 因定位于第 6 染色体标 记 B 1 0和 R 6 7 4 之间 与 B 1 0 和 R 6 7 4 的遗传距离分别为 5 7和 2 5 8 e M 两个基因座位上的抗病等位基因均来源于谷梅 2 号 表明谷梅 2 号中存在控制水稻稻瘟病抗性的基因簇 关键词 稻瘟病抗性 分子定位 基因簇 水稻 中圈分类号 Q 9 4 3 3 3 2 2 S 5 1 1 0 3 2 文献标识码 A 文章编号 1 0 0 1 7 2 1 6 2 0 0 4 0 6 0 5 6 7 0 3 稻瘟病一直是稻作生产的一项主要制约因素 其病原菌 为 P y r i c u l a r i a g r i s e a 无性世代 s y n o n y mo u s Py r i c u l a r i a o r y z a e C a v 有 性世代 t e l e o mo r p h Ma g n a p o r t h e g r i s e a 虽然带主基因的抗病品种常常在推广后数年内失去抗病性 但是选育抗病新品种一直是防治稻瘟病的最佳方法 从 2 O世纪 9 O年代初开始 由于有了 R F L P等分子标 记 稻瘟病抗性基因定位有了深入的发展 迄今 至少鉴定 了 2 5个稻瘟病抗性基因 并通过分子标记确定 了它们在水 稻染色体上的位置 这些抗稻瘟病基因分布在除了第 3 1 0 以外的染色体上 且大多集中在第 6 1 1 和 1 2染色体上 3 13 稻瘟病的持久抗性历来被认为是复杂的 且与环境高度 相关 I 5 实际上也能观察到一些水稻材料在不同的环境 条件下 并在相当长的时间里表现出良好的抗稻瘟病性 谷 梅 2号是从 3 8 0 0 0份水稻材料中筛选出的唯一一份半矮秆 籼稻 测试的稻瘟病小种范围广 历时长 抗性好 引 我们利 用谷梅 2号和中 1 5 6杂交 构建了一个重组 自交系 R I L 来 研究谷梅 2号的抗稻瘟病性 7 并用我国稻瘟病小种 9 2 1 8 3定位了两个稻瘟病抗性基因 即第 6和第 1 2染色体上的 Pi2 5 t 和 P 4 t 基因 9 I 在本研究中 我们用覆盖更广 饱和度更高的遗传图谱确认了Pi2 5 t 的位置 并利用菲律 宾的一个主流稻瘟病小种 C a 8 9 定位了一个稻瘟病抗性基 因 1 材料与方法 1 1 水稻 材料与接种 1 9 9 0 年早季 在中国水稻研究所 C N RR I 用中 1 5 6作 母本 谷梅 2号作父本进行杂交配组 中 1 5 6为中国水稻研 究所选育的一个早籼品种 谷梅 2号拥有良好的抗稻瘟病 性 作为抗性供体 此后 用单粒传 S S D 法加代传种 于 1 9 9 5年获得 3 0 4个 F 8 重组 自交系 亲本和 重 组 自交 系 对我 国稻 瘟 病 小 种 9 2 1 8 3 小 种 Z C 1 s 的稻瘟病抗性分别于 1 9 9 6年 1 9 9 7年和 1 9 9 8年在浙 江省农业科学院进行接种鉴定 7 8 3 0 4个株系对穗瘟的抗 收稿 日期 2 0 0 4 0 4 2 8 修改稿收到 日期 2 0 0 4 0 8 0 6 基金项目 国家自然科学基金资助项目 3 0 0 7 0 3 0 0 浙江省自 然科学基金资助项目 3 0 0 0 0 6 l 亚洲水稻生物技术协作网资助项 目 第一作者 介t 吴建刺 1 9 6 4 男 博士 副研究员 维普资讯 5 6 8 性数据用于重新定位 P i2 5 t 菲律宾稻瘟病小种 C a 8 9接种鉴定在国际水稻研究所 I R R I 进行 试验前用 4 O个菲律宾小种对 2个亲本进行接 种筛选 2个单独试验 每个亲本 1 O苗 2次重复 采用 I RR I 遗传实验室的标准方法进行苗期接种 接种孢子浓度为 1 x 1 O 个 mL 结果表明 4 O个小种中没有一个小种能侵 染谷梅 2号 但有包括 C a 8 9 谱系 4 在内的 8个小种能侵 染 中 1 5 6 由于 C a 8 9为主要 流行小种 之一 因此 选用 Ca 8 9 来接种整个重组自交系 群体接种采用完全随机区组设计 每次 1 O个单株 3次重复 病情调查采用 B o n ma n等人的方 法 5 5 抗性表现稳定一致的株系用于定位分析 1 2 分子标记 D NA抽提和分子标记基因型分析采用先前的方法 8 l 采用的标记包括RF L P r e s t r i c t i o n f r a g me n t l e n g t h p o l y mo r p h i s m S S L P s i mp l e s e q u e n c e l e n g t h p o l y mo r p h i s m RGA r e s i s t a n c e g e n e a n a l o g RAP D r a n d o ml y a mp l i f i e d p o l y mo r p h i c D N A 和 S T S s e q u e n c e t a g g e d s i t e R F L P包 括水稻基因组 D NA克隆和 c D NA克隆 由美国康奈尔大学 和日本水稻基因组研究项 目提供 候选基因由美 国堪萨斯 州立大学提供 参见h t t p WW W k s u e d u k s u d g c 稻瘟 病 c D NA克隆由浙江大学提供 1 3 数据分析 作图软件 MAP MAK E R E XP 3 0 b D 0 3 用于遗传连锁分 析 以 L OD 3 0确立连锁群 以 L OD 2 0确立连锁群 内 标记的顺序 用 Ko s a mb i 函数计算遗传距离 单位为分摩 c M 连锁群 RF L P和S S L P的顺序采用康奈尔大学的标 1 2 中国水稻科学 C h i n e s e J R i c e S c i 第 1 8卷第 6 期 2 0 0 4年 1 1 月 2 结果与分析 2 1 连锁 图的构建 在中 1 5 6 谷梅 2 号衍生的 3 0 4个重组 自交系群体 中总 共找到 1 9 1个分离标记 在曾经用过的 4个 R AP D标记 中 7 8 B 1 0被转化为 R F L P标记 KI 7被 转化为 S T S标 记 A 7被转化为 R F L P和 S T S标记 3 0 4个株系在该 3个 标记位置的基因型也重新进行 了测定 第 6染色体上原有 的其他 RA P D标记不再使用 用 MA P MA KE R对该 1 9 1个分离标记进行了分析 构 建了由 1 7 7个标记组成的涵盖 1 2个水稻连锁群的遗传图谱 图 1 余下的 1 4个标记要么不与 1 7 7个标记中的任何一 个连锁 要么不能确认它们在图谱上的确切位置 新图谱上 的标记包括 1 个形态标记 1个 S TS标记 6个 R AP D标记 4 6 个 RG A标记 5 9个 S S L P标记和6 4 个 R F L P标记 谷梅 2号等位基因在 1 7 7个标记中所占的比例为 4 9 1 与理论 预期的5 O 的比例非常接近 不过在 4 2 个标记中也观察到 有异常分离的位点 P O 0 5 这些异常标记成簇分布 每个 簇群表现为来自某个亲本的位点偏多 图 1 2 2 确认穗 抗性基 因 P i2 5 t 1 9 9 6年 1 9 9 7 年和 1 9 9 8年三年度的接种试验表明 在 3 0 4个株系中共有 9 3个株系对穗瘟表现为稳定感病 4 l 以 中 1 5 6的基因型代替感病株系的基因型 用缺失代替抗病株 系的基因型 采用这种所谓 隐性 作图法进行基因定位研 究 4 8 并用该法对穗瘟抗性基因进行重新定位 6 7 9 1 1 1 2 R ZB 2 8 I R Z柏 R 0l 2 3 s l R 脚 t c l l I 1 0 4 R G 2 4 1 B b 2 A 1 4 4 RM3 0 4 T 咖 4 R M 2 2 8 D1 0 b R Z强 P k l 2 1 R 2 C l t r 4 R I 也o 2 z c a r 2 R Ol n r r 酽 R z Rl 2 XN 6 n6 8 R M 9 R M2 2 9 R Z n 2 R nl l 3 3 h 铲 R Gl O R 6 S 2 l s R M2 5 S 2 3 I 3 S 2 1 1 2 R R1 0 R 6 I RM2 0 4 g l r t 4 圈 1 中 1 5 6 谷梅 2号重组 白交系遗传连锁 图 F i g 1 L in k a g e ma p c o n s t r u c t e d f r o m Z h o n g 1 5 6 G u me i 2 R I L p o p u l a t i o n a n d t h e l o c a t i o n o f b l a s t r e s i s t a n c e g e n e s P i2 5 t a n d P i g 6 t 第 6 染色体上显示穗瘟抗性基因P i 2 5 t 和叶瘟抗性基因 P 留 t 的位置 带有上标的标记为异常分离的标记 g 偏向谷梅 2 号 偏 向中 1 5 6 L o c i s h o wi n g d i s t o r t e d s e g r e g a t i o n we r e i n d i c a t e d b y a s u p e r s c r i p t l g e x c e s s o f Gu md 2 s l i d e 5 e x c e u o f Z l l0 I l g 1 5 6 dl de 一麓 0 土 fr 十 丰 4 十 0 上 5 一 3 上 一 干 卜 g q叫叫 维普资讯 吴建利等 抗稻瘟病水稻材料谷梅 2 号中主效抗稻瘟病基因的成簇分布 通过 对 1 7 7个分 子标 记 和抗 性 基 因的 连锁 分 析 P i 2 5 t 被确认在第 6染色体上 位于标记 A 7和 R G4 5 6之间 距 离前者 1 7 c M 距离后者 1 5 c M 图 1 除此之外 没有 发现其他位点与中 1 5 6 谷梅 2号重组 自交系群体的穗瘟抗 性 有关 2 3 定 位对 C a 8 9表现 叶瘟 抗性的基 因 在对 3 0 4个重组 自交系群体进行 的叶瘟接种试验中 只 有 1个株系 的稻瘟病抗性 表现不一 致 另外 3 0 3个株 系 的抗 性表现稳定一致 其中 1 4 8个株系表现为感病 1 5 5个株系 为抗病 符合 1 1的比例 P 0 6 9 表明群体的叶瘟抗性 由单一基因控制 与群体对 9 2 1 8 3的抗性相比 抗性差异体 现在 5 8个株系上 6个对 C a 8 9表现抗病 的株系对 9 2 1 8 3 感病 而 5 2个对 C a 8 9 感病的株系对 9 2 1 8 3表现为抗病 在利用 MA P MA KE R进行分析时 将株系的表型替换 成标记基因型 即抗性株系用谷梅 2号基因型代替 感病株 系用中 1 5 6基因型代替 结果表明 抗稻瘟病基因位于标记 B 1 0和 R6 7 4之间 图 1 距离前者 5 7 c M 距离后者 2 5 8 c M 该基因暂时取名为 P 2 6 t 3 讨论 稻 瘟病 抗性 一 般 可 以分 为 完 全抗 性 和 部 分抗 性 两 种 本文主要研究完全抗性 除了验证了来 自谷梅 2号穗瘟抗 性基因 P i 2 5 t 以外 还定位了一个对菲律宾主要稻瘟病小 种 C a 8 9的叶瘟抗性 基因 P 2 6 t 该 基 因也来 自谷 梅 2号 两个基因都位于第 6染 色体上 的一个 区域 该 区域还 有 P i z s Pi 9 t P 8和 Pi l 3 t 等抗瘟基因 1 1 3 5 l 这些 基因的等位性还有待研究 谷梅 2号作为稻瘟病抗性供体 在抗稻瘟病育种中具有 特殊的意义 因为谷梅 2号为半矮秆材料 生育期相对较 短 在中 1 5 6 谷梅 2号重组 自交系群体中 P i 2 5 t 和 P 2 6 t 的2个抗性等位基因都来自谷梅 2 号 表明谷梅 2号中抗 稻瘟病基因成簇存在 先前的研究表明 中 1 5 6 谷梅 2号重组 自交系群体对中 国稻瘟病菌小种 9 2 1 8 3的抗性由多基因控制 8 谷梅 2号 中可能存在两个控制穗瘟抗性的基因 故本研究 比先前深 入一步 株系从原来的 1 4 8个扩大到 3 0 4个 分子标记从 8 O 个增加到 1 7 7个 连锁群从原来的 8个到现在的 1 2个 尽 管如此 除了Pi2 5 t 以外 并未能找到其他对 9 2 1 8 3表现 穗瘟抗性 的基 因 由于本研究并 未覆盖 整个基 因组 不 能排 除基因可能位于标记未覆盖的区域 另外一种可能性是第 6 染色体上存在两个或两个以上 的抗稻瘟病基因紧密连锁 在上述情况下 利用类似本研究使用的群体并不能确认其他 抗病基因 选育针对 Pi2 5 t 位点的近等替换品系有可能解 决这一 问题 谢辞 非常感谢 Ve r a C r u z 博士对本文提出的建议 感谢 J a n Le a c h教授提供候选基因克隆 康奈尔大学和 日本水稻 基因组项 目提供 R F L P探针 感谢 I RR I 遗传和亚洲水稻生 物技术协作网 AR B N 实验室的同仁提供稻瘟病接种帮助 56 9 参考 文献 1 Ah n S W Mu k e l a r A Ri c e b l a s t ma n a ge me nt u n de r u p l a n d c o n d i t i o ns n Pr o gr e s s i n Up l a n d Ri c e Re s e a r c h Ma n i l a I n t e r n a t i o na l Ri c e Re s e a r c h I ns t i t u t e 1 98 6 36 3 3 7 4 2 Ki y o se wa S Ge n e t i c s a n d e pide mo l o g i c a l mo d e l l i n g o f br e a k do wn o f p l a n t d i s e a s e r e s i s t a nc e An n u Re v Ph yt o pa t h 1 9 8 2 2 O 9 3 一 l 1 7 3 Kino s hi t a C T Re p or t o f c o mmi t t e e o n g e n e s y mbo l i z a t i o n n o me nc l a t u r e a nd l i n k a g e gr o u p Ri c eGe ne t Ne ws l 1 9 9 5 1 2 9 1 5 3 4 Ou S H Ri c e Di sea s e Fa r nh a m Ro y a l UK Co mmo n we a l t h Ag r i c u l t u r a l Bu r e a u x 1 9 8 5 5 B o n ma n J M Ve r g a e l d e D i o s TI Kh in M M P h y s i o l o g i c a l s p e c i a l i z a t i o n o f Py r i c u l a r i a o r y z a e i n t h e Phi l i p pine s Pl an t Di s 1 9 8 6 7 0 7 6 7 7 6 9 6 P e n g SQ 彭 绍裘 Hu a n gFY 黄费元 S u nGC 孙国 昌 e t a 1 S t u d i e s o n d u r a b l e r e s i s t a n c e t o b l a s t di s e a s e i n di f f e r e nt l a t i t u d e s f o r ric e S c i Ag r i c S i n 中国农 业科 学 1 9 9 6 2 9 5 2 5 8 i n C h i n e s e w i t h En g l i s h a b s t r a c t 7 wu J L 吴建利 Z h u a n g J Y 庄 杰云 C a i R Y 柴 荣耀 e t a1 Mo l e c u l a r ma p p i n g o f a ge n e c o n f e r rin g r e s i s t a nc e t o ne c k b l a s t i n ric e Ac t a Ph y t o p a t h S i n 植 物 病 理 学 报 2 0 0 0 3 0 2 1 1 1 1 1 5 i n C h i n e s e wi t h E n g l i s h a b s t r a c t 8 Z h u a n g J Y Ma W B Wu J L e t a 1 Ma p p i n g o f l e a f a n d n e c k bl a s t r e s i s t a nc e ge n e s wi t h r e s i s t a nc e ge n e a na l o g RAPD a n d RF L P i n ri c e E u p h y t i c a 2 0 0 2 1 2 8 3 3 6 3 3 7 0 9 Yo s h i mu r a A Na g a t o Y Re p o r t o f t he c o mmi t t e e o n g e n e s y r f l b o l i z a t i o n n o me n c l a t u r e a n d l i n k a g e g r o u p s I Re g i s t r a t i o n o f ne w g e ne s y mb o l s Ri c eG n e t Ne ws l 20 02 1 9 5 6 i 0 Li nc o l n S Da l e y M La n de r E Co ns t r u c t i n g Ge n e t i c Ma p s wi t h MA PMAKE R E XP 3 0 Wh i t e h e a d I n s t i t u t e T e c h n i c a l R e por t 3 r d e d n Ca mb rid g e W h i t e he a d I n s t i t u t e 1 9 9 2 1 1 Ca us s e M A Fu l t o n T M Cho