金黄色葡萄球菌.ppt

金黄色葡萄球菌检验 有关金葡菌的一些事件 金黄色葡萄球菌因思念 三全 湾仔码头事件而引发标准争议 在2011年12月21日实施的速冻食品新国标中 金黄色葡萄球菌从原来 不得检出 变为 限量检出 但这一检测标准的改变并不代表可以忽略金黄色葡萄球菌的危害性 金黄色葡萄球菌Staphylococcusaureus 金黄色葡萄球菌 属于微球菌科 葡萄球菌属的 有 金葡菌 等别称金葡菌是化脓性感染的常见致病菌 能导致肺炎 心包炎 毛囊炎 败血症 烫伤样皮肤症等传播途径 水 食物等超级细菌 耐甲氧西林金葡 万古霉素 金黄色葡萄球菌生物特征 形态特征 革兰氏染色阳性 呈葡萄串状排列 无鞭毛 无芽胞 有荚膜 体外培养一般不产生 在陈旧培养物中 衰老的菌体常转为革兰氏阴性 培养特性 最宜温度 37 6 5 46 最适宜pH 7 4 4 2 9 3 耐盐性 可在10 15 NaCl 40 胆汁中生长能产生色素 血浆凝固酶 接触酶 肠毒素等 金黄色葡萄球菌的检测方法 GB4789 10 2016ISO6888FDA BAM onlinechapter12化妆品卫生规范USP BP EP GB4789 10 2016的主要变化 1 删除了英文名称2 修改操作程序 删除了分离培养基血平板3 删除了增菌液10 氯化钠胰酪胨大豆肉汤 跟国际接轨 FDA ISO等均无定性方法 且都使用7 5 氯化钠肉汤 4 修改葡萄球菌肠毒素检验为可选项 定性检测 选择性增菌 步骤 称取25g样品至盛有225ml7 5 氯化钠肉汤或10 氯化钠胰酪胨大豆肉汤的容器中 均质 液体样品量取25mL 作用 1 复苏细菌 2 选择性增菌操作要点 1 准确称 量 取 2 按标准要求时间温度培养 定性检测 平板划线分离 步骤 分别用接种环取培养液1环 划线接种于一个Baird Parker平板和一个血平板 于36 1 分别培养18 24h 血平板 或40 48h Baird Parker平板 作用 以划线方式在琼脂平板上分离出单菌落 通过单菌落的菌落形态判别出具有典型形态的可疑菌落进行下一步生化及血清实验确定 操作要点 1 保持用于划线平板表面干燥2 必须在平板中画出单菌落3 用于划线平板需要现配现用 定性检测 平板划线分离 菌落形态 灰色到黑色 边缘常为淡色 周围为一混浊带 在其外缘常有一透明圈 主要成分 卵黄亚碲酸钾 丙酮酸 甘氨酸 氯化锂 注意点 一 卵黄亚碲酸钾需要预热到50 左右 加入冷却到50 培养基基础中 二 长期保存的冷冻或干燥食品中菌落颜色较淡一些 外观可粗糙干燥 定性检测 平板划线分离 菌落形态 白色或者金黄色菌落 周围有透明溶血环 溶血 主要成分 蛋白胨 牛肉粉 脱纤维羊血 注意点 一 使用前观看平皿是否有干裂或染菌 二 开封后未使用完的培养基要及时放于冰箱保存 定性检测 血浆凝固酶鉴定试验 步骤 可疑菌落 5mLBHI 36 1 培养18 24h 0 5mL兔血浆 0 2 0 3mLBHI培养物 36 1 培养6h 每半小时观察 同时设置阳性 如 ATCC6538 阴性 如 表葡ATCC12228 阳性现象 试管倾斜或倒置时 呈现凝块 即凝固现象 或凝固体积大于原体积的一半 注意点 1 必须每半小时观察 2 陈旧培养物 培养超过18 24h 或生长不良的 可能导致假阴性 3 不能使用甘露醇氯化钠琼脂上的菌落 高盐可能导致假阴性 GB4789 10 2010 第一法 定性检测 第二法 平板计数法 第三法 MPN计数法 平板计数法 平板计数法 平板接种 步骤 10倍系列梯度稀释 并选取2 3个适宜梯度 每个梯度吸取1mL 以0 3 0 3 0 4mL分别接种3个BP平板 涂布 完全吸收样液后 倒置培养 选取3个平板菌落数合计20 200cfu的梯度平板 计数典型菌落数挑去5个典型菌落 不够5个全挑 做血浆凝固酶实验 注意点 1 用于涂布平板必须干燥 2 涂布是 涂布棒不要接触平板边缘 平板计数法 计算 选择合计菌落数在20 200的平板 计算典型菌落数 如果 a 只有一个稀释度平板菌落数在20 200CFU之间且有典型菌落 计数该稀释度平板上典型菌落 b 最低稀释度平板的菌落小于20 计数该稀释度平板上的典型菌落 c 某一稀释度平板的菌落大于200且有典型菌落 但下一稀释度平板上没有典型菌落 计数该稀释度平板上的典型菌落 平板计数法 计算 d 某一稀释度平板的菌落大于200且有典型菌落 且下一稀释度平板上有典型菌落 其平板上的菌落数不在20 200之间 按以下公式 计数该稀释度平板上的典型菌落 T AB Cd其中T 样品中金黄色葡萄球菌菌落数A 某一稀释度典型菌落总数B 某一稀释度凝固酶阳性菌落数C 某一稀释度用于凝固酶试验的菌落数d 稀释因子 平板计数法 计算 e 两个连续稀释度平板菌落数均在20CFU 200CFU之间 按以下公式计算 A1B1 C1 A2B2 C21 1d式中 T 样品中金黄色葡萄球菌菌落数A1 第一稀释度 低稀释倍数 典型菌落总数A2 第二稀释度 高稀释倍数 典型菌落总数B1 第一稀释度 低稀释倍数 血浆凝固酶阳性菌落总数B2 第二稀释度 高稀释倍数 血浆凝固酶阳性菌落总数C1 第一稀释度 低稀释倍数 用于血浆凝固酶试验的菌落总数C2 第二稀释度 高稀释倍数 用于血浆凝固酶试验的菌落总数1 1 计算系数d 稀释因子 第一稀释度 T 平板计数法 计算 例3 T AB Cd 69 54 62 4 5 0 1 1480 例4 T A1B1 C1 A2B2 C21 1d 39 34 42 3 5 1 1 1 3 3 1 1 0 1 30 1650 1480 655 GB4789 10 2010 第一法 定性检测 第二法 平板计数法 第三法 MPN计数法 MPN计数法 适用性 平板计数法 适用于金葡菌含量较高的食品中金葡菌计数MPN法 适用于金葡菌含量较低而杂菌含量较高的食品中金葡菌的计数 报告方式 定性 检出or未检出 25g mL 平板计数法 按计算结果报告CFU g