沉默CCR和CAD基因培育低木质素含量转基因多年生黑麦草_胡可.pdf

沉默 和 基因培育低木质素 含量转基因多年生黑麦草 胡可 严雪锋 栗丹 唐晓梅 杨宏 王艳 邓洪渊 马欣荣 中国科学院成都生物研究所 四川 成都 中国科学院研究生院 北京 摘要 木质素作为维管植物的重要成分之一 主要存在于细胞的次生壁中 然而 木质素却是许多工农业加工过程 的限制因素 例如在化学制浆 牧草消化以及木质纤维转化为生物酒精等过程中 肉桂酰辅酶 还原酶 和 肉桂醇脱氢酶 是催化木质素单体生物合成最后两步的关键酶 本研究根据 中黑麦草 和 基 因序列设计特异引物并添加相应酶切位点 从野生型多年生黑麦草 分离克隆 和 基因片段 分别 构建了含正反方向目的片段的植物表达干扰载体 和 通过根癌农杆菌 介导转入多 年生黑麦草胚性愈伤组织 经过巴龙霉素筛选和 检测获得导入了干扰 和 基因片段的转基因株系 和 常规方法测定相对木质素含量 结果显示 与对照相比 有 株 植株和 株 植株木 质素含量显著降低 分别平均降低了 且生长正常 本研究表明通过干扰 和 基因表 达 可以获得低木质素含量的多年生黑麦草 为进一步培育易消化吸收的黑麦草提供了良好的种质资源 关键词 木质素 肉桂酰辅酶 还原酶 肉桂醇脱氢酶 多年生黑麦草 遗传转化 中图分类号 文献标识码 文章编号 木质素是一种复杂的芳香族化合物多聚体 主要存在于植物细胞的次生壁 与纤维素和半纤维素共价结合 赋予细胞壁强度和硬度 为植物组织提供机械支持 使得植株向上生长 木质素还使植物的脉管组织具有疏水 性 便于水分和营养物质的长距离运输 还能保护植株避免病原体入侵 在大多数被子植物中 木质素主要 由愈创木基木质素 和紫丁香基木质素 这两种木质素单体亚单位构成 它们分别来自松柏醇 和芥子醇 第三种木质素单体亚单位对羟基苯基木质素 来自香豆醇 它在单子叶植物中相对较多 而 在双子叶植物中较少 图 为木质素合成途径 木质素作为维管束植物细胞壁的主要成分 长期以来被认为不利于饲料品质 造纸和纤维素燃料的生产 例如 在制浆造纸工业中 需通过严格的化学工艺从木材中去除木质素以获得纯的纤维素纤维 在草料消化和 生产乙醇时木质素也是主要的限制因子 因此 低木质素含量的牧草或者木材的培育 是育种的方向之一 如 今大部分研究主要是通过基因工程手段降低植株的木质素含量或者改变其组成 木质素单体作为组成木质素的亚单位 产生于苯丙氨酸途径的一个分支 图 肉桂酰辅酶 还原酶 和肉桂醇脱氢酶 是催化木质素单体生 物合成最后两步的关键酶 许多研究通过在不同植物中抑制这两种酶的表达降低了木质素含量或是改变了木质 素的组成 是木质素特异途径的关键酶之一 在木质素的生物合成中起着重要作用 它以 种羟基肉桂酸的 酯 对 香豆酰辅酶 咖啡酰辅酶 阿魏酰辅酶 羟基阿魏酰辅酶 和芥子酰辅酶 作为底物催化生成相 应的肉桂醛 基因表达受影响的拟南芥 突变体 木质素含量降低的同时表现出外 形矮小 衰老延缓的性状 下调的转基因杨树 木质素含量可降低 年 月 草 业 学 报 第 卷 第 期 收稿日期 改回日期 基金项目 国家 计划项目 和国家自然科学基金项目 资助 作者简介 胡可 男 四川江油人 硕士 通讯作者 图 苯丙烷和木质素单体生物合成途径 重点显示了木质素单体的合成途径 苯丙氨酸解氨酶 肉桂酸 羟化酶 羟基肉桂酰辅酶 连接酶 对香豆酸 羟化酶 咖啡酸 羟基阿魏酸 甲基转移酶 阿魏酸 羟化酶 羟基肉桂酸转移酶 咖 啡酰辅酶 甲基转移酶 肉桂酰 还原酶 肉桂醇脱氢酶 芥子醇脱氢酶 芦丁 糖苷 芦丁 山奈酚二糖苷阿魏酸 山奈酚二糖苷丙二酸酯 山奈酚 糖苷 黄酮类化 合物 苯丙氨酸 肉桂酸 对 香豆酸 咖啡酸 阿魏酸 羟基 阿魏酸 芥子酸 对 香豆酰辅酶 香豆酰莽草酸 香豆酰奎尼 酸 咖啡酰辅酶 阿魏酰辅酶 羟基阿魏酰辅酶 芥子酰辅酶 对 香豆醛 咖啡醛 松柏醛 羟基松柏醛 芥子醛 对 香豆醇 松柏醇 羟基松柏醇 芥子醇 过氧化物酶 漆酶 型木质素 型木质素 型木质素 第 卷第 期草业学报 年 其中 比 减少得更多 另外半纤维素 果胶和木聚糖的合成也减少 外层木质部表现出橙棕 色且着色不均 并且伴随着纤维素比例的增加 改善了制浆特性 下调的烟草 木质 素含量降低 而 下调植株的木质素中含有更多的醛类物质 转录和代谢研究表明木质素合成途径与其他代 谢途径相关联 玉米 基因插入突变体 基因的表达量只有野生型的 其木质素含量有所下降且结构明显改变 含量明显下降 略有上升 并且消化性能提高 但未影响植 株的生长发育 另外 由于苯丙氨酸代谢途径不仅生成木质素 还生成其他的植物次生代谢物 如类黄酮 羟 基苯乙烯 单宁酸等酚类化合物 因此 可通过降低木质素的生物合成来促进有益的可溶性酚类化合物生成 在 干扰 基因的转基因番茄 中 木质素含量降低 同时茎和叶中可溶性酚类物质的总 含量增加 组分分析显示绿原酸和芦丁等含量增加 果实中酚类物质总量没有增加 但是组分发生改变 相应地提 高了番茄提取物的抗氧化能力 催化木质素单体生物合成的最后一步 将 种肉桂醛 对 香豆醛 松柏醛和芥子醛 还原生成相应的 种肉桂醇 等 通过 下调柳枝稷 中 表达 发现这些植株茎中催化松 柏醛和芥子醛的 活性下降 总木质素含量和表皮素含量也明显降低 且经过氢氧化铵预处理和纤维素酶消 化的研磨样品释放出的葡萄糖也多于野生型对照 等 利用 下调玉米 基因表达 结果显示 在不同组织中 下调的程度不同 转基因植株细胞壁的成分发生变化 茎的细胞壁总木质素含量未受影响 比例稍有下降 并且积累了更多的纤维素和木聚糖 而中脉的细胞壁总木质素含量和多糖含量下降 转基因 植株与野生型相比表型没有改变 但更容易降解 乙醇产量也较高 下调亚麻 中的 后 木质素前体物质含量显著提高 木质素 果胶和半纤维素含量降低 转基因植株的弹性增加 下调 的转基因烟草 植株生长发育正常 木质素含量未受影响 仅 略有减少 还有研究将拟南 芥 种 基因 和 的突变体和 的突变体杂交后发现其木质素含量比野生型减少了 木质素结构也发生改变 但植株严重矮化并伴有雄性不育症状 综上所述 利用 技术并结合转基因方法 在多种植物中 可以通过降低木质素合成途径中相应酶的表 达而获得木质素含量降低或者木质素组成改变的转基因植物 是由双链 分子介导的 在 水 平关闭相应基因表达的过程 因为 技术简单易行 抑制基因表达效率高 已被广泛应用于真核生物基因功 能的研究 多年生黑麦草 是禾本科黑麦草属 植物 是优良的牧草和草坪草 但自交不亲和 传统育种困难而复杂 随着现代生物技术的发展 转基因技术已成为黑麦草遗传改良的有力工具 可通过 方法和转基因技术获得木质素含量降低的黑麦草 本研究在本实验室已建立的多年生黑麦草转化体系上 优化转化方法 通过根癌农杆菌 介导的 技术 降低多年生黑麦草中 基因表达 以期获得低木质素含量的多年生黑 麦草新材料 为进一步培育高消化利用率的多年生黑麦草提供种质资源 材料与方法 材料 多年生黑麦草品种 雅晴 由百绿草业公司惠赠 本实验在中国科学院成都生物研究所于 年 月至 年 月期间进行并完成 根癌农杆菌 由本实验室保存 植物表达载体 由中国科学院成都 生物研究所马欣荣实验室在 基础上构建 外源基因由多克隆位点区插入 中间载体 由四 川省农业科学院黄维藻博士惠赠 载体示意图见图 和 基因片段的分离克隆 根据 中的黑麦草 登录号 和 登录号 基因 序列 选取其 中约 的片段 应用 软件 分别设计 和 正 反向目的片段的上下游 对引物 表 正向片段和反向片段引物的扩增序列相同 而酶切位点不同 以使目的片段定向插入载体中 预期 片段长度 加酶切位点 共计 片段长度 加酶切位点 共计 图 载体结构简图 中间载体 结构简图 植物表达载体 表达盒示意图 重组植物表达载体 和 干扰片段表达盒示意图 表 用于扩增 正 反向片段的寡核苷酸引物 引物名称 引物序列 酶切位点 扩增片段 正向片段 预期长度 反向片段 预期长度 正向片段 预期长度 反向片段 预期长度 下划线部分为酶切位点 提取新鲜的野生型黑麦草叶片总 用 试剂盒 反转录成 作为扩增目的片段 的模板 用引物 和 和 分别 扩增出 和 的正向片段 表 扩增条件为 个循环 扩增产物经 琼脂糖凝胶电泳 切下目 的条带用 上海生工 回收后与 载体 连接 筛选重组子并测序 上海 生工 测序结果用 版本 软件进行分析 以含有 或 正向片段的重组 载体为模板 分别以 和 和 为引物 扩增出 和 的反向片段 表 再分别克隆到 载体中 筛选重组子 酶切验证并测序分 析 和 植物表达载体构建 含有正向目的片段的重组 载体分别经 和 双酶切 分别回收小片段 与经相同酶 切的中间载体 连接 筛选重组子并酶切验证 再将含 或 反向片段的重组 载体分别 用 和 双酶切后 回收小片段分别插入已经含有 或 正向片段的重组中间载体相应位点 筛 选重组子 酶切验证 分别获得含有干扰片段的中间载体 和 具有发卡结构的干扰片段分 别称为 和 将重组中间载体分别用 和 双酶切后 分别获得 或 目的片段 将目的片段分别插 第 卷第 期草业学报 年 入 载体相应位点 利用变性碱裂解法和双酶切法鉴定重组子 构建的携 或 目的片段反向重复 结构的植物表达载体 分别命名为 和 干扰片段由花椰菜花叶病毒 启动子 驱动 遗传转化 热激法将载体 和 分别导入根癌农杆菌 感受态细胞中 保存于液氮备用 选取成熟的多年生黑麦草 雅晴 种子 经过表面灭菌后接种于 基本培养基 中萌发生长 无菌苗可以 通过组织培养快速繁殖并长期保存 每 转接 次 培养基为 待试管苗生长到一定长 度 分蘖达 个以上时 取茎节分生区并纵切后置于 愈伤组织诱导培养基中 诱导愈伤组织 生长 并每隔 继代 次 共继代 次 将分别含有 和 的根癌农杆菌 均匀涂布在含有 和 的 平板上 待长出菌苔后 刮取适量菌体接种于含 的液体愈伤组织诱导培养基中 培养 左右 为 即可用于转化 愈伤组织预先用细胞凋亡抑制剂 处 理 侵染前 菌液中加入适量 非离子去污剂 水溶液 愈伤组织于菌液中浸没 后 置于无菌滤纸上吸去附着的菌液 然后转入含滤纸 每皿加 灭菌水 的培养皿进行共培养 共培养 后 将愈伤组织接入含 抗生素 的除菌诱导培养基中 培养 后 将愈伤组织 接入含 巴龙霉素 的筛选继代培养基 中 培养 筛选 继代 次 共 次 上述培养均为暗培养 培养基配方参见文献 之后将生长良好的愈伤组织接入含 巴龙霉素的分化培养基 待长 出苗后 移入含 巴龙霉素的 培养基生根培养 待长出根后 移入含 巴龙霉素的筛选培养基进行最后一轮筛选 分化再生培养条件为 光 暗培养 周之 后将发育良好的植株移出 大棚盆栽 愈伤组织诱导 继代 分化 以及植株再生培养基 均参见本实验室配方并优化 在共培养及选择 分化培 养过程中 均添加 共培养后 持续添加至再生苗移入盆钵前 转基因植株鉴定 使用 法提取植株叶片总 作为模板 鉴定 基因目的片段 扩增目的片段上游引 物在 启动子上 下游引物分别为 和 产物为正向片段并包括部分启动子序列 预期扩增片 段长度分别约为 启动子上的引物 反应条件与 相同 转基因黑麦草相对木质素含量测定 根据 鉴定结果 选取 阳性植株和野生型植株 采用紫外分光光度法测定其相对木质素含量 取各独立的转基因植株全叶片 置于 干燥过夜后研磨成粉末 每株分成 份 每份 分别放入 离心管中 加入 溴乙酰 乙酸溶液 和高氯酸 盖紧管口 于 恒温水浴 每 隔 振荡试管 将反应液完全移入已装有 和 冰乙酸混合液的 容量瓶 内 振荡 充分混匀 并用冰乙酸定容至 以冰乙酸为空白溶液 用多功能读数仪 公司 在波长 测定吸光度 利用 处木质素的吸光度作为相 对木质素含量 采用数据学软件 进行统计学分析 式中 为样品溶液木质素吸光度 为样品溶液定容体积 为样品的绝干重量 为黑麦草木质素标准吸光率 根据公式可知 木质素含量与其吸光度呈正相关 结果与分析 正向片段分离克隆 以多年生黑麦草 雅晴 为模板扩增获得的目的片段 经克隆测序 结果表明 片段长度与预期有差异 片段 预期长度是 实际长度为 与预期相差 预期长度是 实际长度为 相差 均不包括添加的酶切位点 通过 版本 软件对测序结果与 中的黑麦草 基因序列 登录号 和 基因序列 登录号 进行比对 并分析结构 结果表明获得的片段均包含一段内含子序列 内 含子序列长度即是差异的长度 分别为 和 去掉内含子 序列与 数据库中目的基因片段 序列同源性分别为 和 图 和图 获得的 基因与 中 序列存在一定 差异 氨基酸序列比对分析 同源性为 结果表明获得的片段为 和 基因片段 图 片段同源性分析 为内含子 图 片段同源性分析 为内含子 植物表达载体 和 的鉴定 获得的目的片段分别以正反方向插入到载体 质粒内含子两侧 构建了重组中间载体 和 用 分别双酶切 和 回收目的片段 和 分别插入相同 酶切的 载体相应位点 构建了含干扰片段的植物表达载体 和 片段长 正向片段 内含子 反向片段 其中包含酶切位点 片段为 正向片段 内含子 反向片段 其中包含酶切位点 由 启动子驱动 用 双酶切 和 分别得到 和 长的目的片段 图 表明 和 基因正 反向目的片段已经插入到 质粒的相应位点 植物表达载体 和 构建完成 图 黑麦草的遗传转化 选择生长状态良好 质地致密均一的黑麦草愈伤组织 图 经过农杆菌浸染 图 再通过 轮巴龙霉素 第 卷第 期草业学报 年 共计 周筛选后 图 进行分化 图 和生根培养 图 和 重组子 和 双酶切验证 标记 重组子 双酶切 重 组子 标记 重组子 双酶切 重组子 图 检测鉴定获得转基因植株 图 携 质粒农杆菌转化多年生黑麦草 从 约 个共培养的愈伤组织中 获得 株正常生长 的抗性植株 个未分化的抗性愈伤组织 以及 株抗性白化苗 携 质粒农杆菌转化多年生 黑麦草 从约 个共培养的愈伤组织中 获得 株正常生长的抗性植株 个未分化的抗性愈伤组 织 以及 株抗性白化苗 未分化的抗性愈伤组织和 白化苗没有应用价值 淘汰 未进行后续研究 观察显示 转基因植株与野生型相比 外观表型上 没有明显差异 生长正常 图 转基因黑麦草 鉴定 利用抗性植株叶片总 作为模板进行 验证 由于 和 克隆片段分别比预期多出 和 内含子序列 因此扩增片段亦比预期分 别长 和 扩增 基因正向目的片段的 引物为上游 启动子引物 和 片段 长度约为 图 扩增 基因正向目的片段 的引物为上游 启动子引物 和 片段长度约为 图 图 多年生黑麦草的遗传转化 胚性愈伤组织 农杆菌浸染后共培养 共培养过程中大部分愈伤组织褐化 转化后在选择培养基上 非抗性褐化 愈伤组织上抗性细胞生 长 抗性愈伤组织分化 生根培养基上的抗性苗 大棚种植的转基因植株和对照 图 检测抗性植株 片段 标记 质粒 野生型对照 阳性植株 假阳性植株 图 检测抗性植株 片段 标记 质粒 野生型对照 阳性植株 假阳性植株 获得的干扰 基因的转基因株系命名为 干扰 基因的命名为 转基因黑麦草相对木质素含量测定 根据 验证结果 分别对 阳性植株和野生型对照进行相对木质素含量测定 目前对 阳性和 阳性各测定了 个独立的转基因植株 提取叶片木质素 在 测定吸光度 图 由于木质素含 量与吸光度呈正相关 因此以野生型的吸光度作为对照 转基因植株的吸光度与之相比较 测定相对木质素含量 结果显示 其中 植株有 株 植株有 株木质素含量明显降低 图 分别显示了 个木质素含量 降低的植株 图 转基因黑麦草相对木质素含量比较 与野生型对照相比 干扰植株木质素含量降低了 平均降低了 干扰 植株木质素含量降低了 平均降低了 经过方差分析 干扰植株和 干扰植 株的相对木质素含量与野生型相比差异极显著 表明 干扰木质素合成途径中的 后 转基因植株叶片总木质素含量明显降低 观察表明 木质素降低的转基因植株与对照相比 外观形态上没有明显差异 生长正常 图 但是触摸感 觉较柔软 第 卷第 期草业学报 年 讨论 多年以来人们都是通过化学和生化角度来研究木质素潜在的合成途径 而如今则更多的是利用经典的正向 遗传筛选和有针对性的反向遗传学方法 目前在知道基因或者基因组序列的情况下 反向遗传学技术更加广泛 地应用在基因功能研究及新材料的创制中 例如 反义抑制 插入突变体的表征分析等手段来进行研究 其中 可以高效 特异性地使目的基因转录后沉默或抑制目标基因表达 从而获得功能丧失性突变个体用 于基因功能的研究 这已成为研究基因功能及转基因育种的重要方法 在植物基因功能研究中 利用含有目标基 因正向和反向重复序列片段能形成发卡结构的 来沉默内源基因 是应用于转基因诱导基因沉默 最高效的方法 这种 干扰方法效率高 作用持久 可稳定遗传给子代 本研究中 预期扩增的片段为 序列 但是结果获得的片段含有一段约 的内含子 可能是提取 的 中混有 因此扩增出了含有内含子的片段 通过对木质素含量的测定 表明含有内含子的干扰片 段没有影响对目的基因表达的沉默 亦有可能参与了对目的基因的沉默作用 近年来的研究表明 内含子也参与 了基因的表达调控 构建的载体正 反向片段中均包含目的基因内含子 内含子片段在 过程中也会配 对形成双链互补的小分子 可能会对目标基因调控产生影响 获得的 基因片段的外显子与 中 参考的序列 核苷酸序列同源性为 差 异 相对 较大 氨 基酸序列比 对分析 同源性为 推测获得的片段可能是 基因家族中 个基因的片段 由于植物木质素合成酶系存在多基因家 族现象 其中 是典型的以家族形式出现 数据库中目前已公布了 个黑麦草 的 序 列 登录号 和 个黑麦草 的 序列 登录号 干扰该基因的表达 在转基因植株中 导致了木质素含量的显著降低 因此 本研究获得的 片段可能是该 家族中一个基因的片段 由于黑麦草属于单子叶禾本科植物 并非农杆菌的天然受体 遗传转化较为困难 愈伤组织再生频率低 因此需要对受体材料和转化方法加以改进 有研究利用黑麦草幼苗分蘖处分生区诱导获得的愈伤组织作为受体 获得了较高的遗传转化效率 还有研究通过改进转化方法 极大地提高了二穗短柄草 和假俭草 的转化效率 在此基础上 并结合本实验室建立的方法 再次 优化了转化方法 在农杆菌侵染愈伤组织前 还用细胞凋亡抑制剂 对愈伤组织进行预处理 以减轻农杆菌 侵染愈伤组织后对其造成的褐化坏死 并在侵菌时加入非离子去污剂 以利于农杆菌的附着和增加细胞膜的 通透性 黑麦草作为优良的牧草和草坪草在我国的种植和应用越来越广泛 新材料的培育具有重要意义 降低黑麦 草木质素含量 有利于提高饲草的利用率和消化率 因此本研究应用 技术分别抑制了多年生黑麦草木质 素合成途径中的关键酶 和 以获得木质素降低的转基因黑麦草 结果显示 通过导入干扰 和 基因的片段 能获得木质素显著降低的转基因植株 表明 在黑麦草木质素合成途径中起关键作 用 同时也表明可以通过 技术培育低木质素含量的多年生黑麦草 获得的转基因植株生长发育正常 未出 现倒伏 褐化等异常 表明利用 技术适度抑制黑麦草木质素合成 能够得到生长发育正常的转基因植株 本结果与 等 的研究报道相似 等 下调 与本研究不同的干扰片段 或 咖啡酸 甲基转移酶 的转基因多年生黑麦草在温室和田间均表现出总木质素含量和 三种 单体的含量同时降低 但 没有明显下降 这些木质素含量降低的转基因植株的消化品质得到改善并且未对 生长发育产生明显不利影响 当木质素正常合成代谢途径受阻时 可能有其他次生代谢物填充于木质素构架中 使得植物体内的生理功能不受影响 本研究获得的转基因植株中 约 的植株总木质素含量显著降低 其余的与对照相比 未见明显降低 许 多研究表明 外源基因的导入 常有表达发生沉默的现象 而且木质素生物合成途径极其复杂 受时间 空间 和环境因素影响较大 因此有部分转基因植株木质素含量没有变化 在进一步进行育种研究中