PCR技术及其应用ppt课件.ppt

1 第八章PCR技术及其应用 2 PCR技术的建立 Khorana 1971 等提出在体外经DNA变性 与适当引物杂交 再用DNA聚合酶延伸 克隆DNA的设想 修复复制 但由于测序和引物合成的困难 以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能 所以 Khorana的设想被人们遗忘了 3 1983年 Mullis发明了PCR技术 使Khorana的设想得到实现 Mullis的构思 引物 引物 DNA聚合酶 DNA聚合酶 特定DNA片段 4 94 变性 50 65 退火 XX 延伸 5 94 55 37 6 TaqDNA聚合酶 thermusaquaticus 酶活性 温度 405060708090100 10080604020 1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶 Taq 引入了PCR技术 7 72 94 55 PCR循环 8 KaryB Mullis 1989年美国 Science 杂志列PCR为十余项重大科学发明之首 比喻1989年为PCR爆炸年Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖 我不大喜欢动手 我宁肯不动手 我不喜欢做费力的事 作为一个发明家 重要的一点是为解决某些问题而尽力设计一个简捷的动手方案 这是PCR的发明者Mullis在1991年对 研究与发展 杂志 R D 记者说的一番话 9 第一节PCR技术原理和工作方式 第八章PCR技术及其应用 10 一 PCR的基本原理 类似于DNA的体内复制首先待扩增DNA 模板加热变性解链 随之将反应混合物冷却至某一温度 这一温度可使引物与它的靶序列发生退火 再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸这种热变性 复性 延伸的过程就是一个PCR循环 PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复 11 12 PCRCycle Step1 DenaturationTemplateDNAbyHeat 95oC TargetSequence TargetSequence PCR原理示意图 模板DNA的变性 模板DNA经加热至93 左右一定时间后 使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离 使之成为单链 以便它与引物结合 为下轮反应作准备 13 PCRCycle Step2 Temperatureislowered Tm andprimersannealtotargetsequences TargetSequence TargetSequence Primer1 Primer2 5 3 5 5 3 5 3 3 模板DNA与引物的退火 复性 模板DNA经加热变性成单链后 温度降至55 左右 引物与模板DNA单链的互补序列配对结合 14 PCRCycle Step3 At72oCTaqDNApolymerasecatalysesprimerextensionascomplementarynucleotidesareincorporated TargetSequence TargetSequence Primer1 Primer2 5 3 5 5 3 5 3 3 TaqDNAPolymerase 引物的延伸 DNA模板 引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下 以dNTP为反应原料 靶序列为模板 按碱基配对与半保留复制原理 合成一条新的与模板DNA链 15 Endofthe1stPCRCycle Resultsintwocopiesoftargetsequence TargetSequence TargetSequence 每完成一个循环需2 4分钟 2 3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍 16 PCR的基本原理 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 模板DNA 第1轮扩增 第2轮扩增 第3轮扩增 第4轮扩增 第5轮扩增 第6轮扩增 理想拷贝数 2nn循环次数实际拷贝数 1 x nX平均效率 约为0 85n循环次数 17 TargetAmplification No ofNo AmpliconCyclesCopiesofTarget122438416532664201 048 576301 073 741 824 1cycle 2Amplicon 2cycle 4Amplicon 3cycle 8Amplicon 4cycle 16Amplicon 5cycle 32Amplicon 6cycle 64Amplicon 7cycle 128Amplicon 18 PCR反应 重复1 3步25 30轮 目的DNA片段扩增100万倍以上 DNA双螺旋 DNA单链与引物复性 DNA变性形成2条单链 子链延伸DNA加倍 19 二 PCR反应体系 缓冲液dNTP引物模版DNA聚合酶 20 1 缓冲液 标准的缓冲液含10mMTris HClpH为8 3 9 0 室温 而在延伸温度 72 下 pH值接近7 2缓冲液中含有一种二价阳离子 用于激活DNA聚合酶的活性中心 一般使用Mg2 有时使用Mn2 缓冲液中还含有50mM的钾离子有些缓冲液中还加入一些添加剂和共溶剂可降低错配率 提高富含G C模板的扩增效率 21 Mg2 Mg2 是DNA聚合酶的激活剂 Mg2 浓度过低会使Taq酶活性丧失 PCR产量下降 Mg2 过高影响反应特异性 Mg2 可与负离子结合 所以反应体系中dNTP EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2 浓度 一般以MgCl2的形式提供 标准浓度为1 5mM Mg2 浓度的高低会影响扩增的特异性和产率 22 2 dNTP 脱氧核苷三磷酸是DNA合成的底物标准的PCR反应体系中含有等摩尔浓度的4种dNTP 终浓度一般为200mM 即饱和浓度 浓度过高易产生错误碱基的掺入 浓度过低则降低反应产量dNTP可与Mg2 结合 使游离的Mg2 浓度下降 影响DNA聚合酶的活性 23 3 引物 在多数试验中人们习惯使用的引物浓度为各1mM 即1pmol ml浓度过高易导致模板与引物错配 反应特异性下降 24 引物设计原则 引物长度一般以18 30bp为宜 过短则降低特异性 过长则会引起引物间的退火而影响有效扩增 同时也增加引物合成的成本 避免引物内部出现二级结构 避免序列内有较长的回文结构 使引物自身不能形成发夹结构 G C和A T碱基均匀分布 G C含量在40 60 之间 引物碱基序列尽可能选择碱基随机分布 避免出现嘌呤或嘧啶连续排列 25 要避免两个引物间特别是3 末端碱基序列互补以及同一引物自身3 末端碱基序列互补的 使它们不能形成引物二聚体或发卡结构 引物3 末端碱基一般应与模板DNA严格配对 并且3 末端为G C或T时引发效率较高 引物5 末端碱基可不与模板DNA匹配 可添加与模板无关的序列 如限制性核酸内切酶的识别序列 ATG起始密码子或启动子序列等 便于克隆和表达 但其保护碱基有一定的要求 引物的碱基顺序不能与非扩增区有同源性 26 27 28 29 30 31 4 模板 单 双链DNA均可 不能混有蛋白酶 核酸酶 DNA聚合酶抑制剂 DNA结合蛋白类 用人类或哺乳动物基因组DNA进行扩增时 一般使用1 gDNA以酵母菌 细菌 质粒和M13噬菌体噬菌斑的DNA作模板时 分别需要10ng 1ng 1pg和1 噬菌斑 32 5 DNA聚合酶 TaqDNA聚合酶来自嗜热古细菌的嗜热水生菌 Thermusaquaticus TaqDNA聚合酶分子量大小为94kDa 为单分子酶 在75 活性最强 具有5 3 合成活性和5 3 外切活性 但是无3 5 外切活性 由于没有3 5 外切活性 在扩增过程中有8 9 11x10 5的错配几率 在95 的半衰期为40分钟 启动PCR反应的能力很强 聚合速度快 在72 的聚合速度为每秒30 100碱基 33 TthDNA聚合酶TthDNA聚合酶来自嗜热热细菌 Thermusthermophilus HB8 由Promega公司开发成商品 TthDNA聚合酶分子量为94kDa 在74 进行扩增 在95 的半衰期为20分钟 在Mg2 存在条件下以DNA为模板合成DNA 而在MnCl2存在下可以RNA为模板合成cDNA 因此可在高温下做RT PCR 反转录和引物延伸 primerextension 反应 避免RNA反转录过程中形成的二级结构 34 VentDNA聚合酶VentDNA聚合酶是从由火山口分离的嗜热球菌Thermococcuslitoralis中分离的第一个具有3 5 外切活性的高温DNA聚合酶 由NewEnglandBlabs公司开发出商品 酶分子为85kDa 具有更长的半衰期 在100 使用MgSO4 时 其半衰期为1 8小时 35 PwoDNA聚合酶PwoDNA聚合酶来自Pyrococcuswoesei BM 大小为90kDa 由原德国宝灵曼公司开发 在100 的半衰期大于2小时 出错率低 是使用较多的具有3 5 外切活性的且具有高保真度的PCR酶 36 PfuDNA聚合酶PfuDNA聚合酶来自激烈热球菌具有理想的扩增保真度 具有极高的热稳定性 是目前使用最广泛的具有3 5 外切活性的PCR酶 商用混合酶为了提高扩增的保真度或扩增较长的DNA片段 将TaqDNA聚合酶的强启动能力和具有3 5 外切活性的高温DNA聚合酶的高持续活性和校正功能结合起来 可以达到很好的效果 37 三 PCR反应程序 1 变性使双链DNA解链为单链95 20 30秒 2 退火温度由引物长度和GC含量决定 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合 降低温度可增加反应的灵敏性 38 3 延伸70 75 延伸时间由扩增片段长度决定 4 循环次数主要取决于模版DNA的浓度一般为25 35次次数过多 扩增效率降低 错误掺入率增加 39 PCR反应中的注意事项 一 防止污染试剂小量分装吸头及EP管一次性使用器皿及工作区域要分开 无菌操作 二 设立对照阳性对照 阳性模板阴性对照 阴性模板试剂对照 除模板外的所有组分 40 第二节PCR产物的克隆 第八章PCR技术及其应用 41 一 在PCR产物两端添加限制性酶切位点 为了使PCR产物能够方便的装载到克隆载体上 可在扩增的过程中在其两端添加限制性酶切位点设计引物 正常的特异性序列 在引物的5 末端添加酶切位点 保护序列 在选择酶切位点的种类时 要保证所选的酶切位点在扩增的DNA片段内部不存在 如果对扩增的DNA片段的序列不清楚 可优先选用切割频率相对较少甚至酶切位点为8个碱基序列的酶切位点 42 二 A T克隆法 TaqDNA聚合酶具有末端转移酶的活性可在DNA片段的3 末端添加一个核苷酸 通常为A 因此TaqDNA聚合酶扩增的产物可与T 载体进行粘端互补连接 达到高效克隆的目的T 载体最初由Promega公司开发出商品 并一直沿用到现在 如和pGEM TEasy 43 44 在DNA的3 末端添加一个T碱基的方法 如用末端转移酶和底物ddTMP可以产生单个T的突出末端有些识别不对称序列的限制性内切酶 如Mbo Xcm 和Hph 在切割DNA后可直接产生一个3 突出的T用TaqDNA聚合酶和高浓度的dTTP也可产生3 突出的T 45 46 三 平末端DNA片段的克隆 1pPCR ScriptAmpSK 克隆载体该载体从pBluescript SK 噬菌粒改造而来 将多克隆位点中的Xba 和Spe 位点改成Srf 位点 5 GCCC GGGC 3 克隆DNA片段时 先将载体用Srf 切成线状 再与目标DNA片段混合作连接反应 在连接体系中除了添加T4DNA连接酶外 还加入Srf 酶 在这个反应体系中 当载体发生自连后 Srf 酶又会将其切开 载体就处于酶切与连接的动态平衡中只有当载体与目标DNA片段连接后 酶学反应才能稳定下来 从而将总体的反应平衡向载体与目标DNA片段连接这个方向倾斜 47 2pCR Blunt克隆载体pCR Blunt载体最大特点是在lacZ 基因的下游融合了一个ccdB基因 该基因对大肠杆菌是致死的 该载体大小为3 5kb 含卡那霉素抗性基因和Zerocin抗性基因在克隆外源平末端DNA片段时 先将改载体切成线状 再与目标DNA连接 转化大肠杆菌如果载体发生自连 获得这些载体的大肠杆菌宿主细胞就会死亡 只有当外源DNA片段与载体连接后 ccdB基因的表达受到阻断 重组质粒才能在大肠杆菌中存在下来 48 四 长片段DNA的PCR扩增 在长片段的PCR扩增过程中高温会降低缓冲液的缓冲能力 从而损害模板DNA和PCR产物在高温下其它二价离子的存在会促进DNA的裂解长片段DNA分子的变性比短片段困难DNA聚合酶与模板DNA的趋近和结合变得困难错配碱基的掺入导致DNA聚合酶的作用不能正常发挥 从而限制产物的长度 49 为了提高扩增产物的长度一方面改进缓冲体系另一方面采用混合DNA聚合酶即主体使用扩增效率高 延伸能力强的TaqDNA聚合酶 少量使用具有3 5 外切活性的高温DNA聚合酶 如Pfu或PwoDNA聚合酶 及时切除不匹配碱基的掺入这样可使扩增长片段DNA有效实施 可扩增长达40kb的DNA片段 50 第三节PCR扩增未知DNA片段 第八章PCR技术及其应用 51 一 反向PCR二 利用接头的PCR三 热不对称交错PCR 52 一 反向PCR 是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增 可对未知序列扩增后进行分析 如探索邻接已知DNA片段的序列 用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆 扩增基因文库的插入DNA 建立基因组步移文库 已知序列 未知序列 未知序列 53 已知序列 未知序列 未知序列 限制酶 限制酶 连接酶 54 二 利用接头的PCR 55 三 热不对称交错PCR TAIL PCR TermalAsymmetricInterlacedPCR 目的 扩增产生特异长度的单链DNA 方法 采用两种不同浓度的引物 用途制备核酸序列测定的模板制备杂交探针基因组DNA结构功能的研究 染色体步查 56 在利用特异引物和随机引物进行PCR中一般有3种产物生成 1 由特异性引物和简并引物扩增出的产物 2 由同一特异性引物扩增出的产物 3 由同一简并引物扩增出的产物 在TAIL PCR反应中 其中后2种产物可以通过以嵌套的特异性引物进行的后续反应来消除 57 原理 TAIL PCR的基本原理利用目标序列旁的已知序列设计3个嵌套的特异性引物 specialprimer 简称sp1 sp2 sp3 约20bp 用它们分别和1个具有低Tm值的短的随机简并引物 Arbitrarydegenerateprime AD 约14bp 相组合以基因组DNA为模板 根据引物的长短和特异性的差异设计不对称的温度循环 通过分级反应来扩增特异引物 58 步骤 TAIL PCR共分3次反应 第一次反应包括5次高特异性 1次低特异 10次较低特异性反应和12个热不对称的超级循环5次高特异性反应 使sp1与已知的序列退火并延伸 增加了目标序列的浓度 1次低特异性的反应使简并引物结合到较多的目标序列上 10次较低特异性反应使2种引物均与模板退火 随后进行12次超级循环 59 经上述反应得到了不同浓度的3种类型产物特异性产物 I 型和非特异性产物 II型和III型 第二次反应将第一级反应的产物稀释1000倍作为模板通过10次热不对称的超级循环 使特异性产物被选择地扩增 而非特异产物含量极低 第三次反应将第二次反应的产物稀释作模板再设置普通的PCR反应或热不对称超级循环 通过上述3次PCR反应可获得与已知序列邻近的目标序列 60 61 62 应用 Gento等曾用构建的含有潮霉素抗性基因 hph 的双元表达载体pBIG2RHPH2转化真菌然后利用TAIL PCR法克隆得到的真菌转化子基因组DNA的T DNA插入区的旁侧序列根据T DNA区的HPH基因设计了扩增右边界的3个引物HS1 HS3 以及扩增左边界的引物HAS2 HAS4 另外又根据不同的转化子分别设计了简并引物ADl AD3 63 64 第四节与反转录相关的PCR 第八章PCR技术及其应用 65 一 cDNA末端的快速扩增 RACERapidamplificationofcDNAend5 RACE3 RACE 66 5 RACE AAAAA CCCCCC GGGGGG 67 巢式PCR 68 二 差异显示PCR DD PCR流程图 69 第五节PCR产生DNA指纹 第八章PCR技术及其应用 70 一 多重PCR二 RAPD 随机扩增多态性PCR三 RFLP四 AFLP 扩增片段长度多态性PCR 71 一 多重PCR 在一个反应体系中使用一对以上的引物用于等位基因的鉴定对每种类型的基因设计特异性的PCR引物 并且产物大小彼此不同通过扩增产物的大小判断样品中基因类型检测特定基因序列的存在或缺失 72 电泳 引物 73 DMD 人类肌营养不良基因 A 无外显子8 12 17 19对应条带 说明病人外显子8 19缺失 B 正常强度的一半病人A中未扩增外显子带的强度为C的一半 提示为区域缺失携带者 C 正常人DMD基因外显子的一般扩增形式 多重PCR检测DMD基因缺失 74 二 RAPD标记 随机扩增多态性PCRrandomamplifiedpolymorphicDNA RAPD1990年 由美国杜邦公司的科学家Williams推出RAPD方法是在PCR技术基础上发展起来的 它利用一系列单个随机引物 通常为10个核苷酸 对所研究的基因组DNA进行PCR扩增 引物与基因组DNA某一区段互补时 就与其结合 就可对引物下游DNA进行合成 即扩增 75 1 RAPD的基本概念和原理 RAPD的引物 1 为随机引物 2 序列较短 通常为10个核苷酸 3 为一个寡核苷酸单链引物 76 0 2kb 0 5kb 0 3kb 0 2kb 0 5kb 0 3kb 0 2kb 0 3kb 0 5kb 品系1品系2 77 2 RAPD的基本实验程序 1 DNA的提取 1 碱法 2 CTAB法 3 SDS法2 模板DNA浓度和质量的检测3 PCR扩增4 电泳检测 PCR结束后每个样品加4ul凝胶上样缓冲液 每个泳道点样20ul 5 凝胶观察 拍照 6 统计分析 记录条带清晰的RAPD条带 计算带纹相似率 计算DNA片段大小等 78 3 RAPD结果 79 4 RAPD的优点 优点 1 不需DNA探针 设计引物不需知道序列信息 覆盖整个基因组 具有广泛适用性和通用性 2 用一个引物可扩增出多片段 3 技术简单 需要样品量少 成本低 4 每个RAPD标记相当于基因组分析中的靶序列位点 简化信息的转移过程 5 可以对RFLP难以分析的基因组区域做出遗传连锁图 6 分析自动化 80 5 RAPD的缺点 缺点 1 显性标记 无法区别显性纯合体和杂合体 2 对反应条件敏感 重复性差包括模板浓度 Mg2 浓度 PCR反应中条件的变化等 3 存在共迁移问题不同个体相同分子量的片段不一定同源 一条带可能包含不同的产物 81 三 RFLP标记 RFLP 限制性片段长度多态性restrictionfragmentlengthpolymorphismRFLP指应用特定的核酸内切酶切割有关的DNA分子所产生的DNA片段在长度上的变化 82 1 RFLP原理 生物能快速 精确地复制自身的DNA 但这种精确性是相对的实际上 在植物的自然群体中存在大量的DNA序列变异 如 碱基对的代换 缺失等几乎不可能有两个生物体DNA的碱基序列是相同的 限制性内切酶酶解DNA长链 是识别DNA上的特异的位点并在这些位点上切断的过程酶识别位点碱基对越少 DNA分子中被识别的位点越多 所产生的限制片段越短 83 来自一个完整的纯合子的个体的每一种同源DNA分子 都会在同样的位点被准确切割但是在不同物种 不同品种 甚至同一品种的不同的两个个体之间 DNA会发生变异其中有些变异导致了限制性酶切位点的更动 从而产生了限制片段长度的多态性 84 用限制性酶来酶解植物核DNA会产生数万个片段 其大小变化是连续的如进行电泳分离 只能看到弥散状的连成一片的电泳结果然而 各限制片段在凝胶中还是分开的 但不能分辨进行Southern印迹转移操作 用特定的探针与滤膜上的DNA杂交 经过放射自显影就能检测到高等植物核DNA的RFLP 85 0 1kb 0 2kb 0 4kb 0 5kb 0 3kb 0 4kb 0 5kb 1 2 0 2kb 0 3kb 0 5kb 品系1品系2 0 4kb 0 1kb 86 2 RFLP的方法与步骤 1 DNA的分离 可用CTAB法或SDS法 2 酶切 一般根据基因组总DNA的复杂性选用限制酶 3 琼脂糖凝胶电泳 4 Southern印迹转移 5 DNA杂交及放射自显影 87 3 RFLP的优点 优点 1 不受性别 年龄局限 不会受表达的组织 发育阶段或外界环境的不同而受影响 2 标记座位的等位基因间是共显性的 通过杂交后电泳带型可直接区别杂合子和显性纯合子 3 RFLP标记源于基因组DNA自身变异 在数量上几乎不受限制 88 4 RFLP的缺点 缺点 1 DNA需要量大 5 10 g 2 所需一起较多 3 技术较为复杂 4 大多数RFLP表现为二态性 杂合率低于50 所提供的信息量较低 5 与内切酶选用密切相关 89 四 AFLP标记 AFLP 扩增片段长度多态性amplifiedfragmentlengthpolymorphismAFLP技术是1992年由荷兰Keygene公司的科学家ZabeauMare和VosPieter发明并发展起来的一种选择扩增限制酶切片段的方法 90 1 AFLP的基本原理 植物基因组DNA经限制性内切酶消化形成相对分子量大小不等的随机限制性酶切片段随后将特定的接头连接在这些DNA片段两端 接头序列和邻近限制性酶切位点作为引物进行PCR扩增最后通过PAGE分离扩增的特异限制性片段在不需要DNA序列的情况下 利用一套特定引物可在一次单个反应中检测到大量的片段 91 AFLP引物是一种人工合成的单链寡核苷酸 一般长度为18 20个核苷酸 引物主要由3部分组成 1 核心序列 CORE 该序列与人工接头互补 2 限制性内切酶识别特异序列 ENZ 3 选择性延伸序列 EXT 即引物3端的选择碱基 选择碱基延伸到酶切片段区 如 EcoRI引物和MseI引物 CORE ENZ EXT EcoRI5 GACTGCGTACCAATTCNNN 3 MseI5 GATGAGTCCTGAGTAANNN 3 92 2 AFLP的优缺点 优点 1 少量引物可获得较多标记 50 150条带 2 多为显性标记或共显性标记 受环境影响小 无复等位效应 3 带型清晰 具高分别率 4 由于用两种引物经两步选择扩增 带型稳定 带纹丰富 灵敏度高 重复性好 5 不需事先知道DNA序列信息缺点 操作复杂 费用较高 93 五 SSR标记 SSR 简单重复序列多态性 也叫微卫星标记simplesequencerepeat微卫星 即短串联重复 ShortTandemRepeat STR 它是由2 6bp重复单位构成的DNA序列 通常多态性片段长度在100 300bp以人类基因组为例 平均每15 20kb就存在1个STR座位 据此估计整个人类基因组中大约有50 000 100 000个STR位点 由于微卫星DNA具有高度的多态性和遗传稳定性 所以非常适合作为遗传学DNA分子标记 94 六 ISSR标记 ISSRinter simplesequencerepeat是Zietkeiwitcz等于1994年发展起来的一种微卫星基础上的分子标记 95 其基本原理是用锚定的微卫星DNA为引物 即在SSR序列的3 端或5 端加上2 4个随机核昔酸在PCR反应中 锚定引物可引起特定位点退火 导致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间DNA片段进行PCR扩增所扩增的interSSR区域的多个条带通过聚丙烯酞胺凝胶电泳得以分辨 扩增谱带多为显性表现 96 ISSR的优点 ISSR引物的开发不像SSR引物那样需测序获得SSR两侧的单拷贝序列 开发费用降低与SSR标记相比 ISSR引物可以在不同的物种间通用 不像SSR标记一样具有较强的种特异性与RAPD和RFLP相比 ISSR揭示的多态性较高 可获得几倍于RAPD的信息量 精确度几乎可与RFLP相媲美 检测非常方便 因而是一种非常有发展前途的分子标记ISSR标记已广泛应用于植物品种鉴定 遗传作图 基因定位 遗传多样性 进化及分子生态学研究中 97 第六节实时定量PCR 第八章PCR技术及其应用 98 荧光定量PCR real timeP