第六章 外源基因在大肠杆菌中的表达.pdf

生物技术专业核心课程生物技术专业核心课程 基 因 工 程基 因 工 程 华东理工大学张惠展华东理工大学张惠展 基因工程 5 2 3 4 1 6 7 8 9 重组DNA技术与基因工程的基本概念重组DNA技术与基因工程的基本概念 重组DNA技术与基因工程的基本原理重组DNA技术与基因工程的基本原理 重组DNA技术所需的基本条件重组DNA技术所需的基本条件 重组DNA技术的操作过程重组DNA技术的操作过程 目的基因的克隆与基因文库的构建目的基因的克隆与基因文库的构建 外源基因在大肠杆菌中的表达外源基因在大肠杆菌中的表达 外源基因在酵母菌中的表达外源基因在酵母菌中的表达 外源基因在哺乳动物细胞中的表达外源基因在哺乳动物细胞中的表达 外源基因表达产物的分离纯化外源基因表达产物的分离纯化 D 基因工程菌的遗传不稳定性及其对策D 基因工程菌的遗传不稳定性及其对策 6外源基因在大肠杆菌中的表达6外源基因在大肠杆菌中的表达 C 大肠杆菌基因工程菌的构建策略C 大肠杆菌基因工程菌的构建策略 B 外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理B 外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理 A 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征A 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征 E 利用重组大肠杆菌生产人胰岛素E 利用重组大肠杆菌生产人胰岛素 A 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征A 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征 6外源基因在大肠杆菌中的表达6外源基因在大肠杆菌中的表达 大肠杆菌表达外源基因的优势大肠杆菌表达外源基因的优势 全基因组测序 共有4405个开放型阅读框架全基因组测序 共有4405个开放型阅读框架 基因克隆表达系统成熟完善基因克隆表达系统成熟完善 繁殖迅速 培养简单 操作方便 遗传稳定繁殖迅速 培养简单 操作方便 遗传稳定 被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物 A 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征A 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征 6外源基因在大肠杆菌中的表达6外源基因在大肠杆菌中的表达 大肠杆菌表达外源基因的劣势大肠杆菌表达外源基因的劣势 缺乏对真核生物蛋白质的复性功能缺乏对真核生物蛋白质的复性功能 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统 内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白 细胞周质内含有种类繁多的内毒素细胞周质内含有种类繁多的内毒素 B 外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理B 外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理 6外源基因在大肠杆菌中的表达6外源基因在大肠杆菌中的表达 启动子启动子 终止子终止子 核糖体结合位点核糖体结合位点 密码子密码子 质粒拷贝数质粒拷贝数 启动子启动子 启动子最佳距离的探测启动子最佳距离的探测 目的基因目的基因 E E E E A A E E E E 启动子启动子 A 酶切开A 酶切开 Bal31酶解Bal31酶解 目的基因目的基因 启动子启动子 启动子的筛选启动子的筛选 AprApr oriori galKgalKpKO1pKO1 终止密码子终止密码子采用鸟枪法战略 将合适大小的DNA片段 采用鸟枪法战略 将合适大小的DNA片段 克隆到启动子探针质粒pKO1上克隆到启动子探针质粒pKO1上 受体细胞染色体DNA上的galE galT与质受体细胞染色体DNA上的galE galT与质 粒上报告基因galk的表达产物联合作用 粒上报告基因galk的表达产物联合作用 可将培养基中的半乳糖酵解成红色素物质可将培养基中的半乳糖酵解成红色素物质 转化galE galT galK 的大肠杆菌受体菌株转化galE galT galK 的大肠杆菌受体菌株 含有外源启动子活性的重组克隆含有外源启动子活性的重组克隆 启动子启动子 启动子的构建启动子的构建 35 区序列 35 区序列 10 区序列 10 区序列 P LP L PrecAPrecA PtrpPtrp PlacPlac PtraAPtraA PtacPtac 启动子启动子 T T G A C AT T G A C AG A T A C TG A T A C T T T G A T AT T G A T AT A T A A TT A T A A T T T G A C AT T G A C AT T A A C TT T A A C T T A G A C AT A G A C AT A A T G TT A A T G T T T T A C AT T T A C AT A T A A TT A T A A T T T G A C AT T G A C AT A T A A TT A T A A T Ptac 3 Ptrp 11 PlacPtac 3 Ptrp 11 Plac 启动子启动子 启动子的可控性启动子的可控性 P P 乳糖启动子Plac的可控性 乳糖启动子Plac的可控性 OO P P OO 高效转录高效转录 阻遏蛋白阻遏蛋白 诱导诱导 乳糖 异丙基 D 硫 代半乳糖苷 IPTG 乳糖 异丙基 D 硫 代半乳糖苷 IPTG 野生型的Plac与其控制区Olac野生型的Plac与其控制区Olac 偶联在一起 在没有诱导物偶联在一起 在没有诱导物 存在时 整个操纵子处于基存在时 整个操纵子处于基 基底水平转录基底水平转录 底水平表达 诱导物可以使底水平表达 诱导物可以使 启动子Plac介导的转录大幅启动子Plac介导的转录大幅 提高提高 启动子启动子 启动子的可控性启动子的可控性 PlacPlac 乳糖启动子Plac的可控性 乳糖启动子Plac的可控性 OO PlacPlacOO 高效转录高效转录 葡萄糖代谢葡萄糖代谢 野生型的Plac上游附近拥有野生型的Plac上游附近拥有 代谢激活因子 CAP 结合代谢激活因子 CAP 结合 区 cAMP激活CAP CAP区 cAMP激活CAP CAP 基底水平转录基底水平转录 结合启动子控制区 进而促结合启动子控制区 进而促 进Plac介导的转录 葡萄糖进Plac介导的转录 葡萄糖 代谢使cAMP减少 也能阻代谢使cAMP减少 也能阻 遏Plac介导的转录 因此 遏Plac介导的转录 因此 基因工程中使用的乳糖启动基因工程中使用的乳糖启动 子均为抗葡萄糖代谢阻遏的子均为抗葡萄糖代谢阻遏的 突变型 即Plac UV5突变型 即Plac UV5 CAPCAP cAMPcAMP cAMP浓度降低cAMP浓度降低 Plac UV5Plac UV5OO 高效转录高效转录 启动子启动子 启动子的可控性启动子的可控性 PtrpPtrp 色氨酸启动子Ptrp的可控性 色氨酸启动子Ptrp的可控性 OtrpOtrp 除去色氨酸除去色氨酸 色氨酸启动子Ptrp受色氨酸 阻遏色氨酸启动子Ptrp受色氨酸 阻遏 蛋白复合物的阻遏 转录呈基底蛋白复合物的阻遏 转录呈基底 状态 在培养系统中去除色氨酸状态 在培养系统中去除色氨酸 基底水平转录基底水平转录 或者加入3 吲哚丙烯酸 IAA 或者加入3 吲哚丙烯酸 IAA 便可有效地解除阻遏抑制作用 便可有效地解除阻遏抑制作用 在正常的细菌培养体系中 除去在正常的细菌培养体系中 除去 色氨酸是困难的 因此基因工程色氨酸是困难的 因此基因工程 中往往添加IAA诱导Ptrp介导的目中往往添加IAA诱导Ptrp介导的目 基因的表达基因的表达 色氨酸色氨酸 或加3 吲哚丙烯酸或加3 吲哚丙烯酸 高效转录高效转录 阻遏蛋白阻遏蛋白 IAA IAA OtrpOtrpPtrpPtrp 高效转录高效转录 OtrpOtrpPtrpPtrp 启动子启动子 启动子的可控性启动子的可控性 噬菌体启动子P L的可控性 噬菌体启动子P L的可控性 噬菌体启动子PL受CI阻遏蛋白阻噬菌体启动子PL受CI阻遏蛋白阻 遏 很难直接诱导控制 在基因遏 很难直接诱导控制 在基因 工程中常使用温度敏感型的cI突工程中常使用温度敏感型的cI突 变基因cI857控制PL cI857阻遏蛋变基因cI857控制PL cI857阻遏蛋 在42 时失活脱落 PL便可介导在42 时失活脱落 PL便可介导 目的基因的表达 但在大型细菌目的基因的表达 但在大型细菌 培养罐中迅速升温非常困难 因培养罐中迅速升温非常困难 因 此常使用一个双质粒控制系统 此常使用一个双质粒控制系统 用色氨酸间接控制目的基因表达用色氨酸间接控制目的基因表达 PtrpPtrp A A B B cI857cI857 PLPL 目的基因目的基因 阻遏作用阻遏作用 PtrpPtrp A A B B PLPL 表达表达色氨酸色氨酸 终止子终止子 强化转录终止的必要性强化转录终止的必要性 外源基因在强启动子的控制下表达 容易发生转录过头现象 即RNA聚合酶滑 过终止子结构继续转录质粒上邻近的DNA序列 形成长短不一的mRNA混合物 过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达 其原因如下 转录产物越长 RNA聚合酶转录一分子mRNA所需的时间就相应增加 外源基因 本身的转录效率下降 如果外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因或DNA功能区域 如选择性标 记基因和复制子结构等 则RNA聚合酶在此处的转录可能干扰质粒的复制及其它生 物功能 甚至导致重组质粒的不稳定性 过长的mRNA往往会产生大量无用的蛋白质 增加工程菌无谓的能量消耗 更为严重的是 过长的转录物往往不能形成理想的二级结构 从而大大降低外源 基因编码产物的翻译效率 外源基因在强启动子的控制下表达 容易发生转录过头现象 即RNA聚合酶滑 过终止子结构继续转录质粒上邻近的DNA序列 形成长短不一的mRNA混合物 过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达 其原因如下 转录产物越长 RNA聚合酶转录一分子mRNA所需的时间就相应增加 外源基因 本身的转录效率下降 如果外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因或DNA功能区域 如选择性标 记基因和复制子结构等 则RNA聚合酶在此处的转录可能干扰质粒的复制及其它生 物功能 甚至导致重组质粒的不稳定性 过长的mRNA往往会产生大量无用的蛋白质 增加工程菌无谓的能量消耗 更为严重的是 过长的转录物往往不能形成理想的二级结构 从而大大降低外源 基因编码产物的翻译效率 终止子终止子 强终止子的选择与使用强终止子的选择与使用 目前外源基因表达质粒中常用的终 止子是来自大肠杆菌rRNA操纵子上的 rrnT1T2以及T7噬菌体DNA上的T 对 于一些终止作用较弱的终止子 通常 可以采用二聚体终止子串联的特殊结 构 以增强其转录终止作用 终止子也可以象启动子那样 通过 特殊的探针质粒从细菌或噬菌体基因 组DNA中克隆筛选 目前外源基因表达质粒中常用的终 止子是来自大肠杆菌rRNA操纵子上的 rrnT1T2以及T7噬菌体DNA上的T 对 于一些终止作用较弱的终止子 通常 可以采用二聚体终止子串联的特殊结 构 以增强其转录终止作用 终止子也可以象启动子那样 通过 特殊的探针质粒从细菌或噬菌体基因 组DNA中克隆筛选 pCP1pCP1 AprApr oriori TcrTcr 筛选Apr Tcs的转化子筛选Apr Tcs的转化子 核糖体结合位点核糖体结合位点 外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的 频率 而且在很大程度上还与mRNA的翻译起始效率密切相关 大 肠杆菌细胞中结构不同的mRNA分子具有不同的翻译效率 它们之 间的差别有时可高达数百倍 mRNA翻译的起始效率主要由其5 端 的结构序列所决定 称为核糖体结合位点 RBS 外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的 频率 而且在很大程度上还与mRNA的翻译起始效率密切相关 大 肠杆菌细胞中结构不同的mRNA分子具有不同的翻译效率 它们之 间的差别有时可高达数百倍 mRNA翻译的起始效率主要由其5 端 的结构序列所决定 称为核糖体结合位点 RBS 核糖体结合位点核糖体结合位点 大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构要素 位于翻译起始密码子上游的6 8个核苷酸序列5 UAAGGAGG 3 即 Shine Dalgarno SD 序列 它通过识别大肠杆菌核糖体小亚基中 的16S rRNA 3 端区域3 AUUCCUCC 5 并与之专一性结合 将 mRNA定位于核糖体上 从而启动翻译 翻译起始密码子 大肠杆菌绝大部分基因以AUG作为阅读框架的起 始位点 但有些基因也使用GUG或UUG作为翻译起始密码子 SD序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成 基因编码区5 端若干密码子的碱基序列 大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构要素 位于翻译起始密码子上游的6 8个核苷酸序列5 UAAGGAGG 3 即 Shine Dalgarno SD 序列 它通过识别大肠杆菌核糖体小亚基中 的16S rRNA 3 端区域3 AUUCCUCC 5 并与之专一性结合 将 mRNA定位于核糖体上 从而启动翻译 翻译起始密码子 大肠杆菌绝大部分基因以AUG作为阅读框架的起 始位点 但有些基因也使用GUG或UUG作为翻译起始密码子 SD序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成 基因编码区5 端若干密码子的碱基序列 核糖体结合位点的结构核糖体结合位点的结构 核糖体结合位点核糖体结合位点 核糖体结合位点对外源基因表达的影响核糖体结合位点对外源基因表达的影响 SD序列的影响 SD序列的影响 一般来说 mRNA与核糖体的结合程度越强 翻译的起始效 率就越高 而这种结合程度主要取决于SD序列与16S rRNA的碱 基互补性 其中以GGAG四个碱基序列尤为重要 对多数基因而 言 上述四个碱基中任何一个换成C或T 均会导致翻译效率大幅 度降低 一般来说 mRNA与核糖体的结合程度越强 翻译的起始效 率就越高 而这种结合程度主要取决于SD序列与16S rRNA的碱 基互补性 其中以GGAG四个碱基序列尤为重要 对多数基因而 言 上述四个碱基中任何一个换成C或T 均会导致翻译效率大幅 度降低 核糖体结合位点核糖体结合位点 核糖体结合位点对外源基因表达的影响核糖体结合位点对外源基因表达的影响 SD序列与起始密码子之间的序列的影响 SD序列与起始密码子之间的序列的影响 SD序列下游的碱基若为AAAA或UUUU 翻译效率最高 而 CCCC或GGGG的翻译效率则分别是最高值的50 和25 紧邻 AUG的前三个碱基成份对翻译起始也有影响 对于大肠杆菌 半 乳糖苷酶的mRNA而言 在这个位置上最佳的碱基组合是UAU或 CUU 如果用UUC UCA或AGG取代之 则酶的表达水平低20 倍 SD序列下游的碱基若为AAAA或UUUU 翻译效率最高 而 CCCC或GGGG的翻译效率则分别是最高值的50 和25 紧邻 AUG的前三个碱基成份对翻译起始也有影响 对于大肠杆菌 半 乳糖苷酶的mRNA而言 在这个位置上最佳的碱基组合是UAU或 CUU 如果用UUC UCA或AGG取代之 则酶的表达水平低20 倍 核糖体结合位点核糖体结合位点 核糖体结合位点对外源基因表达的影响核糖体结合位点对外源基因表达的影响 SD序列与起始密码子之间的距离的影响 SD序列与起始密码子之间的距离的影响 SD序列与起始密码子之间的精确距离保证了mRNA在核糖体 上定位后 翻译起始密码子AUG正好处于核糖体复合物结构中的P 位 这是翻译启动的前提条件 在很多情况下 SD序列位于AUG 之前大约七个碱基处 在此间隔中少一个碱基或多一个碱基 均 会导致翻译起始效率不同程度的降低 SD序列与起始密码子之间的精确距离保证了mRNA在核糖体 上定位后 翻译起始密码子AUG正好处于核糖体复合物结构中的P 位 这是翻译启动的前提条件 在很多情况下 SD序列位于AUG 之前大约七个碱基处 在此间隔中少一个碱基或多一个碱基 均 会导致翻译起始效率不同程度的降低 核糖体结合位点核糖体结合位点 核糖体结合位点对外源基因表达的影响核糖体结合位点对外源基因表达的影响 起始密码子及其后续若干密码子的影响 起始密码子及其后续若干密码子的影响 大肠杆菌中的起始tRNA分子可以同时识别AUG GUG和UUG 三种起始密码子 但其识别频率并不相同 通常GUG为AUG的50 而UUG只及AUG的25 除此之外 从AUG开始的前几个密码子碱 基序列也至关重要 至少这一序列不能与mRNA的5 端非编码区形 成茎环结构 否则便会严重干扰mRNA在核糖体上的准确定位 目前广泛用于外源基因表达的大肠杆菌表达型质粒上 均含有 与启动子来源相同的核糖体结合位点序列 序列和间隔是最佳的 大肠杆菌中的起始tRNA分子可以同时识别AUG GUG和UUG 三种起始密码子 但其识别频率并不相同 通常GUG为AUG的50 而UUG只及AUG的25 除此之外 从AUG开始的前几个密码子碱 基序列也至关重要 至少这一序列不能与mRNA的5 端非编码区形 成茎环结构 否则便会严重干扰mRNA在核糖体上的准确定位 目前广泛用于外源基因表达的大肠杆菌表达型质粒上 均含有 与启动子来源相同的核糖体结合位点序列 序列和间隔是最佳的 密码子密码子 生物体对密码子的偏爱性生物体对密码子的偏爱性 不同的生物 甚至同种生物不同的蛋白质编码基因 对简并密码不同的生物 甚至同种生物不同的蛋白质编码基因 对简并密码 子使用频率并不相同 具有一定的偏爱性 其决定因素是 子使用频率并不相同 具有一定的偏爱性 其决定因素是 生物基因组中的碱基含量在富含AT的生物 如单链DNA噬菌体生物基因组中的碱基含量在富含AT的生物 如单链DNA噬菌体 X174 基因组中 密码子第三位上的U和A出现的频率较高 而在GC X174 基因组中 密码子第三位上的U和A出现的频率较高 而在GC 丰富的生物 如链霉菌 基因组中 第三位上含有G或C的简并密码子丰富的生物 如链霉菌 基因组中 第三位上含有G或C的简并密码子 占90 以上的绝对优势占90 以上的绝对优势 密码子与反密码子相互作用的自由能性中等强度规律密码子与反密码子相互作用的自由能性中等强度规律 细胞内tRNA的含量细胞内tRNA的含量 如GGG CCC GCG GGC AAA UUU AUA UAU等使用少 如GGG CCC GCG GGC AAA UUU AUA UAU等使用少 如GUG CAC UCG AGC ACA UGU AUC UUG等使用多 如GUG CAC UCG AGC ACA UGU AUC UUG等使用多 密码子密码子 密码子偏爱性对外源基因表达的影响密码子偏爱性对外源基因表达的影响 由于原核生物和真核生物基因组中密码子的使用频率具有较大程由于原核生物和真核生物基因组中密码子的使用频率具有较大程 大的差异性 因此外源基因尤其是高等哺乳动物基因在大肠杆菌中高大的差异性 因此外源基因尤其是高等哺乳动物基因在大肠杆菌中高 效翻译的一个重要因素是密码子的正确选择 一般而言 有两种策略效翻译的一个重要因素是密码子的正确选择 一般而言 有两种策略 可以使外源基因上的密码子在大肠杆菌细胞中获得最佳表达 可以使外源基因上的密码子在大肠杆菌细胞中获得最佳表达 外源基因全合成外源基因全合成 同步表达相关tRNA编码基因同步表达相关tRNA编码基因 密码子密码子 密码子偏爱性对外源基因表达的影响密码子偏爱性对外源基因表达的影响 按照大肠杆菌密码子的偏爱性规律 设计更换外源基因中不适 宜的相应简并密码子 重组人胰岛素 干扰素以及生长激素在 大肠杆菌中的高效表达均采用了这种方法 按照大肠杆菌密码子的偏爱性规律 设计更换外源基因中不适 宜的相应简并密码子 重组人胰岛素 干扰素以及生长激素在 大肠杆菌中的高效表达均采用了这种方法 外源基因全合成外源基因全合成 密码子密码子 密码子偏爱性对外源基因表达的影响密码子偏爱性对外源基因表达的影响 对于那些含有不和谐密码子种类单一 出现频率较高 而本身分 子量又较大的外源基因而言 则选择相关tRNA编码基因同步克隆表达 的策略较为有利 例如 在人尿激酶原cDNA的412个密码子中 共含 有22个精氨酸密码子 其中7个AGG 2个AGA 而大肠杆菌受体细胞 中tRNAAGG和tRNAAGA的丰度较低 为了提高人尿激酶原cDNA在大肠 杆菌中的高效表达 将大肠杆菌的这两个tRNA编码基因克隆在另一个 高表达的质粒上 由此构建的大肠杆菌双质粒系统有效地解除了受体 细胞对外源基因高效表达的制约作用 对于那些含有不和谐密码子种类单一 出现频率较高 而本身分 子量又较大的外源基因而言 则选择相关tRNA编码基因同步克隆表达 的策略较为有利 例如 在人尿激酶原cDNA的412个密码子中 共含 有22个精氨酸密码子 其中7个AGG 2个AGA 而大肠杆菌受体细胞 中tRNAAGG和tRNAAGA的丰度较低 为了提高人尿激酶原cDNA在大肠 杆菌中的高效表达 将大肠杆菌的这两个tRNA编码基因克隆在另一个 高表达的质粒上 由此构建的大肠杆菌双质粒系统有效地解除了受体 细胞对外源基因高效表达的制约作用 同步表达相关tRNA编码基因同步表达相关tRNA编码基因 质粒拷贝数质粒拷贝数 质粒拷贝数对细菌生长代谢的影响质粒拷贝数对细菌生长代谢的影响 目前实验室里广泛使用的表达型质粒在每个大肠杆菌细胞中可达 数百甚至上千个拷贝 质粒的扩增过程通常发生在受体细胞的对数生 长期内 而此时正是细菌生理代谢最旺盛的阶段 质粒分子的过度增 殖以及其后目的基因的高效表达势必会影响受体细胞的生长代谢 进 而导致重组质粒的不稳定性以及目的基因宏观表达水平的下降 解决上述难题的一种有效策略是将重组质粒的扩增纳入可控制的 轨道 目前实验室里广泛使用的表达型质粒在每个大肠杆菌细胞中可达 数百甚至上千个拷贝 质粒的扩增过程通常发生在受体细胞的对数生 长期内 而此时正是细菌生理代谢最旺盛的阶段 质粒分子的过度增 殖以及其后目的基因的高效表达势必会影响受体细胞的生长代谢 进 而导致重组质粒的不稳定性以及目的基因宏观表达水平的下降 解决上述难题的一种有效策略是将重组质粒的扩增纳入可控制的 轨道 质粒拷贝数质粒拷贝数 质粒扩增时序的控制质粒扩增时序的控制 pCP3拥有一个温度可诱导型的复制子pCP3拥有一个温度可诱导型的复制子 pCP3pCP3 PLPL MCSMCS orioriAprApr 在28 时 每个细胞的质粒拷贝数为60在28 时 每个细胞的质粒拷贝数为60 在42 时 拷贝数迅速增至300 600在42 时 拷贝数迅速增至300 600 在此温度下 受体细胞染色体上的CI基在此温度下 受体细胞染色体上的CI基 因表达的温度敏感型阻遏蛋白失活因表达的温度敏感型阻遏蛋白失活 因此 用一种手段同时控制质粒拷因此 用一种手段同时控制质粒拷 贝数和基因的表达贝数和基因的表达 C 大肠杆菌基因工程菌的构建策略C 大肠杆菌基因工程菌的构建策略 6外源基因在大肠杆菌中的表达6外源基因在大肠杆菌中的表达 包涵体型异源蛋白的表达包涵体型异源蛋白的表达 分泌型异源蛋白的表达分泌型异源蛋白的表达 融合型异源蛋白的表达融合型异源蛋白的表达 寡聚型异源蛋白的表达寡聚型异源蛋白的表达 整合型异源蛋白的表达整合型异源蛋白的表达 蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建 包涵体型异源蛋白的表达包涵体型异源蛋白的表达 包涵体及其性质包涵体及其性质 在某些生长条件下 大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子 它 们致密地集聚在细胞内 或被膜包裹或形成无膜裸露结构 这种水不 溶性的结构称为包涵体 Inclusion Bodies IB 富含蛋白质的包涵 体多见于生长在含有氨基酸类似物培养基的大肠杆菌细胞中 由这些 氨基酸类似物所合成的蛋白质往往会丧失其理化特性和生物功能 从 而集聚形成包涵体 由高效表达质粒构建的大肠杆菌工程菌大量合成 非天然性的同源或异源蛋白质 后者在一般情况下也以包涵体的形式 存在于细菌细胞内 除此之外 包涵体中还含有少量的DNA RNA和 脂多糖等非蛋白分子 在某些生长条件下 大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子 它 们致密地集聚在细胞内 或被膜包裹或形成无膜裸露结构 这种水不 溶性的结构称为包涵体 Inclusion Bodies IB 富含蛋白质的包涵 体多见于生长在含有氨基酸类似物培养基的大肠杆菌细胞中 由这些 氨基酸类似物所合成的蛋白质往往会丧失其理化特性和生物功能 从 而集聚形成包涵体 由高效表达质粒构建的大肠杆菌工程菌大量合成 非天然性的同源或异源蛋白质 后者在一般情况下也以包涵体的形式 存在于细菌细胞内 除此之外 包涵体中还含有少量的DNA RNA和 脂多糖等非蛋白分子 包涵体型异源蛋白的表达包涵体型异源蛋白的表达 以包涵体形式表达目的蛋白的优缺点以包涵体形式表达目的蛋白的优缺点 能简化外源基因表达产物的分离操作能简化外源基因表达产物的分离操作 包涵体表达形式的优点 包涵体表达形式的优点 包涵体的水难溶性及其密度远大于其它细胞碎片和细胞成分 菌体 经超声波裂解后 直接通过高速离心即可将重组异源蛋白从细菌裂 解物中分离出来 包涵体的水难溶性及其密度远大于其它细胞碎片和细胞成分 菌体 经超声波裂解后 直接通过高速离心即可将重组异源蛋白从细菌裂 解物中分离出来 能在一定程度上保持表达产物的结构稳定能在一定程度上保持表达产物的结构稳定 在形成包涵体之后 大肠杆菌的蛋白酶降解作用基本上对异源重组 蛋白的稳定性已构不成威胁 在形成包涵体之后 大肠杆菌的蛋白酶降解作用基本上对异源重组 蛋白的稳定性已构不成威胁 包涵体型异源蛋白的表达包涵体型异源蛋白的表达 以包涵体形式表达目的蛋白的优缺点以包涵体形式表达目的蛋白的优缺点 包涵体表达形式的缺点 包涵体表达形式的缺点 以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性 必须通 过有效的变性复性操作 才能回收得到具有正确空间构象 因而具 有生物活性 的目标蛋白 因此包涵体变复性操作的效率对目标产 物的收率至关重要 然而 这也是一个技术难题 尤其当目标蛋白 分子中的Cys残基数目较高时 体外复性蛋白质的成功率相当低 一般不超过30 以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性 必须通 过有效的变性复性操作 才能回收得到具有正确空间构象 因而具 有生物活性 的目标蛋白 因此包涵体变复性操作的效率对目标产 物的收率至关重要 然而 这也是一个技术难题 尤其当目标蛋白 分子中的Cys残基数目较高时 体外复性蛋白质的成功率相当低 一般不超过30 包涵体型异源蛋白的表达包涵体型异源蛋白的表达 以包涵体形式表达目的蛋白的操作以包涵体形式表达目的蛋白的操作 如果未进行特殊设计 如分泌型表达或融合型表达 外源基 因在大肠杆菌中表达的蛋白量占细胞总蛋白量20 以上时 表达产 物一般倾向于形成包涵体 因此 以包涵体形式表达目的基因操作 的关键就是选择高表达的载体 事实上 这种高表达率也是包涵体 法的长处所在 如果未进行特殊设计 如分泌型表达或融合型表达 外源基 因在大肠杆菌中表达的蛋白量占细胞总蛋白量20 以上时 表达产 物一般倾向于形成包涵体 因此 以包涵体形式表达目的基因操作 的关键就是选择高表达的载体 事实上 这种高表达率也是包涵体 法的长处所在 包涵体型异源蛋白的表达包涵体型异源蛋白的表达 包涵体的变性与复性操作包涵体的变性与复性操作 C共价修饰的蛋白质C共价修饰的蛋白质 蛋白质变性复性的动力学原理 蛋白质变性复性的动力学原理 C1C1C2C2CnCnCC UUI 1I 1I nI nNN X1X1X2X2XnXn X X AgAgAgAgAgAgAgAg I有效变复性过程中的中间状态I有效变复性过程中的中间状态 X脱离有效变复性过程而进入集聚的中间状态X脱离有效变复性过程而进入集聚的中间状态 N天然状态的蛋白质N天然状态的蛋白质 U变性状态的蛋白质U变性状态的蛋白质 A 集聚状态的蛋白质A 集聚状态的蛋白质 在细菌细胞内 集聚状态和共价修饰的蛋白质不能进入复性过程 因此永远成为在细菌细胞内 集聚状态和共价修饰的蛋白质不能进入复性过程 因此永远成为 无活性的蛋白质 包涵体中的蛋白质就属于这两种状态 因此需要在体外进行人无活性的蛋白质 包涵体中的蛋白质就属于这两种状态 因此需要在体外进行人 工变性 解除共价修饰和驱散集聚体 复性操作工变性 解除共价修饰和驱散集聚体 复性操作 包涵体型异源蛋白的表达包涵体型异源蛋白的表达 包涵体的变性与复性操作包涵体的变性与复性操作 包涵体的溶解与变性 包涵体的溶解与变性 包涵体的溶解与变性的主要任务是拆开错配的二硫键和次级键包涵体的溶解与变性的主要任务是拆开错配的二硫键和次级键 在人工条件下 使包涵体溶解并重新进入复性途径中 能有效促进在人工条件下 使包涵体溶解并重新进入复性途径中 能有效促进 包涵体溶解变性的试剂和条件包括 包涵体溶解变性的试剂和条件包括 清洗剂SDS 正十二醇肌氨酸 廉价 但影响复性和纯化清洗剂SDS 正十二醇肌氨酸 廉价 但影响复性和纯化 促溶剂盐酸胍 尿素 前者昂贵 尿素便宜 但常被自发促溶剂盐酸胍 尿素 前者昂贵 尿素便宜 但常被自发 形成的氰酸盐污染 后者能与多肽链中的氨基反应形成的氰酸盐污染 后者能与多肽链中的氨基反应 混合溶剂如尿素与醋酸 二甲基砜等联合使用 溶解力增强混合溶剂如尿素与醋酸 二甲基砜等联合使用 溶解力增强 极端pH 廉价 但许多蛋白质在极端pH条件下发生修饰反应极端pH 廉价 但许多蛋白质在极端pH条件下发生修饰反应 包涵体型异源蛋白的表达包涵体型异源蛋白的表达 包涵体的变性与复性操作包涵体的变性与复性操作 包涵体的复性与重折叠 refolding 包涵体的复性与重折叠 refolding 包涵体的复性与重折叠的主要任务是 包涵体的复性与重折叠的主要任务是 通过次级键的形成使蛋白质复性通过次级键的形成使蛋白质复性 将多肽链中被拆开的游离巯基重新折叠将多肽链中被拆开的游离巯基重新折叠 包涵体型异源蛋白的表达包涵体型异源蛋白的表达 包涵体的变性与复性操作包涵体的变性与复性操作 包涵体的复性与重折叠 refolding 复性操作包涵体的复性与重折叠 refolding 复性操作 包涵体复性操作的方法包括 包涵体复性操作的方法包括 分段稀释法 逐步降低变性剂的浓度 防止二次集聚的发生分段稀释法 逐步降低变性剂的浓度 防止二次集聚的发生 一步稀释法 蛋白复性与浓度无关 但集聚与浓度关系很大一步稀释法 蛋白复性与浓度无关 但集聚与浓度关系很大 试剂添加法 精氨酸 甘氨酸 甘油 蔗糖 PEG Ca2 试剂添加法 精氨酸 甘氨酸 甘油 蔗糖 PEG Ca2 蛋白修饰法 氨基柠檬酸酐酰化 蛋白带负电 抑制集聚蛋白修饰法 氨基柠檬酸酐酰化 蛋白带负电 抑制集聚 产物隔离法 将变性的蛋白分子固定化 避免其相互碰撞产物隔离法 将变性的蛋白分子固定化 避免其相互碰撞 分子伴侣法 GroEL GroES DnaK 固定化 共表达分子伴侣法 GroEL GroES DnaK 固定化 共表达 包涵体型异源蛋白的表达包涵体型异源蛋白的表达 包涵体的变性与复性操作包涵体的变性与复性操作 包涵体的复性与重折叠 refolding 二硫键形成包涵体的复性与重折叠 refolding 二硫键形成 在包涵体变性体系中 始终存在着还原剂 使多肽链中的巯基保持还原状态 防在包涵体变性体系中 始终存在着还原剂 使多肽链中的巯基保持还原状态 防 化学氧化法 A 需要电子受体 最廉价的电子受体为空气 二硫键形成是化学氧化法 A 需要电子受体 最廉价的电子受体为空气 二硫键形成是 二硫键交换 B 需要还原型和氧化型谷胱甘肽 GSH和GSSG 二硫键二硫键交换 B 需要还原型和氧化型谷胱甘肽 GSH和GSSG 二硫键 止二硫键错配导致严重的集聚 在变性操作结束后 这些游离型的巯基必须重新止二硫键错配导致严重的集聚 在变性操作结束后 这些游离型的巯基必须重新 配对形成二硫键 此时多肽链也重新发生折叠 形成二硫键的方式主要有 配对形成二硫键 此时多肽链也重新发生折叠 形成二硫键的方式主要有 随机的 仅适用于那些不含游离半胱氨酸残基的蛋白质的重折叠随机的 仅适用于那些不含游离半胱氨酸残基的蛋白质的重折叠 形成相对特异 因此适用性较广 重折叠效果好形成相对特异 因此适用性较广 重折叠效果好 HSHS HSHS S S S S 2e2e 2H 2H A A HSHS HSHS S S RS S R HSHS B B R S S RR S S R S S S S 2R SH2R SH 分泌型异源蛋白的表达分泌型异源蛋白的表达 在大肠杆菌中表达的异源蛋白按其在细胞中的定位可分为两种形 式 即以可溶性或不溶性 包涵体 状态存在于细胞质中 或者通过 运输或分泌方式定位于细胞周质 甚至穿过外膜进入培养基中 蛋白 产物N端信号肽序列的存在是蛋白质分泌的前提条件 在大肠杆菌中表达的异源蛋白按其在细胞中的定位可分为两种形 式 即以可溶性或不溶性 包涵体 状态存在于细胞质中 或者通过 运输或分泌方式定位于细胞周质 甚至穿过外膜进入培养基中 蛋白 产物N端信号肽序列的存在是蛋白质分泌的前提条件 分泌型异源蛋白的表达分泌型异源蛋白的表达 以分泌形式表达目的蛋白的优缺点以分泌形式表达目的蛋白的优缺点 分泌表达形式的优点 分泌表达形式的优点 目的蛋白稳定性高重组人胰岛素原若分泌到细胞周中 其稳目的蛋白稳定性高重组人胰岛素原若分泌到细胞周中 其稳 稳定性大约是在细胞质中的10倍稳定性大约是在细胞质中的10倍 目的蛋白易于分离目的蛋白易于分离 目的蛋白末端完整相当多的真核生物成熟蛋白N端并不含有目的蛋白末端完整相当多的真核生物成熟蛋白N端并不含有 甲硫氨酸残基 当这些真核基因在大肠杆菌中表达时 蛋白质甲硫氨酸残基 当这些真核基因在大肠杆菌中表达时 蛋白质 N端的甲硫氨酸残基往往不能被切除 如若将外源基因与大肠N端的甲硫氨酸残基往往不能被切除 如若将外源基因与大肠 杆菌的信号肽编码序列重组在一起 一旦分泌型表达 其N端杆菌的信号肽编码序列重组在一起 一旦分泌型表达 其N端 的甲硫氨酸残基便可在信号肽的剪切过程中被有效除去的甲硫氨酸残基便可在信号肽的剪切过程中被有效除去 分泌型异源蛋白的表达分泌型异源蛋白的表达 以分泌形式表达目的蛋白的优缺点以分泌形式表达目的蛋白的优缺点 分泌表达形式的缺点 分泌表达形式的缺点 相对其它生物细胞而言 大肠杆菌的蛋白分泌机制并不健 全 外源真核生物基因很难在大肠杆菌中进行分泌型表达 少 数外源基因既便能分泌表达 但其表达率通常要比包涵体方式 低很多 因此目前用于产业化的异源蛋白分泌型重组大肠杆菌 尽管有 但并不普遍 相对其它生物细胞而言 大肠杆菌的蛋白分泌机制并不健 全 外源真核生物基因很难在大肠杆菌中进行分泌型表达 少 数外源基因既便能分泌表达 但其表达率通常要比包涵体方式 低很多 因此目前用于产业化的异源蛋白分泌型重组大肠杆菌 尽管有 但并不普遍 分泌型异源蛋白的表达分泌型异源蛋白的表达 蛋白质的分泌机制蛋白质的分泌机制 胞内 周质 胞外 内膜 外膜 胞壁 信号肽 信号肽剪切酶系 目标蛋白 原核细菌周质中含有多 种分子伴侣可阻止分泌 蛋白的随机折叠 分泌 在细胞周质或培养基中 的重组蛋白很少形成分 子间的二硫键交联 因 此与包涵体相比 分泌 型重组蛋白具有较高比 例的正确构象 生物活 性的回收率增加 且对 蛋白酶不敏感 原核细菌周质中含有多 种分子伴侣可阻止分泌 蛋白的随机折叠 分泌 在细胞周质或培养基中 的重组蛋白很少形成分 子间的二硫键交联 因 此与包涵体相比 分泌 型重组蛋白具有较高比 例的正确构象 生物活 性的回收率增加 且对 蛋白酶不敏感 分泌型异源蛋白的表达分泌型异源蛋白的表达 分泌型目的蛋白表达系统的构建分泌型目的蛋白表达系统的构建 包括大肠杆菌在内的绝大多数革兰氏阴性菌不能将蛋白质直接分包括大肠杆菌在内的绝大多数革兰氏阴性菌不能将蛋白质直接分 泌到胞外 但有些革兰氏阴性菌能将细菌的抗菌蛋白 细菌素 分泌泌到胞外 但有些革兰氏阴性菌能将细菌的抗菌蛋白 细菌素 分泌 到培养基中 这一过程严格依赖于细菌素释放蛋白 它激活定位于内到培养基中 这一过程严格依赖于细菌素释放蛋白 它激活定位于内 上的磷酸酯酶 导致细菌内外膜的通透性增大 上的磷酸酯酶 导致细菌内外膜的通透性增大 因此 只要将细菌素释放蛋白编码基因克隆在一个合适的质粒上因此 只要将细菌素释放蛋白编码基因克隆在一个合适的质粒上 即可构建完全分泌型的受体细胞 此时 用另一种携带大肠杆菌信号即可构建完全分泌型的受体细胞 此时 用另一种携带大肠杆菌信号 肽编码序列和目的基因的表达质粒转化上述完全分泌型受体细胞 并肽编码序列和目的基因的表达质粒转化上述完全分泌型受体细胞 并 使用相同性质的启动子介导目的基因的转录 则可实现目的蛋白从重使用相同性质的启动子介导目的基因的转录 则可实现目的蛋白从重 组大肠杆菌中的完全分泌 组大肠杆菌中的完全分泌 融合型异源蛋白的表达融合型异源蛋白的表达 除了直接表达异源蛋白外 还可将外源基因与受体菌自身的蛋白 质编码基因拼接在一起 并作为一个开放型阅读框架进行表达 由这 种杂合基因表达出的蛋白质称为融合蛋白 在这种融合蛋白结构中 通常受体细菌的蛋白部分位于N端 异源蛋白位于C端 通过在DNA水 平上人工设计引入的蛋白酶切割位点或化学试剂特异性断裂位点 可 以在体外从纯化的融合蛋白分子中释放回收异源蛋白 除了直接表达异源蛋白外 还可将外源基因与受体菌自身的蛋白 质编码基因拼接在一起 并作为一个开放型阅读框架进行表达 由这 种杂合基因表达出的蛋白质称为融合蛋白 在这种融合蛋白结构中 通常受体细菌的蛋白部分位于N端 异源蛋白位于C端 通过在DNA水 平上人工设计引入的蛋白酶切割位点或化学试剂特异性断裂位点 可 以在体外从纯化的融合蛋白分子中释放回收异源蛋白 融合型异源蛋白的表达融合型异源蛋白的表达 以融合形式表达目的蛋白的优缺点以融合形式表达目的蛋白的优缺点 目的蛋白稳定性高尤其对分子量较小的多肽效果更佳目的蛋白稳定性高尤其对分子量较小的多肽效果更佳 目的蛋白易于分离利用受体蛋白成熟的抗体 配体 底物进目的蛋白易于分离利用受体蛋白成熟的抗体 配体 底物进 目的蛋白表达率高与受体蛋白共用一套完善的表达元件目的蛋白表达率高与受体蛋白共用一套完善的表达元件 胞内形成良好的空间构象 且大多具有水溶性胞内形成良好的空间构象 且大多具有水溶性 目的蛋白 在实际生产中 产品主要的成本往往就在该工段目的蛋白 在实际生产中 产品主要的成本往往就在该工段 行亲和层析 可以快速获得纯度较高的融合蛋白行亲和层析 可以快速获得纯度较高的融合蛋白 目的蛋白溶解性好由于受体蛋白的存在 融合蛋白往往能在目的蛋白溶解性好由于受体蛋白的存在 融合蛋白往往能在 目的蛋白需要回收融合蛋白需要裂解和进一步分离 才能获目的蛋白需要回收融合蛋白需要裂解和进一步分离 才能获 融合型异源蛋白的表达融合型异源蛋白的表达 融合型目的蛋白表达系统的构建融合型目的蛋白表达系统的构建 融合蛋白表达质粒的构建原则 融合蛋白表达质粒的构建原则 受体细胞的结构基因能高效表达 且其表达产物可以通过亲和受体细胞的结构基因能高效表达 且其表达产物可以通过亲和 层析进行特异性简单纯化层析进行特异性简单纯化 两个结构基因拼接位点处的序列设计十分重要 它直接决定着两个结构基因拼接位点处的序列设计十分重要 它直接决定着 为目的蛋白分离回收创造条件为目的蛋白分离回收创造条件 外源基因应装在受体蛋白编码基因的下游 为融合蛋白提供终外源基因应装在受体蛋白编码基因的下游 为融合蛋白提供终 止密码子 在某些情况下 并不需要完整的受体结构基因 目止密码子 在某些情况下 并不需要完整的受体结构基因 目 的是尽可能避免融合蛋白分子中两种组份的分子量过于接近 的是尽可能避免融合蛋白分子中两种组份的分子量过于接近 融合蛋白的裂解工艺融合蛋白的裂解工艺 两个蛋白编码序列应保持一致的翻译阅读框架两个蛋白编码序列应保持一致的翻译阅读框架 融合型异源蛋白的表达融合型异源蛋白的表达 融合型目的蛋白表达系统的构建融合型目的蛋白表达系统的构建 用于融合蛋白构建的受体蛋白 用于融合蛋白构建的受体蛋白 谷胱甘肽转移酶 GST 维持良好空间构象谷胱甘肽转移酶 GST 维持良好空间构象 硫氧化还原蛋白 TrxA 维持良好空间构象 pTrxFus硫氧化还原蛋白 TrxA 维持良好空间构象 pTrxFus 麦芽糖结合蛋白 MBP 促进分泌麦芽糖结合蛋白 MBP 促进分泌 金黄色葡萄球菌蛋白A SAPA 免疫亲和层析 pRIT2T金黄色葡萄球菌蛋白A SAPA 免疫亲和层析 pRIT2T 外膜蛋白 OmpF 促进分泌外膜蛋白 OmpF 促进分泌 半乳糖苷酶 LacZ 免疫亲和层析 半乳糖苷酶 LacZ 免疫亲和层析 泛素蛋白 Ubi 维持良好空间构象泛素蛋白 Ubi 维持良好空间构象 融合型异源蛋白的表达融合型异源蛋白的表达 目的蛋白的回收目的蛋白的回收 融合蛋白中受体蛋白部分的存在可能会影响目的蛋白的空 间构象和生物活性 如果将之注入人体还会导致免疫反应 因 此在制备和生产药用目的蛋白时 将融合蛋白中的受体蛋白部 分完整除去是必不可少的工序 融合蛋白的位点专一性断裂方 法有两种 化学断裂法 酶促裂解法 融合蛋白中受体蛋白部分的存在可能会影响目的蛋白的空 间构象和生物活性 如果将之注入人体还会导致免疫反应 因 此在制备和生产药用目的蛋白时 将融合蛋白中的受体蛋白部 分完整除去是必不可少的工序 融合蛋白的位点专一性断裂方 法有两种 化学断裂法 酶促裂解法 融合型异源蛋白的表达融合型异源蛋白的表达 目的蛋白的回收目的蛋白的回收 用于蛋白位点专一性化学断裂的最佳试剂为溴化氰 CNBr 它与多肽链中的甲硫氨酸残基侧链的硫醚基反应 生成溴化亚氨内 酯 后者不稳定 在水的作用下肽键断裂 形成两个多肽降解片段 其中上游肽段的甲硫氨酸残基转化为高丝氨酸残基 而下游肽段N 端的第一位氨基酸残基保持不变 这一方法的优点是回收率高 可 达到85 以上 专一性强 而且所产生的目的蛋白的N端不含甲 硫氨酸 与真核生物细胞中的成熟表达产物较为接近 然而 如果 异源蛋白分子内部含有甲硫氨酸残基 则不能用此方法 用于蛋白位点专一性化学断裂的最佳试剂为溴化氰 CNBr 它与多肽链中的甲硫氨酸残基侧链的硫醚基反应 生成溴化亚氨内 酯 后者不稳定 在水的作用下肽键断裂 形成两个多肽降解片段 其中上游肽段的甲硫氨酸残基转化为高丝氨酸残基 而下游肽段N 端的第一位氨基酸残基保持不变 这一方法的优点是回收率高 可 达到85 以上 专一性强 而且所产生的目的蛋白的N端不含甲 硫氨酸 与真核生物细胞中的成熟表达产物较为接近 然而 如果 异源蛋白分子内部含有甲硫氨酸残基 则不能用此方法 化学断裂法 化学断裂法 融合型异源蛋白的表达融合型异源蛋白的表达 目的蛋白的回收目的蛋白的回收 酶促裂解法 单残基位点酶促裂解法 单残基位点 蛋白内切酶蛋白内切酶切割位点切割位点 梭菌蛋白酶Arg C梭菌蛋白酶Arg C 葡萄球菌蛋白酶Glu C葡萄球菌蛋白酶Glu C 假单孢菌蛋白酶Lys C假单孢菌蛋白酶Lys C 猪胰蛋白酶Arg C猪胰