生化实验考试复习内容.doc

生化实验习题1 简述蛋白质的几种定量方法及其各依据的原理。2 简述透析的原理，影响透析的因素及透析的应用。透析是一种利用小分子能通过，大分子不能通过半透膜的原理把它们分开的一种重要手段。影响透析的因素主要有膜、溶剂（水溶液、大分子溶液）、物理条件（温度、压力）、董南膜平衡等。透析主要用于将大分子物质和小分子物质分开，如蛋白质的分离纯化。3 请设计一项实验，分离并鉴定某一微生物中的游离氨基酸。利用纸层析法分离鉴定该微生物中的游离氨基酸。实验所需器材包括层析缸、毛细管、喷雾器、培养皿和层析滤纸，实验所需试剂包括扩展剂、氨基酸溶液（各标准氨基酸溶液和待测氨基酸溶液）和显色液（0.1%水合茚三酮正丁醇溶液）。实验操作步骤如下一 取层析滤纸一张，在纸的一端距边缘1.5-2cm处用铅笔划一条直线，在此直线上以相同间距作出记号。二 点样 用毛细管将各氨基酸样品分别点在所作记号的位置上，待干燥后，可重复点3次。三 扩展 用线将滤纸缝成筒状，将滤纸直立于盛有扩展剂的培养皿中扩展。待溶剂上升至距滤纸上端边缘1cm时，取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿界限，自然干燥或吹风机热风吹干。四 显色 用喷雾器均匀喷上0.1%茚三酮正丁醇溶液，用热风吹干显出层析斑点。五 计算各氨基酸Rf值。滤纸上的层析斑点图即是对氨基酸分离的结果，通过比较各标准氨基酸Rf值和待测氨基酸的Rf值即可鉴别待测的游离氨基酸。4 纸层析分离氨基酸的原理是什么？5 层析技术包括哪几类？请简要介绍凝胶层析的原理。层析技术包括吸附层析、离子交换层析、分配层析、薄层层析、凝胶层析和亲和层析。凝胶层析的基本原理是用一般的柱层析方法使相对分子质量不同的溶质通过具有分子筛性质的固定相（凝胶），从而使物质分离。固定相是凝胶，各组分分子的大小不同，而在凝胶上受阻的程度不同，从而分层。大分子物质沿凝胶颗粒间隙随洗脱液移动，移动速度快，先被洗出层析柱；小分子物质可通过凝胶网孔进入颗粒内部，然后再扩散出来，流程长，移动速度慢，最后被洗出层析柱。6 简述测定氨基酸含量的原理及注意事项。甲醛滴定法注意事项：1 标准NaOH溶液应在使用前标定，并在密封瓶中保存，不可使用隔日贮存在微量滴定管中的剩余氢氧化钠。2 中性甲醛应在临用前配制，若已放置一段时间，使用前应重新中和。3 本实验为定量实验，甘氨酸和氢氧化钠的浓度要严格标定，加量要准确，全部操作案分析化学要求进行。7 常规的分离蛋白质的方法有哪些，各有什么优缺点？8 简简述测定氨基酸含量的原理及注意事项。甲醛滴定法注意事项：1 标准NaOH溶液应在使用前标定，并在密封瓶中保存，不可使用隔日贮存在微量滴定管中的剩余氢氧化钠。2 中性甲醛应在临用前配制，若已放置一段时间，使用前应重新中和。3 本实验为定量实验，甘氨酸和氢氧化钠的浓度要严格标定，加量要准确，全部操作案分析化学要求进行。9 核酸的检测方法有哪些？并简述各个方法的原理。 一 定磷法 RNA 和DNA中都含有磷酸，根据元素分析获知RNA的平均含磷量为9.4%，DNA的平均含磷量为9.9%。因此，可从样品中测得样品中的含磷量来计算RNA 或DNA的含量。用强酸将核酸样品消化，使核酸分子中的有机酸转变为无机酸，无机酸与钼酸生成磷钼酸，磷钼酸在还原剂作用下生成钼蓝。可用比色法测定样品中的含磷量。二 定糖法 RNA含有核糖，DNA含有脱氧核糖，根据这两种糖的颜色反应可对RNA 和DNA进行定性和定量测定。 RNA分子中的核糖与浓盐酸或浓硫酸作用脱水生成糠醛，糠醛与某些酚类化合物缩合而生成有色化合物。如糠醛与3,5-二羟甲苯反应生成深绿色化合物，反应产物在660nm有最大吸收，并且与RNA的浓度成正比。 DNA分子中的脱氧核糖和浓硫酸作用，脱水生成-羟基-酮基戊醛，与二苯胺反应生成蓝色化合物。反应产物在595nm有最大吸收，并且与DNA的浓度成正比。 三 紫外吸收法 核酸组分嘌呤环、嘧啶环具有紫外吸收的特性。用这种方法在测定核酸含量时，通常规定在260nm，测得样品RNA 或DNA溶液的A260值，即可计算出样品中核算含量。10 请列举出2种以上将蛋白质和小分子物质分开的方法，并对其原理进行简要说明。一 透析法 透析法是利用蛋白质大分子对半透膜的不可透过性而与其他小分子物质分开。二 超滤法 其原理是利用超滤膜在一定的压力或离心力的作用下，大分子物质被截留而小分子物质则过滤排出。三 分子排阻层析 其原理是利用蛋白质分子量的差异，通过具有分子筛性质的凝胶而被分离。四 密度梯度离心 蛋白质颗粒的沉降速度取决于它的大小和密度。当其在具有密度梯度的介质中离心时，质量和密度大的颗粒比质量和密度小的颗粒沉降得快，并且每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的介质梯度时，即停滞不前，可分步收集进行分析。11 如何分析未知样品的氨基酸成分？12 如何用纸层析法对氨基酸进行定性和定量的测定？13 纸层析、柱层析和薄层层析各有什么特点？纸层析是一种以滤纸作为支持物的分配层析法。组成滤纸的纤维素是亲水物质，能形水相和展层溶剂的两相系统，被分离的物质在两相中的分配保持平衡关系。纸层析法用于分析简单的混合物时可作单向层析，对于复杂的混合物，可作双向层析。 柱层析则是将固定相装在柱管内，以液体作为流动相，流动相带着样品在柱内由上往下移动而使混合组分分离，即使样品沿一个方向移动而分离。 薄层层析是在玻璃片、金属箔或塑料片上铺上一层约12mm的支持物，如纤维素、离子交换剂、硅胶、氧化铝或聚酰胺等，根据需要做不同类型的层析。薄层层析是一一种微量快速的层析方法，它较纸层析的优越在于分辨率高，层析时间短。14 试述底物浓度对酶促反应速度的影响？15 酶的Km值是否可以作为鉴定酶的一种手段，为什么？米氏常数Km在实际应用中有何意义？可以，因为Km值对某一个特定酶来说是个常数，只与酶的性质、酶催化的底物和酶促反应条件（如温度、有无抑制剂）等有关。酶的种类不同，Km值不相同；同一种酶与不同的底物作用时，Km值也不相同。米氏常数Km在实际应用中的意义有：一 反映酶的种类 二 反映酶与底物的亲和力 一般用1/Km近似地表示酶对底物亲活力的大小，1/Km越大，表示酶对该底物亲活力越大，酶促反应易于进行。三 计算底物浓度和相对速度四 识别反应激活剂或抑制剂的存在16 试述实验中测定米氏常数(Km)的原理和方法。酶促反应速度与底物浓度的关系可用米氏方程来表示： VS v= Km+S 式中：为反应初速度；V为最大反应速度； S为底物浓度； Km 为米氏常数，其单位为摩尔浓度。 Km 值是酶的一个特征性常数，一般说来， Km 可以近似地表示酶与底物的亲和力。双倒数作图法是测定 Km 值的最常用的方法，将米氏方程改写成倒数形式： 1 Km 1 1 = () + v V S V实验时选择不同的S ，测定相对应的 V 。求出两者的倒数，以1 /对1/S作图，则得到一斜率为“Km / V”的直线。将直线外推与横轴相交，其横轴截矩为-1/S=1/V由此求出 Km 值。在实验过程中，我们需在不同底物浓度下进行酶促反应，并根据反应特点以相应的方法判定酶促反应的初速度。如在胰蛋白酶消化酪蛋白的实验中，蛋白质水解生成自由氨基，可用甲醛滴定法判断氨基增加的数量而跟踪反应，求得初速度。17 简述脂肪酸的-氧化的原理。 脂肪酸的氧化分解是在脂肪酰基的-碳原子上发生的，每进行一次，断裂两个碳原子，故称之为-氧化。在线粒体基质中，脂酰CoA在脂肪酸-氧化多酶复合体的催化下，从脂酰基-碳原子开始，过程包括脱氢、加水、再脱氢、硫解4个连续反应。经过一次-氧化产生比原来少2个碳原子的脂酰CoA，如此反复进行-氧化，最终可完全氧化为乙酰CoA。两分子乙酰辅酶A可再缩合成乙酰乙酸。在肝脏内，乙酰乙酸可脱羧生成丙酮，也可还原生成-羟丁酸。18 抽滤和过滤操作应该有哪些注意事项？过滤操作的注意事项：（1） 过滤时，漏斗应放在漏斗架上，其漏斗柄下端要紧贴承接容器内壁，滤纸应紧贴漏斗内壁，滤纸边缘应低于漏斗边缘5mm，事先用蒸馏水润湿使不残留气泡。（2） 倾入分离物时，要沿玻璃棒引流入漏斗，玻璃棒与滤纸三层处紧贴，分离物的液面要低于滤纸边缘。（3） 漏斗内的沉淀物不得超过滤纸的高度，便于过滤后洗涤沉淀。（4） 漏斗不能直火加热。若需趁热过滤时，应将漏斗置于金属加热夹套中进行。若无金属夹套，可事先把漏斗用热水浸泡预热方可使用。 抽滤操作的注意事项： (1) 使用布氏漏斗进行减压过滤时，要在漏斗底上平放一张比漏斗内径略小的圆形滤纸，使底上细孔被全部盖住。事先用蒸馏水润湿，特别要注意滤纸边缘与底部贴紧。 （2）布氏漏斗要用一个大小相宜的单孔橡胶塞紧套在漏斗颈上与配套使用的吸滤瓶相连。 （3）安装时，布氏漏斗的颈的斜口要远离且面向吸滤瓶的抽气嘴，抽滤速度要慢且均匀，滤液不能超过抽气嘴。 （4）在抽滤过程中，若漏斗内沉淀物有裂纹时，要用玻璃棒及时压紧消除，以保证吸滤瓶的低压，便于吸滤。19 简述离心机的使用方法及注意事项离心机的使用方法：1 将离心机安装在坚实的水平桌面上，安装合适的离心转子。2 将离心样品称量平衡后，对称放入转子中，盖严离心机盖。3 接通电源，打开开关4 按“设置”键，用“”或“”键选择与转子匹配的转子号，按“ENTER”键确认。5 按“设置”键，用“”或“”键选择所需转速，按“ENTER”键确认。6 按“设置”键，用“”或“”键选择所需离心时间，按“ENTER”键确认。7 按下“启动”键，离心机开始工作。8 待离心机转速显示为“0”后，取出离心管，将转子擦拭干净，切断电源。离