（分析化学专业论文）在线蛋白二维液相色谱仪的构建及应用.pdf

摘要 通过对高效液相色谱仪的改进 构建了新型的在线蛋白二维液相色谱分离装置 经过 对该装置的调试和加工 组装成适合蛋白质组学研究的多功能多维自动化液相色谱仪器 也是一个可与任何液相色谱仪相匹配的独立的辅助设备 并将其命名为 色谱专家 在 此基础上 初步实现了该仪器装置的在线蛋白单柱二维液相色谱功能 第一章为文献综述 详细介绍了二维及其多维液相色谱法及其仪器的发展状况 分析 了目前报道的二维及其多维液相色谱仪器装置的优缺点 提出了改进仪器装置的设想和方 案 对自动化的二维及其多维色谱仪器装置做了简要的总结 第二章为实验方法 包括本论文所涉及的所有实验所需的各种仪器和试剂 以及各类 酶的活性测定方法 s d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳方法及其蛋白含量测定方法 第三章首次构建了一种在线单柱蛋白二维液相色谱分离装置并命名 色谱专家 色 谱专家 具有收集一维馏分并在线进样到二维中去 在线缓冲溶液交换 收集馏分可以低 温4o c 保存而且可以高温水浴加热的功能 同时以单柱二维液相色谱法为例对该仪器装置 的运行原理做了深入的探讨 利用具有疏水功能机理的弱阳离子交换柱在该仪器上成功实 现了对多种标准蛋白的单柱二维液相分离 最后对标准蛋白在该仪器上单柱二维液相分离 的质量回收率和活性回收率进行了测试 获得了较好的结果 第四章利用构建的在线蛋白二维液相色谱分离装置 以商品的w c x h i c 双机理柱 分别对牛胰腺中的胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶进行2 d l c 1 c 分离纯化 经过s d s 聚丙烯酰 胺凝胶电泳和薄层扫描测定 均获得了较高纯度的目标蛋白 对质量回收率和活性回收率 进行了测试 也得到了较好的结果 最后对 色谱专家 仪器的未来发展做了展望 关键词 色谱专家 在线蛋白二维液相色谱分离装置 单柱二维液相色谱法 胰凝乳蛋白 酶 胰蛋白酶 a b s 仃a c t an e wt y p eo fo n l i n et w o d i m e n s i o n a ll i q u i dc h r o m a t o g r a p h y 2 d l c f o rp r o t e i n s e p a r a t i o ns y s t e mw a sb u i l tb yt h ei m p r o v e m e n to fh i 曲一p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h i t w a sa s s e m b l e dt ob eam u l t i f u n c t i o n a la n da u t o m a t e dm u l t i d i m e n s i o n a ll i q u i dc h r o m a t o g r a p h y m d l c a p p a r a t u sf o rp r o t e o m i c sa n di ta l s oc a nb ec o n n e c t e dt oa n yal i q u i dc h r o m a t o g r a p ha s a ni n d e p e n d e n ta u x i l i a r ye q u i p m e n ta n dn a m e da s c h r o m a t o e x p e r t o nt h i sb a s i s t h ef u n c t i o n o ft w o d i m e n s i o n a ll i q u i dc h r o m a t o g r a p h yu s i n gs i n g l e c o l u m n 2 d l c 一1c o nt h i sa p p a r a t u s w a sc a r r i e do u t l i t e r a t u r er e v i e w 1 1 1 ed e v e l o p m e n to f2 d l ca n dm d l ci n s t r u m e n t sw a si n t r o d u c e da n d r e v i e w e di nd e t a i l t h es c h e m eo fi m p r o v e m e n td e v i c e sw a sp r o p o s e db yt h ea n a l y z i n go ft h e a d v a n t a g e sa n dd i s a d v a n t a g e so ft h er e p o r t e d2 d l ca n dm d l ca p p a r a t u s t h ea u t o m a t e d 2 d l ca n dm d l ca p p a r a t u sw e r es u m m a r i z e d b r i e f l y t h ee x p e r i m e n t a lm e t h o dw a si n t r o d u c e d i n c l u d i n ga p p a r a t u s r e a g e n t a sw e l la s t h e m e t h o d so f e n z y m ea c t i v i t y s d s p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s a n d p r o t e i n d e t e r m i n a t i o n a ne q i p m e n tc a l l e da s c h r o m a t o e x p e r t f o rp r o s s i n gf a s tp r o t e i ns e p a r a t i o no n l i n e2 d l c b yas i n g l ec o l u m n 2 d l c 一1 c i sf i r s t l yc o n s t r u c t e d t h e c h r o m a t o e x p e r t h a sm u l t i p l e f u n c t i o n sa s o n l i n ef r a c t i o nc o l l e c t i o nf r o mt h ef i r s ts e p a r a t i o nm o d ea n dq u a n t i t a t i v e l y s a m p l er e i n j e c t i o ni n t ot h es e c o n ds e p a r a t i o nm o d e o n l i n eb u f f e re x c h a n g e t h ec o l l e c t e d f r a c t i o nc a nb es t o r a g e di nt h ee q u i p m e n ta t4 0 ca n da l s oc a ns t e r i l i z ei ns i t u 耐m1 1 i 曲w a t e r s t e a m b yt a k i n gt h ed e v i c ea sa i le x a m p l e t h eo p e r a t i o np r i n c i p l eo ft h ea p p a r a t u sw a s d i s c u s s e dp r o f o u n d l y u s i n go n ew e a kc a t i o ne x c h a n g e w c x a n dh y d r o p h o b i cf u n c t i o n s m i x e d m o d ec o l u m no nt h ea p p a r a t u s 2 d l c 1 cs e p a r a t i n gs t a n d a r dp r o t e i n sw a sc a r r i e do u t s u c c e s s f u l l y f i n a l l y m a s sa n da c t i v i t yr e c o v e r yw e r et e s t e d a n dg o o dr e s u l t sw a so b t a i n e d u s i n gw c x h i cm i x e dm o d ec o l u m no n l i n e2 d l c ics e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o nt h e b o v i n ep a n c r e a sc h y m o t r y p s i na n dt r y p s i n h i g h e rp u r i t yo ft h et a r g e tp r o t e i n s a n db e t t e rm a s s a n da c t i v i t yr e c o v e r yw e r eo b t a i n e d f i n a l l y t h ep r o s p e c to fc h r o m a t o e x p e r tf o rf u t u r e d e v e l o p m e n tw a sv i e w e d k e yw o r d s c h r o m a t o e x p e r t o n l i n et w o d i m e n s i o n a ll i q u i dc h r o m a t o g r a p h yp r o t e i ns e p a r a t i o n d e v i c e s t w o d i m e n s i o n a ll i q u i dc h r o m a t o g r a p h yu s i n gas i n g l e c o l u m n c h y m o t r y p s i n t r y p s i n 西北大学学位论文知识产权声明书 本人完全了解西北大学关于收集 保存 使用学位论文的规定 学 校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版 本人 允许论文被查阅和借阅 本人授权西北大学可以将本学位论文的全部或 部分内容编入有关数据库进行检索 可以采用影印 缩印或扫描等复制 手段保存和汇编本学位论文 同时授权中国科学技术信息研究所等机构 将本学位论文收录到 中国学位论文全文数据库 或其它相关数据库 保密论文待解密后适用本声明 1 学位论文作者签名 丕陡缢指导教师签名 套 毡 星三 dd 年6 只 pb 渊年白肿日 西北大学学位论文独创性声明 本人声明 所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果 据我所知 除了文中特别加以标注和致谢 的地方外 本论文不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果 也 不包含为获得西北大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材 料 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示谢意 学位论文作者签名 豌 鳊嘭 2 护耖7 年么月1 o 日 北人乎硕十一 位论文 第一章文献综述 1 1 引言 高效液相色谱法 h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y h p l c 是广泛应用于分 析化学及其个领域的分析分离方法 高效液相色谱仪是由储液器 脱气装置 高压色 谱泵 进样阀 色谱柱 检测器 记录仪或者工作站组成 高效液相色谱仪的主要工 作原理是高压色谱泵将储液器中的流动相打入色谱系统 样品溶液经过进样阀进入流 动相 被流动相载入色谱柱 固定相 内 由于样品溶液中的各组分在两相中具有不 同的分配系数 在两相中作相对运动时 经过反复多次的吸附 解吸附的分配过程 在 移动速度上产生较大的差别 被分离成单个组分依次从柱内流出 通过检测器检测时 样品浓度被转换成电信号传送到记录仪或者工作站 数据以图谱形式显示出来 2 0 世纪 6 0 年代末科克兰 哈伯 荷瓦斯 莆黑斯和里普斯克等人共同开发了世界上第一台高 效液相色谱仪 开启了高效液相色谱的时代 2 0 世纪6 0 年代研制出气动放大泵 注射 泵及低流量往复式柱塞泵 但后者的脉冲信号很大 难以满足高效液相色谱的要求 2 0 世纪7 0 年代 往复式双柱塞恒流泵 解决了这一问题 随着计算机的科技迅猛发展 高效液相色谱仪的自动化程度也在不断的提高 目前最先进的高效液相色谱仪拥有自 动进样和自动收样的功能 所有操作全部实现计算机控制 实现了强大的自动化分析 功能 质谱技术的诞牛已经有近百年的时间了 质谱分析法是通过测定样品离子的质荷 比来定性的一种分析方法 被分析的样品在进行离子化后利用不同离子在电场或磁场 的运动行为的不同 把离子按质荷e l m z 分开再将结果以电信号的形式显示出来 通 过样品的质谱和相关信息 可以得到样品的定性定量结果 质谱从诞生至今取得了迅 猛的发展 开始用来进行同位素测定和无机元素分析 二十世纪四十年代以后开始用 于有机物分析 再到六十年代出现了气相色谱 质谱联用仪 开始成为有机物分析的 重要仪器 八十年代以后又出现了快原予轰击电离予源 基质辅助激光解吸电离源 电喷雾电离源 大气压化学电离源等一些新的质谱技术 计算机的应用也使质谱分析 技术更加成熟和方便 液相色谱一质谱联用仪 h p l c m s 已经成为了目前分析仪器先进典范 这两种最 第 章文献综述 具代表性的分析仪器的结合极大地推动了分析化学的发展 尤其在复杂的实际样品的 分离和前沿科学 蛋白质组学 的研究方面显示出明显的优势 目前h p l c m s 已广 泛地应用于化学 化工 材料 环境 地质 能源 药物 刑侦 牛命科学 运动医 学等各个领域 尽管一维液相色谱已经广泛应用于多领域的样品检测和分离 但是一 维的液相色谱的分离能力远不能满足从实际样品中获得目标物 众所周知耳i j 便是最简单 的样品仍旧需要具有很高塔板数的色谱柱才能实现较好的分辨率 l 引 d a v i s 和g l d d i n g s 研究 发现如果样品所含可被分离的组分超过色谱柱总峰容量的18 从分析角度讲 该样品将 无法被分离 超过色谱柱总峰容量的3 7 一维色谱图中将不能分辨所含组分的色谱峰 2 现在高效液相色谱的发展趋势是二维或多维色谱技术 不同机理的液相色谱例如正相液相 色谱 n o r m a lp h a s el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y n p l c 反相液相色谱 r e v e r s e dp h a s el i q u i d c h r o m a t o g r a p h y r p l c 排阻色谱 s i z ee x c l u s i o nc h r o m a t o g r a p h y s e c 离子交换色谱 i o n e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y i e c 亲和色谱 a f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y a c 币i j 疏水相互作用色谱 h y d r o p h o b i ci n t e r a c t i o nc h r o m a t o g r a p h y h i c 等理论上为二维或多维提供了多种组合 因 此 基于不同分离机理的二维或多维色谱技术将是复杂样品分离纯化的唯一途径和发展方 向 1 2 二维及多维液相色谱技术的基本原理和方法 1 2 1 二维及多维分离的基本概念 二维液相色谱 2 d l c 是采用两根独立的不同分离机理的色谱柱联合使用而构成的色 谱分离系统 样品经过第一维色谱柱分离之后 可以在线进行 o n 1 i n e2 d l c 也可以离线收 集后再进样 o f f l i n e2 d l c 经过接e l 切换进入第二维色谱柱进行分离 二维液相色谱通 常采用的是两根不同机理的色谱柱 一般是根据样品的不同的物理化学性质如等电点 i e c 疏水 i 生 h i c r p l c 分予量 s e c 生物识另j j a f c 等把复杂的混合样品分离成单 一的组分 这种二维色谱的两种不同模式的组合一般认为具有分离的正交性 即保留机理 不同 对于完全正交的二维色谱系统 理论上系统的分辨率是对应每一种一维模式分辨 牢平方和的平方根 峰容量是对应每一种一维模式峰容量的乘积 2 矧 在一维色谱中没有达 到完全分离的组分 有可能在二维系统中较好的被分离 所以二维色谱系统的分离能力增 强 分辨率提高 峰容量也增加 2 2 d l c 的在线模式的显著特点在于在系统山实现了样品组分的转移 没有经过中间步 骤 所以自动化程度高 分析时间短 是现代仪器的发展方向 o f f l i n e 模式则是切割第一 维洗脱产物井收集起来 进行一定的处理后再进入第二维进行分析 离线方法简单灵活 可以对自己感兴趣的任何组分进行二维分析 然而其缺点较多 转移样品会产牛污染 自 动化程度很低 分折的重现性较差 2 d l c 根据第一维分离出来的样品可以全部亦可部分进入第二维分析 可以分为整体 模式和部分切割模式 整体模式就是就是将一维洗脱组分全部进入二维继续分析 过程中 没有样品组分质量的丢失或浪费 部分模式就是只将一维感 趣的部分导入二维进行分析 部分模式为了准确无误的将特定的样品转移到二维中去 必需提前进行标准物试验 然后 设定特定的程序 全二维色谱 c o m p r e h e n s i v et w o o 9 9 加不大于可 以舍掉最后一个值 再用样品吸光度减去其参比 用这个值代入标准曲线求得考兰中的蛋 白浓度c 鲈1 1 l 通过c 求得样品溶液中的蛋白浓度 蛋白浓度 蚓m l p c x 2 o 样品加入量 样品加入量 2 8 西北大学硕士学位论文 参考文献 1 l a s k o w s k im c h y m o t r y p s h l o g e n sa n dc h y m o t r y p s i n s t m e m o d se n z y m o l 1 9 5 5 i i 8 2 6 2 2h u m m e l b r i a nc wa m o d i f i e ds p e c t r o p h o t o m e t r i cd e t e r m i n a t i o no fc h y m o t r y p s i n t r y p s i n a n dt b r o m b i n j c a n a d i a nj o u r n a lo f b i o c h e m i s t r ya n dp h y s i o l o g y 1 9 5 9 3 7 1 3 9 3 1 3 9 9 3 s c h w c r tgw t a k c n a k ays p e c t r o p h o t o m e t r i cd e t e r m i n a t i o no ft r y p s i na n dc h y m o t r y p s i n j b i o c h i m i c ae tb i o p h y s i c a e t a 19 5 5 16 5 7 0 5 7 5 4 b r a d f o r dm m ar a p i da n ds e n s i t i v em e t h o df o rt h eq u a n f i t a f i o no fm i c r o g r a mq u a n t i f i e so f p r o t e i nu t i l i z i n g t h e p r i n c i p l e o f p r o t e i n d y eb i n d i n g j a n a l y t i c a l b i o c h e m i s t r y 19 7 6 7 2 2 4 8 2 5 4 p 町北人学硕十学位论文 第三章在线蛋白二维液相色谱分离装置 3 1 前言 二维液相色谱 2 d l c 是一种将待测样品经过两种独立且不同的液相色谱分离系统 色谱柱 分离的现代技术 色谱柱的选择性是设计二维液相色谱的首要问题 一般来说 选择完全正交的两根色谱柱作为二维分离效果最好 也就是说利用分离机理完全不同的两 根色谱模式例如离予交换色谱和疏水相瓦作用色谱 1 研究表吲2 4 1 对于完全正交二维系统 的总峰容量n 2 d 等于一维模式峰容量n 和二维模式峰容量n 2 的乘积 n 2 d n i x n 2 2 d l c 可以是只将一维感兴趣的组分进样到二维进行分离 也可以是将一维所有组分 采样切割后进样到二维分离 这分别称作中心切害 i h e a r t c u t t i n g 和全二维液相色谱 2 0 0 6 年p e t e rwc a r r 研究组对色谱仪进行了改造 并成功实现了将数微升的一维色谱收集的样 品在线的进样 至t j 维色谱系统中 在同一台l c 仪器上实现了2 d l c 的快速分析 并称其 为2 d l c 的发展t t 开辟了新纪元 5 r e g n i e r 研究组 8 1 利用离线2 d l c 对整体蛋白进行 分离的研究 他们工作的特点是既能在分析级别又能在制备规模上实现对目的蛋白和功能 蛋白的分离 不过他们一维收集馏需要经膜过滤 膜透析或排阻色谱 s e c 除盐后才能进入 第二维色谱 这样既浪费了时间又引进了s e c 作为第三维色谱 因此仍然没有完全实现在 线形式的2 d l c 本论文将利用本实验室合成的双保留机理的色谱固定相为基础 为在线单柱蛋白二维 色谱法 o n l i n et w o d i m e n s i o n a ll i q u i dc h r o m a t o g r a p h yu s i n gas i n g l ec o l u m n 2 d l c i c 的 实现搭建仪器装置 其主要功能是分别实现在线单柱蛋白二维色谱 2 d l c i c 的两种分 离机理 并将其通过新型的接口技术和新型的缓冲溶液交换技术实现一根色谱柱的两种分 离机理对蛋白质进行二维的分离纯化 该研究史无前例的使用了一根色谱柱的两种功能作 为二维分离的两种模式 在构建的新型仪器装置上实现在线二维液相色谱功能 目前本实 验室合成的双保留的固定相丰要有w a x h i c 和w c x h i c 两种 所以本研究的全部工作 主要是围绕这两种色谱固定相展开 3 1 n 自 i n 卅 离装 3 2 在线蛋白二维液相色谱分离装置 3 2 i 简介 田3 i 在战蛋白二堆藏相色荫分离装置实翱照片 围3 1 的芹侧照片是在线噩白二维液相色谱分离装置的实物照片 从照片中可以看出 该装置由靠侧的一台l c 1 0 a v p 高效液相色谱仪和右侧的一个不锈钢大箱体构成 l c 1 0 a v p 包括两台高压液相色谱泵 一台紫外可见检测器 一台系统控制器 一台四元 低压梯度单元和台脱气装置 大箱体就是在线蛋白二维液相色谱分离装置的核心部分 从右侧箱体的面板图可以看出该部分主要包括 两个二位六通进样阀 两个四通切换阀 两个六通切换阀 一个八通切换阀 一个十通切换阀 箱体内部结构就是在线蛋白二维液 相色谱分离装置的连接技术部分 包括连接管路 混合器 定量环组以及色谱柱 箱体各 面用材为厚度2 m m 的3 1 6 l 不锈钢双层板材内夹黑色橡胶保温材料制作 该箱体具有耐酸 耐碱 抗腐蚀和保温作用 盅绕在箱体内壁的有足够的温控铜竹 在箱体的后面有温控铜 饩 的连接出入口 可以在温控铜管内通入冷媒循环 或者冷却水 使箱体保持低温到 4 该设计丰要是为了保证活性蛋白质在该系统内不会因高温而失活 因此该系统是一台专为 蛋白质分离纯化的专业仪器装置 具备进行蛋白质分离纯化的各项硬件条件 p q 中 十学位论文 322 结构及主要功能 对在线蛋白二维液相色谱分离装置简要介绍以后 再来详细介绍该装置的总体结构 c h r o m a t o e x p e r t 圈32 在线单柱蛋白二维渍相色谱装置 本论文所措建的仪器装置主要是在一台l c 基础上完成的 如图3 之所示 其它部分 由附加的三通阀 四通阀 八通阀 定量环组 5 m l 1 0 m l 高效液相色谱泵 混合器 管线 接头等构成 该仪器装置主要包括三大核心部分 进样部分 收样部分和混合部分 如图3 2 所示该仪器装置主要是在原色谱仪的基础上加以改造完成的 红色实线线框内代 表原有色谱仪系统 红色实线线框以外代表新装置系统 绿色虚线框为 4 冷藏保温系统 整个二维维色谱自动化装置由进 收样系统和混合系统构成 其中进收样系统可划分为一 维进样阀 二维进样阀和二维收样定量环组 定量环组由两个切换阀和1 5 0 个定量环构成 的 通过阀的切换实现对所需使用的定量环选择 混合系统由混合泵 常规高效液相色谱 泵 和二元混合器构成 收 进样系统与色谱柱之间的连接和功能的实现是由四个切换阀 完成的 该装置主要功能包括 整台装置包括台液相色谱仪及其辅助设备构成 辅助设备是 一个可与任何液相色谱仪相匹配的独立的部分 该部分组装在一个具有保温夹层的3 1 6 l 不 锈钢材质封闭箱体内 原有色谱仪可以进行正常的一维分析 二维装置的各个部件组成不 影响一维色谱的平衡 进样和数据采集等操作的进行 原有色谱仪的工作站可以实现对全 部二维液相分析运行程序的设计 而且对全部二维分析数据进行在线连续采集 装置对一 en 线 自 j 也i 离装w 维也i 普分析得到的洗脱馏分可咀任意切割收 既可以对感兴趣保留时间的馏分收集 也可 以对所有洗脱馏分进行全部切割收集 装置可以进行两种形式的在线缓冲溶液交换 一种 是系统的征线缓冲溶液变换 包括连接管路和色谱柱的平衡 一种是一维收鬓馏分的在线 缓冲溶液变换 收集样品在线缓冲溶液交换实现的理论基础是蛋白质在色谱杜中的不连续 洗脱 可以利用装置内的切换阀和微量混合器可将一维收集馏分进行快速在线缓冲溶液交 换 实现收集馏分在二维液相色谱柱上的保留 用装置将二维分离馏分可以进 亍二次在 线切割收集 并实现在线除盐 323 运行原理 在介绍在线蛋白二维色谱仪器装置的运行原殚之前 首先应详细了解二位六通进样阀 的结构 该进样阀 要有两种状态 如图3 3 p o s t i o na 为l o a d 状态 p o s t i o nb 为i n j e c t 状态 在l o a d 状态下 流动相小经过定量环 s a m p l el o o p s 此时可以将待测样品用微量 进样器打 定量环 定量环内被样品置换掉的溶液 流动相 将通过孔6 排出 在i n j e c t 状态下 流动相经过定量环 并将定量环内的待测样品在泵的压力推动下进入色谱杜 n 鼎熙 娥 7 i 圈3 3r h e j d y h e 7 7 2 5 i 二位六通进样阀的两种不同状态 在线蛋白二维色谱仪器装置的设计巧妙的利用了二位六通进样阀的功能 将两个二位 六通进样阀并联起来完成一维进样和二维进样 该仪器主要工作原理是通过茕 踏和阀的连 接实现维样品切割并收集在预定的定量环中 然后系统经过缓冲溶液交换 将二维流动 相置换一维流动相 再将一维收集样品通过混合二维流动相达到适台二维保留的日的 晟 后进行二维分析收集分析产物 例如利用在线蛋白二维色谱系统进行i e c h i c 二维分离纯 化蛋白质样品时 一维i e c 分离馏分首先切割收集在指定的定量环中 然后将切割的各个 馏分分别进行h i c 的分离纯化 由于i e c 收集的大体积馏分盐浓度一般不足05m o l 因此 将大量的低盐浓度的样品进样到h i c 模式下时将发生不保留现象 这时就可以利用混合系 统按一定比例混合较高盐浓度的流动相 一般直接混台h i c 模式a 液 以提高进样组分 的盐浓度进而达到在h i c 下保留的h 的 这样就可以利用h i c 模式对维i e c 分离 刮馏 分进行二维分离 3 2 2 1 一维进样 c h r o m a t o e x p e r t 田3 4 在战单柱蛋白二堆液相色谱装置的 箍进样 为了详细说明该仪器装置对单柱二维液相色谱功能的实现 现将以一根具有疏水功能 h i c 的弱阳离于交换 w c x 柱为例 逐步说明该仪器的运行过程 如图3 4 所示 假设s o l u t i o nl s o l u t i o n2 s o l u t i o n 3 s o l u t i o n4 分别w c x 的a b 流动相和h i c 模 式的a b 流动相 一维采用w c x 模式 二维采用h i c 模式 首先用w c x 模式的a 液 s o l u t i o n1 平衡系统 一维进样丰要是依靠原色谱仪系统来完成的 其关键操作步骤就 是采用系统中的0 号二位六通进样阀进样 i 号二位六通进样阀调节至p o s i t i o n a 位置 4 5 号切换阀分别调节至 一 一 位置 然后经过原色谱仪u v 检测器输出信号 流 动相经过路径及各阀状态 s o l u t i o nl p u m pa o 一 s a m p l ei o o p 一 l 一 一4 5 一 c o u m n d e k c t o r 4 8 w a s t e 3 2 2 2 一雏程序运行及切割收样 0 o 0 0 铀 孙 铀 第 n 目自镕液自f 也礴h 装 has h c h r o m a t o e x p e r t 田3 5 在战单柱鹰白二维藏相色谱装置的一雉程序运行夏收样 调整好一维进样的各阀位置以后 就可以用w c x 模式的a 液 s o l u t i o n1 对系统进 行平衡 然后运行w c x 模式梯度 s o l u t i o ni s o l u t i o n2 将待测样品在w c x 模式下进 行维分离 一维分析的结果 我们可以按照自己的意愿选择整体切割或部分切割的方式 收集组分 其中整体切割又可以划分为按时间切割 例如每5m i n 收集切割一次收集 和 按色谱峰切割 这时收样系统各切换阀状态 如图3 5 所示 为 8 一 9 一 3 2 号阀根据选择的定量环调节至对应状态 注意每次收样量不应超过定量环的最大容量 5m l 1 0m l 定量环 收集完毕后将8 阀调节为 一 w a s t e 此时各阀的状态为 s o l u t i o nla n d2 p u m p a 一0 一 一s a m p l el o o p 一1 一 1 一4 一5 j r 一c o u m n d e 佗c t o r 一8 一9 一 一3 s a m p l el o o p s 2 一i 一 一w a s t e 3 2 2 3 在线鹱冲薷藏交换 一维程序运行及切割收样完毕以后 系统要进行二维分析的第一步就是缓冲溶液交换 然后由w c x 进入h i c 模式 因此选用h i c 模式相应的流动相a 液 s o l u t i o n3 b 液 s o l u t i o n4 此时各切换阀的状态仍旧保持一维收样完毕时的状态 如图3 6 所示 c h r o m a t o e x p e r t 圈3 在线单柱蛋白二雏灌相色谱装置帕基冲溶液交接 首先用h i c 模式的a 液 s o l u t i o n3 将系统进行平衡 另外要用b 泵将m i x e r 及其 相关管路用h i c 模式的a 液 s o l u t i o n3 进行充分平衡 这些都是为后面的二维混合进样 做准备 缓冲溶液交换应尽量在柱压允许的情况下大流速快速进行以节约时间 一般来讲 在同 台仪器和相同的流速情况下 短柱的柱压小于长柱的柱压 色谱饼的柱压小于色谱 柱的柱压 凝胶基质的柱压小于硅胶基质 颗粒较大的硅胶产生的柱压小于颗粒小的硅胶 但是凝胶基质的色涪柱不能承受较大的压力 与此同时色谱饼还具有上样量大 分析速度 快的优点 在进行二维蛋白液相分离纯化及其制备方面具有明显的优势睁 此时各阀状态 为 s o l u t i o n3 p u r ee i a o 一 一s a m p l e l o o p 一 一 一l 一 一4 一5 c o i u m n d e t e c t o r 一8 一 一w a s t e 3 2 2 4 二维混合进样 二维进样为在线蛋白二维液相色谱系统运行的关键步骤 自动化的缓冲溶液交换装置 可以在短时间内改变系统内的流动相 并且实现对色谱柱的快速平衡 一维 w c x 分析得 到的馏分基本为低盐浓度组分 盐浓度一般不足05m 0 1 要实现收集馏分在h i c 模式下 的保留必须提高进样组分的盐浓度 因此 该装置在进行 维进样时利用外置混合器外置 高教液相色谱泵将样品和h i c 模式a s o l u t i o n3 液混合 从而解决二维进样问题 见图 3 7 所不 第 章存线蛋白 维被棚色礴分高装置 c h r o m a t o e x p e r t 田3 7 在战单柱蛋白 蛙藏f 腿请装置的 翩音掰 此时各阀状态为 1 号二位六通进样阀调节至p o s i t i o nb 位置 2 3 号切换阀调节至 待分析馏分位置 9 号 4 号 经过m i x e r 5 号 然后经过 d e t e c t o r 输出检测信号 此时流动相流经途径为 s o l u t i o n3 一p u m p a o 一s a m p l e l o o p 一 一i 一2 s a m p l el o o p c o l l e c t e ds a m p l e 一3 9 4 m i x e r p u m pbf r o ms o l u t i o n3 一5 一 一c o l u r n n d e t e c t o r 一8 一 呻w a s t e 3 2 2 5 二雏程序运行及其样品收集 c h r o m a t o e x p e r t 圈3 8 在蟪单柱蛋白二雉藏相色髓置的二堆程序露行及其样品性 二维进样结束后 如图3 8 所不需要将l 号二位六通进样阔调节至p o s i t i o na 4 5 号切换阀分别调至 呻 和 一 位置 然后8 号切换阀调节至 位置运行二维h i c 翼一 墓 鲤菱 圃厂l 卧敲 哪 m m m 蛳 呲 p q 北人学硕十学位论文 梯度洗脱程序 就可将二维分析样品收集 流动相经过路径及各阀状态 s o l u t i o n3a n d 4 一p u m pa 0 d s a m p l el o o p 一 一 一1 一4 5 c o l u m n d e t e c t o r 一8 一 一w a s t e 重复进行缓冲溶液交换一二维混合进样一二维 程序运行及其样品收集直至将一维切割的全部馏分完全进行二维分离 3 2 4 装置性能测试 3 241 引言 前面具体介绍在线蛋白二维液相色谱装置的运行过程 下面将用本实验室自主合成的 w c x h i c 双机理柱在该装置上 利用单柱在线二维液相法分离标准蛋白 以测试该仪器装 置对标准蛋白分离性能 并以标准牛胰r n a s e 为例来测试该仪器装置的对标准蛋白二维分 离后质量损失和活性损失情况 3 2 4 2 实验部分 3 2 4 2 1 仪器和试剂 见第二章2 1 1 2 1 2 3 2 4 2 2 色谱条件及其优化 本次实验所采用的w c x 流动相 a 1 0m m o l lk h 2 p 0 4 p h 6 5 b 1 0m m o l l k h 2 p 0 4 1 0m o i ln a c p h 6 5 1 h i c 流动相 c 2 0m m o l lk h 2 p 0 4 3 0m o l l n h 4 2 5 0 4 p h 6 5 d 2 0m m o l l k h 2 p 0 4 p h 6 5 1 经过条件优化具体梯度运行过程为 0 一1 5m i n 1 0 0 a 一8 0 a 2 0 b 2 0m l m i n 15 2 0m i n 8 0 a 2 0 b 一5 0 a 5 0 b 2 0 2 5m i n 5 0 a 5 0 b 2 5 2 8m i n 1 0 0 c 4 0m l m i n 2 8 3 3m i n 10 0 c 1 0m l m i n 混合泵 l0 0 c 3 0m l m i n 3 3 5 3m i n 1 0 0 c 一1 0 0 d 2 0m l m i n 5 3 5 6m i n 1 0 0 c 4 0m l m i n 5 6 6 1m i n 1 0 0 c 1 0m l m i n 混合泵 1 0 0 c 3 0m l r a i n 6 l 一8 lm i n 1 0 0 c 1 0 0 d 2 0m l m i n 3 9 第二章在线蛋白 维液艉i 色游分离装置 8 lm i n e n d l o o d 3 2 4 3 结果与讨论 3 2 4 3 1 对标准蛋白的分离测试 e c o o c d o 丘 图3 9w c x h i c 双机理柱在w c x 模式下对四种标准蛋白的分离色谱图 色谱条件 a 1 0m m o l lk h 2 p 0 4 p h 6 5 b 1 0m m o l lk h 2 p 0 4 1 0m o l l n a c i p h26 5 0 3 0r a i n l0 0 a 5 0 a 3 0 3 5m i n 5 0 a 2 0m l m i n 由左向右色谱峰依次足 l s o l v e n t2 m y o3 r n a s e a 4 c y t c5 l y s 图3 9 是w c x h i c 柱在w c x 模式下对标准蛋白m y o r n a s ea c y t c 和l y s 的分离情 况 2 0m l 流速从0 到o 5m o l n a c i 线性梯度洗脱3 0r a i n 掌 c 2 m 也 母 们 m i n 图3 1 0w c x h i c 双机理柱在h i c 模式下对四种标准蛋白的分离色谱图 色谱条件 a 2 0m m o l lk h 2 p 0 4 3 0m o l l n h 4 2 s 0 4 p h 6 5 b 2 0m m o l lk h 2 p 0 4 p h 6 5 0 3 0r a i n 7 0 a 一10 0 b 3 0 3 5m i n 10 0 0 6b 2 0m l m i n 由左向右色谱峰依次是 l s o l v e n t2 c y t c3 m y 04 r n a s e5 l y s6 a a m y 图3 1 0 是w c x h i c 柱在h i c 模式下对标准m y o r n a s ea c y t c l y s 和a a m y 的分 离情况 2 0m l 流速从2 1m o l 到0t o o l 州h 4 2 s 0 4 线性梯度洗脱3 0m i n 由图3 1 0 和图 一之eco n aocmqjo p q 北人学硕 j 学位论文 3 1 l 可以看出该w c x h i c 柱分别在w c x 和h i c 模式下均呈现较好的分离度 而且发现 w c x 对大多数蛋白的保留和洗脱都在0 到o 5m o ln a c i 范围内 而h i c 对大多数蛋白的 保留和洗脱都在2 1t o o l 到0m o l 州h 4 2 s 0 4 范围内 为了验证蛋白二维分离的效果 我们 可以选择合适的蛋白在一维模式下发牛保留不能分开 但是能够在二维模式下保留并分开 或者选择在一维模式下不发生保留的两种以上的蛋白 但是能够在在二维模式下保留并分 开 经过色谱条件优化首先在w c x 模式下进样a a m y c a r m y o r n a s e a c h y c y t c 和l y s 这7 种标准蛋白 详细的仪器操作过程参照3 2 2 运行原理 h e c o c o n c e s o o 02 04 06 0 t m i n 图3 1lw c x h i c 双机理柱在线单柱二维液相分离七种标准蛋白色谱图 1 m y o2 r n a s e3 c y t c 4 c t c h y5 l y s6 c a r 7 a m y 色谱条件 0 1 5m i n 1 0 0 a 一8 0 a 2 0 b 2 0m l m i n 1 5 2 0m i n 8 0 a 2 0 b 一5 0 a 5 0 b 2 0 2 5m i n 5 0 a 5 0 b 2 5 2 8m i n 10 0 c 4 0m l m i n 2 8 3 3m i n 1 0 0 c 1 0m l m i n 混合泵 1 0 0 c 3 0m l m i n 3 3 5 3m i n 1 0 0 c 一1 0 0 d 2 0m l m i n 5 3 5 6m i n 1 0 0 c 4 0m l m i n 5 6 6 1m i n 1 0 0 c i 0m l m i n 混合泵 1 0 0 c 3 0m l m i n 6 1 8 ir a i n 1 0 0 c i 0 0 d 2 0m l m i n 8 lm i n e n d 1 0 0 d 从色谱图3 1 l 中看出 由于0 a m y c a r 的为酸性蛋白 因此这两种蛋白在w c x 模 式下不发牛保留 在色谱图上以溶剂峰的形式出现 而0 c h y c y t c 这两种蛋白的在w c x 模式有保留 但是不能完全分开 所以分别将它们在线收集在5 0m l 的样品环中 然后进 行系统的缓冲溶液交换 在一维w c x 模式下收集的样品盐浓度比较低 大概盐浓度都不 到o 5m o l 要实现样品在h i c 模式的保留 必须提高收集的样品的盐浓度 因此二维进 样时就利用外置泵p u m pb 将h i c 的a 液按一定比例与收集样品充分混合 从而实现其在 4 l 第二幸存线蛋白 维液相i 色谱分离装置 h i c 模式下保留 然后利用h i c 模式将样品分离 如图所