（分析化学专业论文）基于短毛细管的微流控电色谱分离系统的研究.pdf

浙江大学硕士学位论文 摘要 摘要 毛细管电色谱 c a p i l l a r ye l e c t r o c h r o m a t o g r a p h y c e c 是毛细管电泳和高效 液相色谱的融合技术 是目前微分离分析的研究热点之一 作为一种具有优势理 论支持的分离模式 其必将在更广泛的领域中得到发展和应用 其中备受瞩目的 是毛细管电色谱技术和微全分析系统 p t a s 的交融产生了微流控电色谱技术 第一章 对毛细管电色谱的基本概念 理论和色谱柱制备技术 及其进样系 统进行概述 第二章 综述了微流控电色谱技术的发展和应用 着重介绍了芯片上色谱柱 的制备技术以及系统进样技术 第三章 建立了基于毛细管的微流控电色谱系统 与常规毛细管电色谱系统 相比 具有耗样少 分析快速 微型化等优点 与芯片色谱系统相比其制备成本 低 制作容易且易批量生产 实验中通过采用柱床上直接检测法避免了空柱窗口 带来的弊端 基本解决了气泡问题 提高了系统的稳定性 利用表面张力实现不 加电进样 并考察了加电进样和不加电进样两种方式下的区带引入过程 分析了 进样方式 进样条件对进样量和分离分析效果的影响 在反相电色谱分离模式下 在2c m 有效距离内实现两种荧光素染料的分离 关键词 短毛细管 电色谱 检测 进样 i i 浙江大学硕士学位论文 摘要 a b s t r a c t c a p i l l a r ye l e c t r o c h r o m a t o g r a p h y c e c i sah y b r i dt e c h n i q u et h a tp o s s e s s e sh i g h e f f i c i e n c yo fc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sa n dh i g hs e l e c t i v i t yo fl i q u i dc h r o m a t o g r a p h y w h i c ha t t r a c t sm o r ea n dm o r ea t t e n t i o n i t sa p p l i c a t i o nt om i c r ot o t a la n a l y s i ss y s t e m s i t t a s l e a d st oan o v e lt e c h n o l o g yc a l l e df t c e c i nt h ew o r k as h o r tc a p i l l a r y 10 0 ni d w i t l lp o r o u sp o l y m e rm o n o l i t h sa s s t a t i o n a r yp h a s ei su s e di nt h i sm i c r o f l u i d i cc e cs y s t e m c o m p a r e dw i t hl a c e cb a s e d o na c h i p s h o r tc a p i l l a r yi si n e x p e n s i v ea n dm a s s p r o d u c e d m e a n w h i l e i th a sm a n y l o w e rc o s t h i g h e ra n a l y s i ss p e e da n ds m a l l e rs i z et h a nc o n v e n t i o n a lc e cs y s t e m i n s t e a do fb u r n i n gw i n d o wf o rd e t e c t i o n t h em e t h o df o c u s i n gd e t e c t i o np o i n td i r e c t l y o nt h em o n o l i t he f f e c t i v e l yi m p r o v e dt h es t a b i l i t yo fs y s t e m s a m p l ep l u gc o u l db e i n t r o d u c e di n t oc a p i l l a r yu n d e rt h ef u n c t i o no fs u r f a c et e n s i o n a n di n f l u e n c eo f s e v e r a lf a c t o r so nt h es y s t e me f f i c i e n c yw a ss t u d i e ds y n t h e t i c a l l y t w od y e sw e r e b a s e l i n e r e s o l v e dw i t h i nas h o tc o l u m n a b o u t2c m u s i n gt h ep r e s e n ts y s t e m i nt h ef i r s tc h a p t e r t h ec o n c e p ta n dp r i n c i p l e so fc e c t h ec o l u m np r e p a r a t i o n t e c h n o l o g i e sa sw e l la st h es a m p l ei n t r o d u c t i o ns y s t e ma r er e v i e w e d i nt h es e c o n dc h a p t e r t h ed e v e l o p m e n ta n da p p l i c a t i o no fm i c r o f l u i d i cc e ci s r e v i e w e d i n c l u d i n gi t sc o l u m np r e p a r a t i o nt e c h n o l o g i e sa n ds a m p l ei n t r o d u c t i o n m o d e s i nt h et h i r dc h a p t e r am i c r o f l u i d i cc e cs y s t e mb a s e das h o r tc a p i l l a r y 10 0 m i d w i t hp o r o u sp o l y m e rm o n o l i t h sa ss t a t i o n a r yp h a s ew a sd e v e l o p e d a n o n c o l u m nf l u o r e s c e n c ed e t e c t i o nw a se m p l o y e dt oi m p r o v et h es y s t e mr e l i a b i l i t y t w os a m p l ei n t r o d u c t i o nm o d e sw i t ha n dw i t h o u te l e c t r o k i n e t i cd r i v i n gw e r es t u d i e d a n do p t i m i z e d t w of l u o r e s c e n td y e sw e r es e p a r a t e d 谢t hae f f e c t i v es e p a r a t i o n l e n g t ho f2c m c o m p a r e dw i t hc h i pb a s e di t c e cs y s t e m s t h ep r e s e n ts y s t e mh a s a d v a n t a g e so fl o wc o s ta n de a s eo fb u i l d i n g k e y w o r d s s h o r tc a p i l l a r y c e c d e t e c t i o n s a m p l ei n t r o d u c t i o n i i i 浙江大学研究生学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果 除了文中特别加以标注和致谢的地方外 论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果 也不包含为获得逝姿盘鲎或其他教育机构的学位或 证书而使用过的材料 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示谢意 一签名确垃 吼洲年 学位论文版权使用授权书 p 6 j 7 日 本学位论文作者完全了解逝鎏盘堂 有权保留并向国家有关部门或机 构送交本论文的复印件和磁盘 允许论文被查阅和借阅 本人授权逝姿盘堂 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播 可以采用影 印 缩印或扫描等复制手段保存 汇编学位论文 保密的学位论文在解密后适用本授权书 学位论文作者签名 了 1 江 答字日期 7 讲年 1 月9 q 1 日 导师签名 签字日期 弓强 川年9 了月 彳口 l l 致谢 本论文得以完成首先感谢导师方群教授的悉心指导 在此谨向恩 师致以最诚挚的谢意 方群教授提倡思维创新 鼓励勤思考多动手 探索再探索 在我 的科研工作陷入迷茫和困境中时 他总能引导我开拓思路 将工作进 行下去 感谢实验室的每位成员 他们让我感觉到这里不仅是大家一起工 作学习的场所 更是一个温暖的大家庭 感谢亦师亦友的石晓彤老师 感谢可亲可爱的大师姐黄艳贞 感谢已经博士毕业的杜文斌大师兄 感谢祝莹 孙蒙 潘建章 程永强 蔡龙飞多位师兄的无私帮助 感 谢张婷 古淑青师姐对我学习生活的关心 感谢同年级的叶晓兰 杨 风波和董娅妮同学 感谢多位学弟学妹 他们是 季勤勤 望秀丽 范吉峰 张豪 宿嫒 张云霞 感诩 在浙江大学的两年中 陪伴着我一起走过的朋友 你们是我 一生最宝贵的财富 最后 衷心感谢所有参加我论文评审和出席论文答辩会的专家及 教授 王新珏 2 0 0 8 年7 月于浙大紫金港 浙江大学硕士学位论文 第 章毛细管电色谱研究进展 第一章毛细管电色谱研究进展 毛细管电色谱 c a p i l l a r ye l e c t r o c h r o m a t o g r a p h y c e c 是毛细管电泳 c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s c e 和高效液相色谱 h i g hp e r f o r m a n c el i q u i d c h r o m a t o g r a p h y h p l c 的融合技术 1 捌 它是依靠电渗流推动流动相 根据样品 各组分色谱固定相和流动相之间的吸附 分配系数的不同和电泳速率的不同而实 现分离分析的一种方法 自2 0 世纪9 0 年代 毛细管柱制备技术获得突破 大量 的科研工作者投入到c e c 领域 促使其快速发展 成为目前微分离分析的研究 热点之一 3 7 1 在生物医学分析 8 1 4 环境分析f 1 5 1 7 1 食品分析 18 1 手性对映体 的拆分 t 9 2 a 1 等领域有广泛应用 2 铊7 1 本章将详细阐述毛细管电色谱的基本概念 理论和色谱柱制备技术 并对其 进样方法进行概述 1 1 毛细管电色谱的基本概念和理论 毛细管电色谱 c e c 是在毛细管中填充 生成色谱固定相或在毛细管壁上 涂布 键合色谱固定相 用电渗流驱动的微柱液相色谱技术 2 引 按照色谱柱的 特点 可分为填充电色谱 p a c k e dc a p i l l a r ye l e c t r o m a t o g r a p h y p c e c 和开管柱 电色谱 o p e n t u b u l a rc a p i l l a r ye l e c t r o c h r o m a t o g r a p h y o c e c p c e c 的固定相为 h p l c 填充材料或是在毛细管中直接聚合生成的连续柱床 o c e c 的固定相主要 是通过在毛细管内壁进行修饰 形成固定相涂层 分析物通过在涂层上的保留时 间不同实现分离 c e c 结合了电泳迁移原理和色谱分离原理 服从l c 和c e 的一般规律 同 时又有自己的特殊规律 2 1 1 本节主要余绍c e c 电渗流行为 保留机理和c e c 区带展宽理论 浙江大学硕士学位论文 第一章毛细管电色谱研究进展 1 1 1 毛细管电色谱的电渗流行为 电渗流 e l e c t r o o s m o t i cf l o w e o f 是毛细管电分离技术的基本现象 在c e c 中 尽管毛细管中填充了各种填料 但产生电渗流的情况类似于毛细管电泳 在 填充毛细管中无论是毛细管内壁还是填料本生都能产生电渗流 3 2 1 电渗流的产 生与双电层的存在紧密相关 当含有一定电解质浓度0 9 极性溶液作为流动相 在 p h 2 3 时 毛细管内壁的硅醇基团离解 吸附流动相中的正电荷离子 在毛细 管内壁形成双电层 同时 在固定相与流动相接触过程中 由于固定相表面选择 性的吸附溶液中某种电荷离子 使得固 液两相界面上产生相反符号的电荷 形 成双电层结构 在外加电场作用下 双电层中扩散层的溶剂化离子在电场力作用 下发生定向移动 并带动溶剂一起运动 产生电渗流 c e c 中 当毛细管内径大于双电层厚度万 n m 数量级 5 0 倍以上时 平均 电渗流线速度与毛细管内径无关 电渗流流速 为 垡丝 e o u 1 1 r r l 电渗率心为 心 堑 饕 盟 1 2 n e 乞 u r 屹7 6 6 其中 i 1 3 1 d 一 誓 1 4 式中 乞 分别为真空介电常数和相对介电常数 e 为电场强度 f 为 z e t a 电势 刁为流动相粘度 u 为外加电压强度 l 为毛细管总长度 乙为毛 细管进样端至检测窗口的距离 乙为不保留物质的出峰时间 也称为死时间 万 为双电层厚度 盯为固体表面电荷超量 c 是电解质浓度 f 是法拉第常数 由 1 1 1 2 1 3 和 1 4 可知 电渗流的大小与流动相的介电常 数 粘度以及电解质的浓度等因素相关 与柱的直径和填充颗粒的大小无关 因 2 浙江大学硕士学位论文 第一章毛细管电色谱研究进展 而其线速度不受柱填充不均匀性的影响 但由于填料的引入改变了流动相的路径 同时减小了有效电场 从而使得流速相较预测值偏小 1 1 2 毛细管电色谱保留机理 栅c 懈质的迁移般 可表铣 赘 5 式中u e p 和 分别为溶质的电泳速度和电渗流速度 疋为溶质的电色谱容量因 子 中性化合物 中性溶质在毛细管电色谱中依靠电渗流驱动 u p 大j l 茭j0 疋 k 上式可 化为 1 l f 蹦 丁 i d e f o 七 为液相色谱容量因子 1 6 舻警 等 由式 1 6 1 7 可得 惫睾 1 7 1 8 生 螋 1 9 t l np e o u 黼舢为乙 笳 由式 1 9 和 1 1 0 可得出中性化合物的保留时间为 t 南 可诵讨测定不保留标 记 物的浔移时间f 桌计筻中性化合物在申 仁 谱中的容 浙江大学硕士学位论文 第一章毛细管电色谱研究进展 量m k t r t e o 警 1 1 2 分析物为带电溶质 式 5 可改写为 竖二差青譬盟z 乞 3 c e c 中 溶质的实际迁移距离 可表示为 乞 巧 e 1 1 4 式中巧 e 分别为固定相相对溶质保留引起的迁移距离和由于电泳作用对溶 质的引起的迁移距离 且巧 鲁 蝴液相色谱的容量因子 1 r i m 流动相的迁移距离 丁 f l 1 6 瑶由两部分组成 一部分是溶质在流动相中的电泳迁移距离即e 另一部分 是电渗流引起的迁移距离 定义毛细管电泳的速度因子砭 甲 e 1 1 7 有g 击丧 乞 南 壶 则乞 熹 去 1 2 0 所以磋 乞 k k 砭 疋 c 2 t 该式即为电色谱的一般保留方程 浙江大学硕士学位论文 第一章毛细管电色谱研究进展 铲蒜 击 2 2 该式表明在毛细管电色谱中 带电溶质的保留式由溶质在液相色谱的保留因子决 定的 1 1 3 毛细管电色谱谱带展宽 c e c 的谱带展宽和变形造成了柱效降低和分离度下降 其表征可采用色谱 法中的分析方法 在c e c 理论踏板高度日可表述为h 日二 如一耐 1 2 3 其中 为分离柱内输运过程导致的谱带展宽对板高的贡献 h c 口l hm i g h 融 t1 2 4 1 一耐为柱外输运过程导致的谱带展宽对板高的贡献 h 瞰一弛i hi 嘶 h 馘 j 1 2 5 式中 以f g 是溶质由电渗驱动在柱内迁移过程中对板高的贡献 玩为柱内热效 应对塔板高度的贡献 分别表示柱外因素进样和检测过程导致的谱带 展宽对板高的贡献 当采用毛细管柱上检测 则可忽略检测器柱外效应对谱带展宽的影响 在一 定条件下也可以尽量降低热效应甚至忽略不计 此时理论塔板高度表达式为 h h m g 七h t l i 01 2 6 相应的在电色谱图中得到的谱峰离差值蠢 以长度为量纲 可表述为 一 露腴 蠢 州 1 2 7 式中正 曙是溶质在柱内电渗流迁移过程中产生的峰离差值 以 删表示柱外 进样区带长度产生的峰离差值 通常的观点认为柱外效应对谱带展宽的贡献 可得 正 1 0c m 的毛细管电分离技术相比 短毛细管柱具有耗样少 易实现高场强 分离快速等优点 k i n g 等 8 5 使用了有效长度为1c m 和2c m 的 超短毛细管电泳分离分析了2 0 1 0 0 0b pd n a s a k a k i 掣8 6 使用长度仅为3 6c m 的短毛细管 填充部分长度为1 5c m 内径为7 5 m 实现了毛细管c e c 的微 型化 在1m i n 内分离分析了五种生化物质 获得9 7 8 0 的理论塔板数 t s u d a 等 1 8 7 制备了亚微米厚度的硅胶涂层的开管色谱柱 在有效长度2c m 色谱柱中分离 浙江大学硕士学位论文 第二章微流控电色谱技术的发展和应用 分析了三种中性化合物 理论塔板数为7 1 0 0 0 m 基于短毛细管的c e c 与基于芯片的c e c 系统相比 在色谱柱制作方面具有 方法多样 技术较为成熟且长度可调 易实现批量生产 成本低廉等优势 短柱 毛细管电分离系统 容易采用高场强来减少分离时间提高分离效率 减少样品消 耗 但由于分离通道的缩短 谱带展宽受到柱外因素影响更为显著 其中进样操 作对分析效率的影响尤其突出 相较常规c e c 需要更高效和更高精度控制的 进样操作 实现更少更集中的进样区带引入 与c e c 芯片相比 短柱的单一通 道结构 无需在多个储液池切换调节电压 且避免了在开放通道中由于扩散效应 和对流效应引起的试样泄漏问题 2 4 本论文的工作 本论文着重研究基于短毛细管的c e c 体系 探求不同进样操作与分离效果之间 的关联性 在已建立的高通量 自动化微型进样体t 系 8 8 8 9 1 以及高灵敏微型 激光诱导荧光检测系统 恻的基础上 使用短毛细管电色谱整体柱 长度 5 c m 实现c e c 系统的微型化 浙江大学硕士学位论文 第三章基于短毛细管的微流控电色谱分离分析系统的研究 第三章基于短毛细管的微流控电色谱分离系统的研究 3 1 引言 基于短毛细管的微流控电色谱分析系统具有体积微型化 分离快速 重现性 好 无需特殊的加工条件和技术 造价低廉等特点 相对于c e c 芯片系统 在 色谱柱制作方面具有方法多样和技术较为成熟的优点 s a k a k i 等 8 6 使用1 5c m 的短毛细管填充柱实现了c e c 系统的微型化 在1m i n 内分离分析了五种生化 物质 获得9 7 8 0 的理论塔板数 t s u d a 等 8 7 制备了亚微米厚度的硅胶涂层的开 管色谱柱 在有效长度2c m 色谱柱中分离分析了三种中性化合物 理论塔板数 为7 10 0 0 m 本课题在研究所已建立的高通量 自动化微型进样体系 8 8 8 9 1 以及高灵敏微 型激光诱导荧光检测系统 5 j 的基础上 使用毛细管整体柱 长度 5c m 实现c e c 系统的微型化 3 2 实验部分 3 2 1 试剂与试样 甲醇 一级色谱纯 乙腈 特级色谱纯 实验用水均为超纯水 1 0 缶m 硼砂储备液的配制 称取0 9 5 3 4g 四硼酸钠固体 n a 2 8 4 0 7 h 2 0 置 于烧杯中 转移至2 5 0m l 容量瓶 用水稀释到刻度 t i r s h c l 缓冲液的配制 将5m l1 0 之m 的t r i s 三羟甲基氨基甲烷 溶液 和2 9m l0 1m 的h c i 混合 用水稀释至2 0m l 得到2 5 1 0 3m 的t r i s h c i 缓冲液 p h 8 0 四种荧光素染料储备液的配制 分别称取4 1 0m g 4 8 5m g 和4 1 7m g 的荧 光素异硫氰酸酯 f l u o r e c e i ni s o t h i o c y a n a t e f i t c m w 3 8 9 3 8 罗丹明b r h o d a m i n eb r b m w 4 7 9 0 1 和吖啶橙 a c r i d i n eo r a n g e a o m w 3 0 1 8 1 粉末 浙江大学硬士学位论文 第三章基于短毛细管的微流控电色谱分高分析系统的研究 溶于1m l 甲醇中 得到浓度为l o 5m m 1 0 1m m 和1 3 8m m 的储备液 称取 3 9 6m g 荧光素钠 f l u o r e s c e i ns o d i u ms a l t m w 3 7 6 2 7 溶于lm l 硼砂溶液中 1 0 m m 得到浓度为1 0 9m m 储备液 将个荧光素染料母液在4 冰箱中避光保存 实验前逐级稀释至所需浓度 注意事项 所有溶液在使用前均经过微孔滤膜过滤 3 2 2 仪器和软件 检测系统 正交型光路激光诱导荧光 l a s e ri n t r o d u c e df l u o r e s c e n c e 检测系 统 激发光源采用波长为4 7 3n i n 的半导体泵浦激光器 激光通过前置窄带滤光 片 4 7 1 3 彻仕8n i n 经由平面反射镜将光束反射至与操作平台平面垂直方向 光束由一长工作距离显微镜物镜 4 0 x 工作距离3r a m 聚焦 调整毛细管位置 将光斑置于毛细管通道中央 在毛细管同一平面上呈4 5 方向采集荧光 荧光 依次通过一显微镜目镜 2 5 x 针孔滤波器 直径0 9i r l n l 5 1 0l l n l 截止滤光 片和5 2 5n l n 带通滤光片 5 2 5n m l 1 5n n l 到达光电倍增管 r 9 2 8 h a m a m a t s u j a p a n 光电倍增管输出电流信号 由集成运放模块转换为电压信号 并放大 数据采集卡 p c i 6 0 1 3 n a t i o n a li n s t r u m e n t s u s a 将模拟信号转化为数字信号 输入到计算机 采集卡采获的数据由l a b v i e w 编写的程序进行数据处理 作图 工具选择o r g i n p r o7 5 毛细管电色谱柱 e p 10 0 15 3 5 整体柱 u n i m i c r o s h a n g h a i lt e c h n o l o g i e s i n c 内径为1 0 0l x m 整体柱有效长度1 5c m 毛细管总长3 5c m 使用时 截 取所需长度 2 5 3 5c m 的整体柱 电子目镜 杭州荣耀科技有限公司 连接体视显微镜 舜字光学科技 集团 有限公司 应用i m a g ea n a l y s i s 软件在电脑上观察并记录实验中出现的现象 实验装置如图3 1 所示 l a b v i e w 程序如图3 2 所示 数据记录界面如图 3 3 所示 淅 学顼 学位论支 第二章基于 毛自蕾的罐泣控电色谱分离舟析幕坑的研究 圈3 i 窭验操作平台 二 e 鞠 db 一 一e 斟 i 暑鳓一 口口 j e e 二 r 萝 l 一 囹3 2l a b v i e w 编写的程序围 新 学目 学位论i 第二章基f 蛆毛细昔的畿漶控电色谱分高舟析系统的研究 3 2 3 实验操作 二二二 二二二二三二二二二二 二二二二 e 三三三三三三三主 e 二二二二二二二二二二二二 二二 爿 图3 3 数据记录界面 毛细管电色谱柱截取所需长度后 在沾有水的砂纸上将进样端切口打磨平 整 用手术刀除去进样端和检测窗口的毛细菅涂层 每次使用前用注射器将流动 相充入通道 持续5r a i n 将试样稀释至所需浓度 注入样品池 在样品池 流动相液池及废液池上插 上电极 将处理好的电色谱柱插入废液池和流动相液池中间 使用三维平移台调 整毛细管的位置 在体视显微镜下观察激光斑点的位置 1 粗调毛细菅在竖直方向上的位置 使得激光斑点最小时毛细管内壁界面 最为清晰 2 调节毛细管在水平上的位置 使墩光斑点位于毛细管中央 3 细调毛细管竖直方向上的位置 使得教光斑点最小 强度最大 固定毛细管位置后打开高压电探 通电稳定5m i l l 实验开始前打开澈光器 预热半小时 然后开启数据采集系统 打开光电倍增管 调节其负高压 进行自 动或手动操作进样 由电脑记录信号 实验完成后 用注射器依次将流动相和甲 醇推入毛细菅电色谱柱 各持续5m l n 最后置于甲醇中保存 防止柱床干涸 注意事项 要 浙江大学硕士学位论文 第三章基于短毛细管的微流控电色谱分离分析系统的研究 1 在观察激光斑点时 用滤光片遮挡 避免强烈激光对眼睛的伤害 2 高电压下谨慎操作 更换试样时断电操作 防止触电 3 避免外界光线的影响以降低噪音和基线 防止强光直射损坏光电倍增管 4 爱护仪器 激光器 光电倍增管要经常开启 防止因受潮引起的仪器使 用寿命缩短 3 3 结果与讨论 3 3 1 设计思想 本工作旨在建立一套稳定的短毛细管电色谱分离系统 对于毛细管电色谱 普遍存在的问题是在工作过程中 管内产生气泡严重影响系统的稳定性 在本工 作中 观察了气泡产生的过程 条件和位置 比较了烧制检测窗口前后的色谱柱 性能 目的是减少系统在工作过程中气泡的产生 提高系统工作的稳定性和可靠 性 使用两种荧光染料来考察该色谱柱的分离效率 按照色谱理论 进样是区带 展宽重要影响因素之一 在本实验比较了加电和不加电进样两种进样方式对进样 量大小以及分离效率的影响 3 3 2 短毛细管电色谱系统中的气泡问题 3 3 2 1 烧制窗口的毛细管电色谱柱 按常规电色谱系统的操作方法 需采用烧制的方法加工色谱柱的检测窗口 在本工作中 取2 5c m 长毛细管色谱柱 在1 5c m 处烧制检测窗口 形成1 0c m 长的空柱部分 在色谱柱中运行流动相 体积比为1 l 的甲醇和1 0m m 硼砂溶 液 时 于不同电压下观察检测窗口和进样端发生的现象 在电压为2 5 0 0 v 时 在柱床末端以及进样端均观察到气泡的产生 如图3 4 所示 当电压持续升高 至4 0 0 0 v 时大量气泡产生 电流中断 浙 太车哥士学位论支 第二章基于 毛自管的徽瘫控电色谱舟高舟析系统的研充 图3 4 毛细管色谱柱柱床末端产生气j 包现泉 b 毛细管进样端口产生气泡现象 在实验中观察到 流动相的挥发是在毛细管进口端中产生气泡的主要原因 在毛细管脱离液池暴露在空气中时 进样端的流动相挥发 形成空柱部分 如图 35 所示 毛细管端i l 亮度较高的部分为流动相挥发后形成的空拄 当电压升高 时 空柱部分延长 造成了大量气泡的产生 2 5 0 0 v o r 一 一 一 3 0 0 0 v4 0 0 0 v 圉3 5 不同电压下毛细管色谱柱避样端口流动相挥发现象 烧翩窗口的毛细管色谱柱分为截然不同的整体柱床结构和空柱两部分 在毛 细管中电场分布不均衡 这是在捡测窗i l 和柱床界面处产生气泡的主要原因 同 时与均匀的整体柱相比 由于空柱部分的存在 毛细管阻抗较小 当电压增加时 容易在界面处产生气泡 此外 长时闻操作后 色谱柱产生焦耳热以及激光器的 热量传递造成体系温度升高 也是体系中产生气泡的原因之一 3 3 2 2 未烧制窗口毛细管电色谱柱 烧制后的色谱柱容易在进样端和柱床束端产生气泡 系统稳定性很不理想 无法在高电压下操作 于是实验进一步研究了未烧制窗口的毛细管电色谱整体柱 浙江大学硕士学位论文 第三章基于短毛细管的微流控电色谱分离分析系统的研究 的在高电压下长时间工作的稳定性 截取长度为3 2c m 的毛细管电色谱柱 用 流动相平衡 体系使用8 5 乙腈与1 5 的1 0m m 硼砂混合溶液作为流动相 电 压从5 0 0v 起每次调高5 0 0v 每个电压下稳定5m i n 观察电流表示数 以及 毛细管进样端口是否有气泡产生 在两个插有电极的储液池 a 和b 之间来回 移动 采用断电和不断电两种操作模式 断电模式是指从a 中移开时关闭电源 进入b 中再开启电源 断电后移入a 中 不断电模式是在整个过程中 将毛细 管从a 液槽移向b 液槽 再返回a 液槽一直开启电源 一旦观察到气泡产生 立即停止实验 重新用流动相充满毛细管 赶走气泡 观察结果如表3 1 所示 表3 1 电压升高时 5 0 0v 6 0 0 0v 换样操作现象 电压计时电流表 断电操作模式不断电操作模式事 电流是否有无气泡电流是否有无气泡 v m l n示数衅 稳定 产生稳定产生 5 0 00 1是无是无 l o o o5 1是无是无 1 5 0 0l o1 2是无 是 无 2 0 0 01 52是无 是 无 2 5 0 02 02 3 是 无 是 无 3 0 0 02 54 是 无 是 无 3 5 0 03 06 是无是无 4 0 0 03 58 是无 否 无 4 5 0 04 09 1 0是无否无 5 0 0 05 09 1 0是无否无 5 5 0 06 0l o 是 无否无 6 0 0 0波动6 1 0 有 否 有 未烧制的毛细管电色谱柱在高电压下 5 5 0 0v 仍未产生气泡 基本解决了 电色谱柱的气泡问题 从表3 1 可知 在高电压 4 0 0 0v 不断电操作模式 下电流出现不稳定 断电操作模式下电流依然保持稳定 当电压达到6 0 0 0v 时 进样端口发现有气泡形成 与烧制柱塞的色谱柱相比 前者产生气泡缓慢而少量 谢 学硬 学位论文第二章基于扭毛自蕾的傲巍拄电色谱舟膏舟析暮统的研究 电流产生较大波动 但不会立印断开 但在进行长时间操作后 因为柱内的焦耳 热和激光器热量传递的因素并未消除 以及柬的电解 在毛细管两端端口以及液 池中都会发现少量气泡 3 3 3 毛细昔整体柱柱床上直接检测 未烧制检测窗口的毛细管电色谱整体柱 其对电压和电流的稳定性较高 不 易产生气泡 但由于整体柱柱床对澈发光有散射作用 相比于开口管柱 其荧光 检剥信号噪声大 基线高 使用三维平移台调整后毛细管电色谱柱柱长上激光斑 点如图3 6 所示 毛细管中激光斑点由于柱床介质的散射作用而强度降低 斑点 较大 图3 6a 毛细首外激光斑点 b 拄床上激光斑点 经蚺光片滤光 3 3 3 1 柱床上墓线信号 实验考察了调节光电倍增管在不同负高压时 柱床上检测信号的变化 并将 其与毛细管空柱中激光斑点检测信号进行比较 囤3 7 图38 分别为光电倍增 管在不同负高压下柱床上 i 和空柱中 i i 挂测信号基线圈 毛细管中运行 同样的流动相 浙江大学硕士学位论文 第三章基于短毛细管的徽流控电色谱分离分析系统的研究 图3 7 光电倍增管负高压升高时柱床上 i 检测信号数值变化曲线 图3 8 光电倍增管负高压升高时空柱中 i i 信号数值变化曲线 从每个负高压下的基线信号中取1 7 5 2 5 0 个连续数据 计算基线信号的平均 值和标准偏差 用以衡量噪音大小 得到图3 9 与3 1 0 3 3 口ii再一 coa讳 叱u j 浙江大学硕士学位论文 第三章基于短毛细管的微流控电色谱分离分析系统的研究 图3 9 基线信号平均值与光电倍增管负高压关系曲线 i 柱床上检测信号 i i 空柱检测信号 图3 1 0 基线信号数值标准偏差与光电倍增管负高压关系曲线 i 柱床上检测信号 9 i i 空柱检测信号 由图3 9 与图3 1 0 可知在负高压 5 0 0v 下 对于直接在柱床上检测与空柱中 检测 前者的信号平均值略微高一些 噪音大小相差无几 随着负高压升高 i 的基线及噪音数值上升幅度均高于i i 但大小差别在1 个数量级之内 由此认为 在柱床上直接进行激光诱导荧光检测的方法是可行的 浙江大学硕士学位论文 第三章基于短毛细管的微流控电色谱分离分析系统的研究 3 3 3 2 峰形对比 毛细管电色谱柱总长3c m 检测点位于2c m 处 样品为1 0 石m 荧光素钠溶 液 流动相采用乙腈 毛细管两端液池施加1 0 0 0v 电压 光电倍增管负高压 5 5 0 v 采用柱床上直接检测 i 获得试样信号l 2 3 将同一根毛细管用打火 机灼烧 在2c m 的检测点之后形成空柱 激光斑点位于空柱部分 i i 获得试 样信号1 2 3 如图3 1 1 所示 一 qj毋一 coa 芷l j 浙江大学硕士学位论文 第三章基于短毛细管的微流控电色谱分离分析系统的研究 ic 7 代 f 051 0 5 2 5 弱 t i m e s e c o n d s 图3 1 la b c 分别为试样在三种不同进样方式下在两种检测模式下获得的信号图 表3 2 图3 1 1 中对应曲线分析表 a 进样时间1 0s 进样电压0v 曲线编号 出峰时间t s 峰高h半峰宽w i t 2 s 1 i 1 4 80 0 2 4 61 0 7 1 i i 1 2 10 0 2 6 0o 8 3 b 进样时间1 0s 进样电压1 0 0 0 v 编号 t s h w l 2 s 2 i 1 8 5 0 2 7 32 4 3 2 i i 1 9 9 0 4 1 91 6 8 c 进样时间1 5s 进样电压1 0 0 0 v 编号 t s h w l 2 s 3 i 2 0 30 6 0 53 7 6 3 i i 2 0 50 8 2 l2 0 6 从图3 1 1 及表3 2 可得三种进样模式下在同等分离长度后 柱床上 i 检 测所得的半峰宽数值略大于空柱中 i i 检测 其柱效稍低 且由于柱床对激光 的散射作用提高了检测基线和噪音 信噪比降低 但鉴于采用柱床上检测对高电 5 4 3 2 o o o o 一 e 一 口coan 叱k一一 淅d 大学硬士学位论文 第二章基于h 毛自蕾曲谩泷控电色谱舟高舟析系统的岍宽 压以及长时间操作的稳定性 毗及调整检测位置的灵活性 在后续的分离操作中 直接采用柱床上检测的方法 3 3 4 电动进样 在自动进样模式下 毛细管在样品池中停留不同的时间f0 5 1 5s 1 电压分 别为5 0 0 v 和1 0 0 0 v 时 高浓度荧光素 1 0 m 的进样区带如图3 1 2 所示 05sl0sl5s 囤3 1 2 进样时问为0 5s10s 和l5s 进样电压为 5 0 0 v 和 1 0 0 0v 的进样区带 横向比较相同电压下不同时间的进样区带图片 可观察到进样区带随着进样 时间的延长而加长 纵向比较三组图片 在相同的进样时间下 进样区带的长度 随着电压的升高而延长 3 3 5 不加电进样 实验中观察到在对毛细管色谱柱不施加电压的情况下 该缺口管进样系统同 样能够实现连样 进样过程中分为两个步骤 l 毛细管脱离样品液面 液滴沾在 毛细管端r 3 2 液滴在表面张力作用下进入色谱柱 淅 大学再 学位论文第 章基于短毛自f 的徽漉拉电色谱舟寓舟析暮坑曲研竞 3 3 5 1 不同组成试样溶j 葭 在毛细管端口形成的液滴大小与样品溶液的表面张力大小有关 圈31 3 为 两种试样溶液在端口形成液滴 在色谱柱中引入进样区带熙片 为了便于观察比 较 圈中记录了三种状态 l 毛细管端口刚脱离样品池 2 毛细营即将进入缓冲 液池 3 施加 1 0 0 0 v 电压驱动分离 圈31 3 不同稀释j 夔所得荧光素溶液在毛细管色谱柱端口形成藏滴以及在色谱柱中引入试样 区带圉a 稀释溶j 葭为8 5 l 腈和l5 硼砂混合溶寝 b 稀释溶蘸为硼砂溶液 从上图中可以观察到 a 溶液形成的样品区带鞍b 短 原因在于a 中含高 比例的有机相乙腈 乙腈的表面张力小于水 因此a 溶液的表面张力较b 小 3 3 5 2 毛细管移动方式 实验中比较了a 和b 两种移动方式下在毛细管端口形成液滴形态 以及在 色谱拄中形成的进样区带大小比较 如图31 4 a 模式下 调节三维平移台 毛 细营管垂直液面进入样品池 b 模式下 使用滑动进样装置移动液池 此时液面 与毛细管端i l 相切 从图中观察到在a 模式下 试样溶液与毛细管端口接触时 问长 在色谱柱端口形成的液滴较大 进而在色谱柱中形成较长进样区带 淅 大学磺士学位论文 第二章基于短毛细蕾的徽澶控电色谱分离舟祈杀坑的研究 田31 4 进样区带图片 aj 葭池静止 移动毛细营 b 毛细管静止 移动瘕池 3 3 5 3 毛细管端口位于液面下不同位置 当毛细管端口处于试样溶液内不同位置的进样过程如图31 5 所示 毛细管 端口位于溶液内深处时 当样品溶液与毛细营脱离时 在毛细管端口和侧壁上均 会残留试样溶寝液滴 端口形成的液滴进入毛细管 而残留在侧壁上的液滴则在 毛细管进入流动相液池时造成污染 圈31 5a 较理想情况下 毛细管端口与 液面相切 恰好接触到溶液 此时只在端口处形成液滴 而不会污染毛细管侧壁 圈3 1 5 b a 浙 学硬 学位论文 第二章基于 毛自f 的矗洼控电色谱分商分析幕境的研究 田31 5 毛细管端1 3 在不阿位置时形成寝靖形态与进样区带大小 a 蔽面毗下 b 接触j 燕面 3 3 5 4 自动进样控制程序设计 为了实现系统的自动化 设计了自动进样控制程序 首先毛细管进口端浸入 流动相液池中 启动程序后试样液池秽向毛细管 保持停留时间分别为o5 10 和15s 然后回复起始位置 实验中观察到由于两个液池相距距离短 0 8c m 毛细管从样品池移回流动相液池所需时间少 而在此时间段内液滴未完全进入色 谱柱 造成了对液池的污染 因此重新设计进样控制程序 使得毛细管在两个液 池中途停留2s 图3 1 6 记录了改进前后的自动进样控制程序下操作时在毛细管 色谱柱中形成的试样区带 a b 田3 1 6 a 中途不停留和 b 中逮停留2s 实现试样引入区带图 浙江大学硬士学位论文 第三章基于短毛细管的徽流控电色谱分离分析系统的研究 图3 1 6 表明自动进样控制程序改进后获得了较长的进样区带 说明毛细管 端口的液滴进入色谱柱中的过程较为缓慢 需要一定的时间 从录像中观察一般 需要l 3s 原因在于整体柱存在一定的压降 横向同组的三张图对比可得 毛 细管与试样溶液接触时间对试样引入区带没有明显影响 在毛细管电色谱整体柱上 我们实现了不施加电压而是依靠表面张力的进样 方式 在色谱柱中引入的样品区带大小与溶液的性质 毛细管端i 1 的位置 毛细 管和液池移动方式以及端口液滴停留的时间相关 3 3 6 不同进样方式对应的信号图 本实验比较了电动进样模式和不加电进样模式下 1 0 击m 荧光素钠溶液在柱 床上 图3 1 7i 和空柱窗口 图3 1 7i i 检测获得的信号图 图3 1 7 三种进样方式下荧光素钠溶液在柱床 i 和空柱 i i 检测信号图 l 和l 为不加电进样 2 和2 为电动进样 进样电压为 1 0 0 0v 进样时间1 0s 3 和3 为 电动进样 进样电压为 1 0 0 0 v 进样时间为1 5s 结合图3 1 7 中曲线2 3 2 3 及图3 1 2 记录的 1 0 0 0v 下进样时间为 1 0s 1 5s 的进样区带图片 可知进样区带越长峰高越强 结合图3 1 7 及表3 2 数据可得当进样量减小时 峰保留时间缩短 半峰宽减小 柱效提高 浙江大学硬士学位论文 第三章基于短毛细管的徽流控电色谱分离分析系统的研究 3 3 7 两种荧光染料的分离 含c 1 3 的整体柱可作为反相固定相用于极性较弱的物质分离 本实验前后使 用了四种荧光素染料f i t c 荧光素钠 吖啶橙 a o 和罗丹明b r b 结构 式如图3 1 8 所示 实验最初选择了f i t c 与r b 的混合溶液进行分离 f i t c 的 最大激发波长为4 9 0 4 9 5n l n 最大发射波长为5 2 0 5 3 0n n l r b 的最大激发波 长为5 7 0n n l 最大发射波长为5 9 5 6 0 0n l n r b 在本检测系统中信号较低 同 浓度的r b 只是f i t c 信号强度的约1 1 0 因此将r b 更换为a o 最大激发波长 为4 9 5n m 最大发射波长为5 2 6a m 后者的荧光发射波长与f i t c 接近 两者 信号强度相当 但由于f i t c 易光解峰形复杂 最后将其更换为荧光素钠溶液 最 大激发波长为4 9 0a m 最大发射波长为5 1 4n l n a f i t c o h h 3 c n 茎m n c h 3 g il a g h a c 吖啶橙 b 荧光素钠 a d 罗丹明b 图3 1 8 四种荧光素染料的分子结构图 将1 0 01 t l 的a o 溶液 1 0 巧m 与2 0 0g l 荧光素钠溶液 1 0 6m 混合 试样中a o 浓度为3 3l t m 荧光素钠的浓度为0 6 6g m 图3 1 9 为该混合试样分 浙江大学硬士学位论文 第三章基于短毛细管的微流控电色谱分离分析系统的研究 离图谱 在总长3c m 的色谱柱两端施加电压1 5 0 0v 流动相为8 0 乙腈溶液和 2 0 t r i s h c i 缓冲液的混合液 2 0c m 处柱床上直接检测 光电倍增管负高压为 5 5 0 v 在改进后的自动进样控制程序下 选择进样时间1 0s 进样电压与分离 电压相等为 1 5 0 0v 皂 母 t 疗 c o q o 叱 l l j 囹3 1 9 两种荧光素染料分离图 荧光素钠的理论塔板数为1 5 0 7 9 m a o 的理论塔板数3 1 3 1 m 在长时间操 作后发现流动相液池中乙腈挥发 观察到a o 的出峰时间延长 峰展宽 因此在 实验过程中 需要向液池中及时添加流动相 a o 对流动相组成敏感 需要保持 高比例的乙腈相 荧光素钠为离子性化合物 在色谱柱上几乎没有保留 其出峰 先