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生命科学综合实验 2 向鹏程 1353357 Abstract miRNA 是一类长 20 22 的小分子非编码 RNA 它可以与靶基因 mRNA3 非翻译序列结合从 而促进靶基因降解或抑制翻译过程 进而抑制靶基因的表达 本实验通过 6 个连续实验 经过克隆以及相关蛋白和核酸分析 来进一步了解 miRNA 的功能 理解并掌握基因工程的 基本思路和分子生物学 细胞生物学的核心技术 Keyword miRNA 194 western blot RT PCR DNA 抽提 RNA 抽提 蛋白质抽提 MTT 实验 pSuper 载体 shRNA 转染 Introduction miRNA 参与生物体的生长 发育和凋亡的调控 并在疾病发生和发展过程中起着重要作 用 基于 miRNA 所产生的多种多样的生物学功能 近年来对 miRNA 的研究成为科学研究 的热点之一 克隆获得特定的 miRNA 是研究其功能的前提 重组质粒经测序验证后经过质粒抽提 进 而转染真核细胞 基于本实验涉及的质粒 pSuper 带有 EGFP 标记 可以在荧光显微镜下观 察转染效率 通过 MTT 实验检测 microRNA 194 过表达对细胞活力的影响 通过 RT PCR 检 测 microRNA 194 对其特定靶基因的表达调控 进一步在蛋白水平通过 Western Blot 进行验 证 本综合实验 microRNA 194 的克隆与功能分析涉及基本的生物信息学 基本的分子生物 学实验技术和基本的细胞生物学实验技术 其包含了 6 个连续的实验 1 人工合成 shRNA 与 pSuper 载体的体外连接与转化 2 质粒 DNA 的抽提与鉴定 重组质粒 DNA 序列测定 3 转染真核细胞 MTT 法检测对细胞活力的影响 4 RNA 的抽提纯化及逆转录 PCR 扩增目的基因 5 Western blot 对特定蛋白表达的检测 Materials 细胞株细胞株 人胚肾 293 细胞 质粒和菌株质粒和菌株 pSuper 载体和 E coli DH5 分子克隆及转染试剂分子克隆及转染试剂 限制性内切核酸酶 连接酶试剂盒 LB 固体 液体培养基 质粒抽提试剂盒 Lipofectanmin2000 MTT DMSO Biowit 钙转试剂盒 细胞培养试剂细胞培养试剂 DMEM HG 小牛血清 胰酶 EDTA 100 双抗 RT PCR 实验试剂实验试剂 无 RNA 酶水 Trizol 试剂 氯仿 异丙醇 无水乙醇 甲醛变性电泳缓冲液 RNA 电泳用加样缓冲液 逆转录反应试剂盒 dNTP mix RNase Inhibitor PCR kit 试剂盒 oligo Dt 电泳缓冲液 5 TBE SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳及聚丙烯酰胺凝胶电泳及 Western 印记法试剂印记法试剂 PMSF 苯甲基磺酰氟 SDS 十二烷基磺酸钠 丙烯酰胺 N N 亚甲基甲叉双丙烯酰胺 TEMED N N N N 四甲基乙烯二胺 溴酚蓝 BPB 碱性磷酸酶标记羊抗鼠 Actin PVDF 膜 分子量标准蛋白 BCA 蛋白测定试剂盒 Content 1 人工合成 shRNA 与 pSuper 载体的体外连接与转化 载体酶切 双链 shRNA 的体外退火 载体与 shRNA 的连接 感受态细胞制备与转化 步骤 1 载体酶切 本实验室提供已经双酶切的质粒载体 2 双链 shRNA 的体外退火 干粉 oligo 引物呈粉末状 离心后稀释至 100 mol L 1XPCR 缓冲液为 退火缓冲液 体系如下 10XPCR 缓冲液 5 L 正向 oligo 5 L 反向 oligo 5 L ddH2O 35 L 反应体系 50 L 混匀后置 95 保温 10min 然后自然冷却到室温 3 载体与 shRNA 的连接 酶切质粒电泳 酶切质粒与退火的 shRNA 混合 连接反应 反应体系 shRNA 3ul 酶切质粒 2ul solutionI 5ul Solution 3 1ul 反应条件 16 保温 0 5 小时 20 冷冻保存 4 感受态细胞制备与转化 实验组 阳性对照组 阴性对照组 100ul 感受态菌液与 100ul 感受态菌液与 100ul 感受态菌液与 10ul 连接产物混合 1ul pSuper 混合 1ul 连接液 休克反应 加入 kana LB 液体培养基 500 l 37 复苏 45min 离心后去上清 剩余 200ul 混悬细菌 全部涂布于抗性平板 37 培养 16h 反应条件 置 42 水浴热休克 90sec 迅速取出 置于冰水浴中冷 2 质粒 DNA 的抽提纯化 鉴定及测序 2 1 质粒的快速提取 接种细菌 培养过夜 取 1ml 培养物离心 弃上清 溶液 P1 悬浮 震荡静置 P2 轻微颠倒混匀 P3 轻微摇动 离心 上清加入层析柱中 离心 弃流出液 加漂洗液离 心 该步骤重复一次 弃流出液 离心 换套管 加洗脱液 静置 离心 收集流出液 nanodrop 测浓度 1 取 1 5 ml 过夜培养的菌液 加入离心管中 5 000 rpm 5 分钟 尽量吸除上清 2 向留有菌体沉淀的离心管中加入 250 l 溶液 P1 5ml 菌液 使用移液器或涡 旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀 3 离心管中加入 250 l 溶液 P2 5ml 菌液 温和地上下翻转 6 8 次使菌体充 分裂解 注意 温和地混合 不要剧烈震荡 以免打断基因组 DNA 造成提取的质粒中 混有基因组 DNA 片断 4 向离心管中加入 350 l 溶液 P3 5ml 菌液 立即温和地上下翻转 6 8 次 充分混匀 5 000 rpm 20 分钟 5 将上清液转移到吸附柱 CP3 中 12 000 rpm 1 分钟 弃废液 将吸附柱 CP3 放 入收集管中 每 5ml 菌液一个吸附柱 6 向吸附柱 CP3 中加入 500 l 漂洗液 WA 12 000 rpm 1 分钟 倒掉收集管中 的废液 将吸附柱 CP3 放入收集管中 7 向吸附柱 CP3 中加入 700 l 漂洗液 WB 12 000 rpm 1 分钟 倒掉收集管中的 废液 8 将吸附柱 CP3 放入收集管中 12 000 离心 1 分钟 目的是将吸附柱中残余的漂 洗液去除 注意 漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应 酶切 PCR 等 实验 为确保 下游实验不受残留乙醇的影响 将吸附柱 CP3 开盖 置于室温放置数分钟 以彻底晾干吸 附材料中残余的漂洗液 9 将吸附柱 CP3 置于一个干净的离心管中 向吸附膜的中间部位滴加 50 l ddH2O 60 室温放置 2 分钟 12 000 1 分钟将质粒溶液收集到离心管中 注意 洗脱液的 pH 值对于洗脱效率有很大影响 若后续做测序 需使用去离子 水做洗脱液 并保证其 pH 值在 7 0 8 5 范围内 可以用 NaOH 将水的 pH 值调到此范围 pH 值低于 7 0 会降低洗脱效率 且 DNA 产物应保存在 20 以防 DNA 降解 2 2 琼脂糖凝胶电泳检测 配胶 取样加缓冲液 加样 紫外照射 观察结果 3 转染真核细胞及 MTT 法检测对细胞活力的影响 3 1 真核细胞转染 脂质体转染法 1 铺细胞 i 吸去培液 用 PBS 溶液洗一遍 ii 加入胰蛋白酶 EDTA 溶液消化 于 CO2 培养箱放置 3 5 分钟 iii 用手掌轻敲培养瓶侧面 若细胞呈均匀的细沙粉状表明已消化完全 否则 再消化片刻 iv 加入适量细胞培液终止消化 v 反复吹打将细胞吹成单细胞 vi 计数 按每 60mm 培养皿 0 6 1 0 106 个细胞铺 2 个皿 2 细胞转染 i 配制转染混合物 A DMEM DNA 混匀 B DMEM 脂质体 ii 将等体积 B 液逐滴加入 A 液 同时轻弹管壁 iii 将此脂质体 DNA 混悬液转移至单层细胞上的培养液中 iv 轻轻摇动培养皿混匀 注 可以观察到滴入的部位培养基瞬间会出现浑浊的 橘黄色 应尽快将其混匀 v 置于 37 5 CO2 培养箱中培养 vi 转染后 3 6 小时 可换液 3 换液 转染后 6 8 小时 弃去培养皿中含有沉淀的细胞培养液 加入新鲜培养液继续培养 4 收获细胞 继续培养 36 48 小时后收获细胞 3 2 MTT 检测细胞活性 1 接种细胞 i 细胞用胰酶消化成单细胞 ii 计数 iii 用培养液配成单细胞悬液 以每孔 2x104 4x104 个细胞接种到 96 孔板 每 孔体积 100ul 每组 6 个孔 2 培养细胞 细胞培养 1 天 根据实验目的和要求决定培养时间 3 转染 处理时间 48h 4 呈色 换液后 每孔加 MTT 溶液 5mg ml 用 PBS 配 20ul 5 终止培养 i 孵育 1 小时后 小心吸弃孔内培养上清液 ii 每孔加 150ul DMSO 振荡 10 分钟 使结晶物充分融解 6 比色 i 选择 490nm 波长 在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值 ii 记录结果 以处理组为横坐标 吸光值为纵坐标绘制细胞活力柱状图 4 RNA 的抽提纯化 鉴定及 RT PCR 4 1 RNA 的快速提取 1 倒出 HEK293 细胞培养液 1 PBS 清洗 3 次 2 每 10 cm 2 或 107 培养细胞中加入 1 ml 的 Trizol 水平放置 10min 并不时晃 动培养皿充分裂解 对于贴壁牢固的培养细胞可用细胞刮勺剥离细胞 3 将裂解液转移至离心管中 室温静置 5 分钟 4 加入氯仿 0 2ml 剧烈振荡 室温放置 10min 12000rpm 15min 取上清 离心后溶液分为三相 即上层的水相 下层的有机相以及中间的变性蛋白 小心 吸取上层相 绝不能有中层蛋白混入 5 加入异丙醇 0 5ml 振荡混匀 室温放置 10min 12000rpm 10min 弃上清 加入 50 的异丙醇沉淀核酸 异丙醇的用量应与以上所取上清液的体积相当 6 1ml 75 乙醇洗涤沉淀 12000rpm 5min 重复一次 7 空气干燥沉淀 溶解于 20 l DEPC H2O 留样 2 l 其余 70 保存备用 4 2 紫外分光光度计检测纯度和含量 1 RNA 的纯度与含量检测 紫外分光光度法 高纯度 RNA 的 A260 A280 应处于 1 6 至 1 8 之间 A260 与 RNA 浓度呈正比 1 OD 40 g ml RNA RNA 浓度 g l A260 40 稀释倍数 1000 Nano drop 检测仪直接读数 2 RNA 定量 加 1 5 l RNA 溶液于 Nanodrop 仪检测 读取 260nm 与 280nm 的吸 光度数值及 RNA 浓度 4 3 RNA 中性琼脂糖凝胶电泳检测 1 制备琼脂糖凝胶 首先将 0 5g 琼脂糖溶化于 32ml 水 冷却至 60 加入 5 甲 醛变性凝胶电泳缓冲液 10ml 37 甲醛水溶液 9ml 混合均匀并灌制胶板 2 取 1 l RNA 溶液 加入甲酰胺 上样缓冲液 9 l 95 变性 5 分钟 迅速冰浴冷 却 点样 3 150V 电泳 30 分钟 紫外灯下观察电泳结果 4 4 逆转录 RT PCR Takara RT kit 如下加入试剂 加满至 10 l 总 RNA0 5 g 5X Primescript RT master mix 2 l DEPC ddH2O X l 4 5 基因的普通 PCR 扩增 5 WESTERN BLOT 检测蛋白质的表达与含量 5 1 蛋白样品的制备 1 裂解 100mm 培养皿 450 l 裂解液 组织样品 1 5 10 4 15000g 离心 1 小时取 上清 2 蛋白定量 Bradford 法 3 根据样品蛋白浓度加入 Laemmli 样品缓冲液 100 加热 3 5 分钟 10000g 离心 10 分钟 取上清 5 2 蛋白定量 BCA 法 1 5ml 离心管离心管ddH2O l 2mg mLBSA l 蛋白质终浓度蛋白质终浓度 g mL A0 50 标准品 2000 B125 375 标准品 1500 C325 325 标准品 1000 D175 175B 管混合液 750 E325 325C 管混合液 500 F325 325E 管混合液 250 G325 325F 管混合液 125 H400 100G 管混合液 25 I40000 blank a 配置 BCA 工作液 依据样品数量 将试剂 A 和试剂 B 按体积比 50 1 配置适量 BCA 工作液 并充分混匀 b 标准品及样品的测定 A 分别取 25 L 上表中新鲜配置的 BSA 标准液和待测样品 加入到微孔 板中 B 每孔中加入 200 LBCA 工作液 并充分混匀 C 加盖 37 孵育 30min 后冷却至室温 D 以 I 号管调零点 于 565nm 处测定各管吸光度 E 以吸光度为纵坐标 蛋白质含量为横坐标 绘制标准曲线 计算样品 蛋白质浓度 5 3 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 1 制胶 2 上样 电泳 上层胶 60 80V 下层胶 100 120V 5 4 转膜 a 装好 三文治 夹板 在转膜缓冲液内操作 不要有气泡 次序 负极 海绵 滤纸 胶 膜 滤纸 海绵 正极 b 装好转膜设备和内置冰袋 c 300mA 恒流 2h 转印 5 5 总蛋白丽春红染色鉴定转膜成功与否 a 转印结束后取出印迹膜置于丽春红染色液中 并在室温下搅动 3 5min b 将膜放入 PBS 洗数次 每次 1 2min 并且更换 PBS c 根据需要将转印部位和分子量标准位置进行标记 剪膜 5 6 膜的封闭余抗体杂交 1 封闭 1 1 RT 洗膜三次 去除 SDS 1 2 加入封闭液内 RT 1 2h 2 孵育一抗 2 1 将封闭后的杂交膜放入杂交袋中 加入稀释的一抗 2 2 1XTBST 洗膜 10min X 3 次 3 孵育二抗 3 1 将洗好的膜封入稀释好的二抗中 RT 1 2h 3 2 1XTBST 洗膜 10min X 3 次 5 7 检测 ECL 发光法发光法 1 工作液配制 A B 试剂 1 1 混合 2 发光 在暗示将杂交后印记膜放入显色盒中 将混匀的工作液平铺在二抗杂 交后的膜上 约 1 5min 吸去多余显色液 用透明玻璃纸覆盖膜 在表面覆盖 胶片 3 暗室曝光 1 5min 4 取出胶片 显影 定影 Result and discussion 实验 1 载体与质粒连接较成功 转化过程中要注意对照组的设立 因为转化结果受连接 效率和转化效率的双重影响 如果转化失败 难以分析原因 阳性对照可检验转化效率 阴性对照可防止受体菌出现抗性污染 连接载体时应该尽量延长连接时间和适当提高温度 以提高连接效率 实验 2 nanodrop 检测 DNA 浓度为 645 ng L AD260 AD280 值为 1 89 结果较好 电泳结果 图中四号泳道为我和组员的电泳图 有少量 DNA 开环 但结果较好 注 由于试验中全班洗脱试剂先加了 WB 为验证实验 wa 与 wb 的顺序有必要 在过 wb 后我又加了 wa 洗脱以验证 结果显示 DNA 洗脱出来浓度正常 但是解离曲线相 差巨大 由此可见 实验过程中 wa 与 wb 的加入顺序很重要 可能与 wb 中的乙醇有 关 实验 3 转染真核细胞转染真核细胞 DNA 脂质体转染法转染 293 细胞 绿色细胞为表达增强型绿色荧光蛋白的细胞 见转 染较成功 MTT 检测细胞活力检测细胞活力 本组 293 细胞转染后 96 孔板 MTT 实验结果数据 活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶能够 代谢还原 MTT 同时在细胞色素 C 的作用下 生成蓝紫色不溶于水的 Formazan 加入 过氧化氢可使细胞破坏 Formazan 生成数量减少 检测活力下降吸光度值下降 实验 4 RNA 抽提结果抽提结果 电泳 吸光度 0 053空白管 0 054 平均 0 0535 0 582未加入过氧化氢 0 643 平均 0 6125 0 413加入过氧化氢 0 443 平均 0 428 左边第 3 泳道为我们的实验结果 三条条带从上到下分别为 28s 18s 的 rRNA 以及 5s 5 8s 的 rRNA 与 tRNA 可见 少量 RNA 已经降解 可能与操作过程有关 RNA 定量定量 RNA 浓度为 275 2ng l OD 值为 1 87 较好 RT PCR 实验失败 原因可能与实验过程中无菌操作不规范 过程中加热不充分等导致 RNA 降解有关 实验 5 蛋白质定量蛋白质定量 表中折线图分别采用的是 AB 两行的数据 R 平方分别是 0 9926 和 0 979 标准曲线 非常合理 表格中第十列为样品的吸光值 其中第三行为我的数据 由于标准 液配制过程中出现差错 导致结果不标准 且样品为稀释十倍后的稀释液 由 曲线方程可得样品浓度大致为 705 g mL 浓度较高 WesternWestern BlotBlot 由于洗脱过程不够 致使显影成模糊像 但可看见 GAPDH 中约为 45KDa 转染 成功 可见 gfp 显影特别清晰 可见明显的条带 ConclusionConclusion 1 成功构建了含有 shRNA 的 pSuper 载体 经酶切鉴定 结果显示构建正确 2 获得了转染成功的 293 细胞 3 通过一系列实验检验并正确解释 microRNA 194 的预期功能 AppendixAppendix 目的基因 第一组基因 Homo sapiens SET domain containing lysine methyltransferase 8 SETD8 transcript variant X3 mRNA Sequence 5 3 Template strand LengthStartStopTmGC Self complementarity Self 3 complementarity Forward primer CTTCCATCGCAGCCATTCAACPlus2111013060 2052 385 003 00 Reverse primer CCGCAATAACTGCAAACGCTMinus2021019160 1150 005 002 00 Internal oligo Plus Product length 101 SETD8 a protein lysine N methyltransferase that monomethylates both histones and non histone proteins Methylates K20 of histo