RNA 提取.doc

RNA 提取（1）细胞中总RNA 的提取：1，细胞培养物，快速吸弃培养液，在每个培养皿中加1ml Trizol试剂裂解细胞，并于室温静置5min后转移至离心管中；2，加入0.2ml 4预冷的氯仿，上下颠倒混匀，室温静置2-3min；4，12，000g，离心15min；3，将上清转移到新的离心管中，加0.5ml预冷的异丙醇混匀后，室温静置10min；4，4，12，000g，离心15min后，弃去上清，保留沉淀，5，加75%的冰乙醇1ml，振荡重悬沉淀后，4，12，000g，离心5-7min；6，弃去上清，室温干燥沉淀；用180l无RNase的水溶解RNA。（2）总RNA 中残留DNA 的消化：7，在总RNA中加20l 10X DNase缓冲液(1M NaAC，50mM MgSO4，pH5.0)，加20个单位的无RNase的DNase I，室温作用30min；8，加100l苯酚和100l氯仿，并加20l的3M NaAC(pH5.2)必须加，因为RNA量很少，上下颠倒混匀；9，重复上述纯化步骤（3-6）；10，最后将RNA溶于一定量的无RNase的水中。测定260nm，280nm处的吸收值，计算RNA浓度。蛋白抽提 细胞样品的制备参照文献61进行。贴壁细胞，用PBS快速冲洗3次，加一定量高KCl 裂解液，其中添加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂，室温裂解5-15min左右（视细胞裂解情况而定）。细胞裂解物和组织裂解物冰上超声裂解（强度18-22%,2次，每次6s），冰上孵育30min后，4，12，000g，离心15min，去除细胞碎片。随后取1l裂解物进行BCA蛋白定量（按BCA蛋白定量试剂盒说明进行），其余细胞裂解液加SDS loading buffer，100煮3-5min蛋白变性制样, 冰上孵育40min后-20保存。Western blotWestern blot分析按BM Chemiluminescence Western Blotting Kit提供的试剂操作说明进行,具体操作步骤如下：1，将蛋白样品100煮3-5min，冰上孵育快速冷却后12，000rpm 离心5min后取5-10l样品（每个泳道上样10-50g）进行8-15%的SDS-PAGE；2，胶上的蛋白电转移至PVDF膜，400mA冰浴转移100min（两个电转槽，四块膜）；蛋白带负电荷，顺序是负极（黑色）/滤纸/胶/膜/滤纸/正极。3，拆膜后，用铅笔标记1，2，3，4等，然后TBS洗2两次，每次5min除甲醇。4，PVDF膜在1% 酪蛋白封闭液中于室温封闭1h；5，PVDF膜在0.5%封闭液稀释的一抗中于4过夜；6，PVDF膜用TBST（TBS+0.1% Tween 20）洗膜2次，每次10min；7，用0.5% 封闭液洗膜2次，每次10min；8，PVDF膜用0.5% 封闭液稀释的二抗（Anti-mouse IgG-POD/anti-rabbt IgG-POD 或anti-Goat HRP）室温孵育60min；9，PVDF膜用TBST洗膜4次，每次15 min；10，按 100：1的比例将Luminescence substrate solution A和Starting solution B混合，将PVDF膜浸入