核糖体蛋白质的翻译特异性― 遗传密码翻译装置对信使RNA的选择性1).pdf

通 传 H ER ED I T AS B e i j i n g 1 1 2 4 0 4 4 1 9 8 9 核糖体蛋白质的翻译特异性 遗传密码翻译装置对信使 R N A 的选择性 童 克 忠 陈 玲 爱翁 曼 丽 王 玮 白 应 林 中国科学院遗传研究所 北京 气且写孟5扩 叭少不卜卜 叨 叻奋 戈叻 护 尽冬冬 摘要 分子遗传学泰斗 J D Wa t s o n于 1 9 5 7 年首先对核糖体进行系统的研究 其后0 许 多 科学家的共同努力 核糖体的结构已经基本研究清楚 然而对核糖体蛋白质的确切 功能 却仍然一无所知 1 9 7 9 年 以来 本实验室主要从事分离核糖体蛋 白质 突变体 研 究核糖体蛋白质突变对基因表达的影响 发现在 S 1 2突变体中 碱性蛋白酶活性下降 而中性蛋白酶活性正常 到目前为止 我们分离鉴定了的枯草杆菌核糖体蛋白质突变体 总数居世界首位 我们研究了核糖体蛋白 质突变对噬菌体基因组表达的影响 发现在 S 1 2的依赖链霉素突变体中 噬菌体 娜0 5裂解量下降 蛋白质合成受Pf 而 R N A和 D N A合成正常 测定了噬菌体 价2 9在2 7 种共 4 4 株核糖体蛋白质突变体中的成斑 率 在多 数突变体中 成斑率下降 最低达1 0 6 少数升高 最高达三倍 还百一些升降都 不明显 大汤杆菌 C 6 0 0的 S 1 2发生依赖链霉素突变 x 噬菌体的成5 k 率和相对产量 大大降低 而 T 4和 T 7的成斑率正常 大肠杆菌1 1 4 8 叹X c 1 8 5 7 的 S 1 2发生依赖 链霉素突变 肠1 8 5 7的诱导释放量大大降低 而T 4的成斑率反有所增加 在大肠杆菌 A 1 9野生型菌株中 I 噬菌体的N基因 表达正常 核糖体蛋白 质 S 1 0 S 1 6 S 1 9 S 2 0 和 L 3友生突变 能抑制N基 因表 达 L 2 1 L 2 5 L 2 4突变 N基 因不能表 达 L 2 7突 变 促进N基因表达 S 8 L 6 L 7 Z L 1 2 L 1 4禾 L 2 3突变 对N基因表达没有明显影响 把 N基囚克隆在质拉上 用功能互补的方法 测定N基 因表达的程度 结果清楚表明 S 1 2发生依赖链霉素突变 N基因不能表达 发生杭链霉素突变 却表达正常 综合以上 实验结果 可 见不 同的核糖体蛋 白质 突变时同一基因表达的影响不同 同一核糖体蛋 白 质突变对不同基因表达的影响也不同 还有一些核糖体蛋白质突变 对其他基因表达没 有明显的影响 核糖体作为一切细胞共有成分这一客观实在 充分说明它在生命活动中的重要性 核 糖体 既然如此重要 其蛋 白质的功能将是 多方面的 复杂的 本实验室己取得的研究 成泉 可能只是从一个侧面反映了核糖体蛋白质的功能 而且目前只是观察到一些现象 分于机理还不清楚 值得进一步研 究 一 核糖体的结构 一切生物的遗传信息 都编码 贮存于核酸的核昔 掀 顺序之中 核酸是惰性的 必须经过转录 翻译 其 蕴藏的遗传信息 才 能由蛋白质表达为丰彩多姿 生意 盎然的生物界 T o n g K e z h o n g e t a t Tr a n s l a t i o n a l S p e c i f i c i t y o f R i b o s o ma l P r o t e i n s T h e S e l e c t i v i t y o f T r a n s l a t i o n a l A p p a r a t u s T o w a r d s m R N A S 1 国家自 然科学基金资助项目 本文于 1 9 8 7 年 1 0月7日收到 一切生物的蛋白质 都在核糖体上合成 J D W a t so n 首先对核糖体进行系 统的研究r 1 1 3 其后 经过 许多科学家的 共同努力 对核糖体的结构大体上已经 研究清楚 原核生物的核糖体 由大小不等的两个亚 基构成 大亚基包含两种 R N A 和三十几种蛋白质 小 亚基包含 一种 R N A 和二十几种蛋白 质 真核生物 核塘体的结构与此相似 但比较大 对大肠杆菌的核 糖休研究得最为详尽 它的各种 r R N A 和各种蛋白质 的基因位置 一级结构 基本上都巳经研究清楚 各种 i R N A和各种核糖体 蛋白 质在核糖体上所处的位置 以及彼此相互联结的关系 都经过仔细的研究 目前 人们能够提取核糖体 在离体条件下将 各种 m R N A 翻译成相应的蛋白质 然而 对核糖体上各种组份 包括三种 r R N A 和五十几种核糖体蛋白 质的确切功 能 却 仍 然 n 乎 一无 所 知 二 枯草杆菌核糖体蛋白质 突变对基因表达的影响 六十年代初期 本实验室首先由 枯草杆菌 A T C C 6 6 3 3菌 株分离到依赖链霉素突变体 S tr 0 A t S tr A 菌落白 色 与野生型或抗链霉素突变体 S C r k A 的棕 色菌落 不同 2 其后经过进一步研究 证明这种白 色 S t r A都不形成抱子 抗金黄色葡萄球菌的抗生素产量 降低 碱性蛋白 酶活性降低 在 S tr R A中 上述各项指 标都和野生型无异t 3 4 3 当时已经证明细菌 S t r A 突 变是核糖体蛋白质 S 1 2结构基因 r p s L的突变 所以 上述实验结呆可以解释为突变 S 1 2影响碱性蛋白酶 抗生素和抱子形成等基因的表达 由于细菌基因组较大 而且碱性蛋白酶缺陷菌株 失去感受态 不易迸行深入分析 作者改用噬菌体进行 实 验 0 1 0 5是枯草杆菌的温和噬 菌体 以 丝裂霉素 C 1 EA g tn l 处理 1 0 5的溶源菌株 6 1 4 6 9帅1 0 5 1 0 5进 人裂解生长 每个细胞释放出 0 1 0 5 颗粒 以 A T C C 6 6 3 3 S t r D A作给休 对6 1 4 6 9 P 1 0 5 进行转化 得 6 1 4 6 9 帅1 0 5 S t r D A转化 体 将 6 1 4 6 9 9 5 1 0 5 S t r D A 涂布在无链霉素的完全培养基上 可分离到不依赖于 链霉素的回复突变休S t r tt 0 3 将6 1 4 6 9 P 帅1 0 5 涂布在 含有 2 5 0 5 0 0 pr g链霉素 M l 的完全培养基上 可分 离到抗链霉素的6 1 4 6 9 P 1 0 5 S t r R A t 1 3 用丝裂霉素 C 1 tt g m l 诱导0 1 0 5 结果 在 S tr D A S tr R A S tr 三 种突变体和野生型 6 1 4 6 9 帅1 0 5 中 1 0 5的 裂解量 分别为4 1 2 0 1 0 8 和 1 1 2 0 3 o S tr D A中 q5 1 0 5裂解量 的下降 显然不是由链霉素的生理作用引起的 因为 在 S t r R A的培养基中 也加了等量的链霉素 S t r A回 复突变为 S t r t 后 裂解量恢复正常 也证明 S t l A中 0 1 0 5裂解量的 下降是由 S t r A突变引起的 用 3 H 胸 腺 咤 咤 核有 H I 尿 嚓 咤 核 昔 和 1 C 1 混合氨基酸标记 D N A R N A 和蛋白质合成 结果 S t r R A不影响大分子合成 在 S tr T A r l D N A和 R N A 合成正常 蛋白 质合 成受到严重抑制二 S tr D A回复突变 为 S t r i p 蛋白质合成也恢复到野生型的水平 1 3 0 上 述实验所用 6 1 4 6 9 0 1 0 5 s t r D A 其 t D A是由 A T C C 6 6 3 3 s rr D A转化来的 所以在 6 1 4 6 9 帅1 0 5 S tr D A 中 除 r D A外 其遗传背景 和野生型几乎 完全相同 因此在 6 1 4 6 9 0 1 0 5 S tr D A中 0 1 0 5裂解量的下降和 蛋白 质合成受阻是 r p s L突变的结果 由 于 D N A和 R N A合成都正常 所以可以认为裂解量下降是蛋白质 合成受阻的结 果 是某些重要 riR N A 翻译受阴 的结 果 本实验室由 枯草杆菌1 6 8 菌株经 E M S诱变得 到 一些核糖体蛋白质突变体 表 1 6 3 和一株依赖链霉素 的 S D 1 0 3 o用 N T G 处理 S D 1 0 3 从中分离得到一 系列核糖体蛋白 质突变体 表2 t6 用表 1 2 中 所列 2 7 种共 4 4 株突变体为宿主 测定了噬菌体 0 2 9的成 斑率 结果列于表 1 和表 2 o 从表 1 和表 2的数据可 以看到 除在回 复体 6 2 7 1 1 5 0 和 3 2 上的成斑率高 于 1 6 8 的 以外 在其他回复 突变体和突变体上的成斑 率都降低 尤以 r p s D r p s E和 r p s H 最为显著 上述各种突变体 都是通过 E M S或 N T G诱 变得 来的 不能排除其他基因也发生突变的可能性 所以一 方面通过转导 选择和 十 s p c 连锁的转导体 将 r p s E r p s I 连同 r p s L转人 Q B 9 4 4 提取这些转导体 的核塘体蛋白质 通过聚丙烯酸胺凝胶电泳 证明这 些转导体都带有突变的 S 5或 S 9 另 一方面 又将 r p s L 和自 发抗链霉素突变 S tr R A 即 r p s L R 通过转 化 选择 c y s r p s L R或 c y s r p s L 转化体 转给 Q B 9 4 4 0用这些转导体或转化体为宿主 就可以在遗传背 景相同的条件下 比较r p s L 0 r p s L R r p s L o r p s E r p sL r p s I 对 0 2 9噬菌体成斑率的影响 实验结果见表 3 0 o 以 r p s L R 基因型为宿 主 无论培养基中 有无链霉素 0 的成斑率都与以野生型为宿主无明显差异 用 r p s L R基因 型为宿主 成斑率低到 0 8 r p s E突变 或 s 1 突变提高 r p s L 0的成斑率 但 不能回升到野 生型核糖休的水平 三 大肠杆菌核糖体蛋白质 突变对基因表达的影响 0 1 0 5 和 0 2 9的基因组虽然比较小 但都没有经 过详细的遗传学研究 因此不是最合适的研究材料 L a m b d a 幻 噬菌体则不然0 其 D N A顺序已 全部 分析清楚 它经过详尽的遗传学研究 有丰富的突变 体可资利用 在大肠杆菌 C 6 0 0 t h r l e u th e l a c t o s A s u p E S 1 2发生依赖 链霉素突变的 r p s L R中 A N a m 不能成斑 L c I 8 5 7成斑率降低 T 4 和 T 7的成斑率 保持正常 在液体培养基中 A a 和 i1LC I 8 5 i都不 衰 1 曦菌体 功 2 9在不两核抽体 班白质突空体中的成斑率 以在 1 6 8 1 r p C 2中的成斑率为 1 画画 习 鸯 艇 踌 娜 翻 娜 翻 恤 居 州 表2 曦菌 体 0 2 9 在 B s u b t i l i fi S D 1 0 3 r p s L 0 的 不同 回 翅 突 变 体 中 的 成 斑 率 以在 1 6 8 s r p C 2中的成斑 率为 1 测得在 S D 1 0 3 r p S I 0 中的成斑率为0 4 0 基因型 蛋白质b 回复体编号基因型 蛋白质 f P S C S 3 0 1 0 4 4 r p s a S 1 9 r p s D S 斗8 5 火1 0 3 2 3 r p l AB C L1 L 3 r p s D S 4 0 0 4 I I I r p l B L 2 r p s D S 4 1 1 只1 0 3 6 3 r p l D L 4 r p s D S 4 0 0 6 1 0 6 r p l F L 6 r p s D S 4 0 9 火1 0 3 8 0 r p l F L 6 r p s E S 5 0 2 8 1 1 4 r p 1 F I 6 r p s E S 5 5 5 火1 0 3 4 8 r p l H L 8 r p s E S 5 5 0 又1 0 3 9 9 r p l N L1 4 r p s E S 5 0 0 3 6 9 r p l l L1 6 r p s E S 5 0 1 0 1 5 9 r p l P L 1 6 r p s E S 5 1 4 丫1 0 一 7 1 r p i Q L1 7 r p s E S 5 0 2 0 1 2 7 r p l R L 1 8 r p s H S 8 1 0 又1 0 9 1 5 1 r p I R L1 8 r p s l S 9 3 0 2 1 5 7 r p l T L 2 0 r p s l S 9 0 0 1 5 5 r p l V L 2 2 r p s M S 1 3 0 5 7 4 r p l V L 2 2 r p s O S 1 5 0 3 1 1 5 0 r p l W L 2 3 r p s R S 1 8 0 4 5 3 2 7 0 多一斑点 r p s R S 1 8 0 2 5 a 因为全 部回复突变体由 S D 1 0 3 k r p s L D 发生基因间抑制突变而来 所以 全部回复体都携带另 一突变基 因 r p s L D b 基于和 同样的理由 都含有另一突变蛋白质 S 1 2 D 0 电泳图谱上多出一个蛋白质斑点 其基因未经鉴定 能增殖 大肠杆菌A 溶源菌株I 1 4 8 5 L 1 8 5 7 突变成 r p s L D后 A c 1 8 5 7的诱导释放大大降低 而 T 4的成 斑率反 有所增加E 8 3 由 于 A N a m 7 和 A N a m 7 N a m 5 3 也含有 1 8 7突 变 所以 A c 1 8 5 7和 I N a m只有一个 N 基因 不同 A c 1 8 5 7在 C 6 0 0 r p i L D上成斑率降低 在液体培养基中 不能增殖 就是 由于N基因的表达受 到抑制之故 大肠杆菌T 8 3菌 株 m 0 1 1 8 l a c Z U 1 1 8 t h i 无 s ii p E LN a m 7的N基因 有 a m b e r 无义突变 所以在 T 8 3 中 A N 7不能生长 在质粒 p E M B L I 的 S m a l 位点 插 人含 有N 基因的 4 4 6 b p H a e l l l 片段 得 p N 1 0 1 0 p N 1 0 1 的N基因可由 一未知的启动子启动表达 4 2 产生足量的N 蛋白质 供 LN a m 7 生长之用 N a o m i R F r a m k l in 私人通讯 质粒 p K C 1 0 1携有 c l 和N基 因 们 只要诱导N基因表达 就可支持 A N a m 7生长 按常规方法 I z 提取 p N 1 0 1 p K C 1 0 1质粒 D N A 转化 T 8 3及其 s L突变体 得表7 中 所列各种携有 质粒的菌株 按前已报 道的方法L 分别测定 L N a m 7 的成斑率和每个细胞中 L N a m 7颗粒的平均产量 结 果证明 S 1 2的依赖链霉素突变抑制 p N 1 0 1和 P K C 1 9 1上N基因的表达 1 0 0 T 8 3 p N 1 0 1 和 T 8 3 p K C 1 0 1 只能提供N 蛋白 质 所以不能支持 l o或 A Q的生产 以 A O a m 2 9和 劝a m 1 1 7进行实验 证明两 者都不能生长 农3 体 价 2 9在央空 S 1 2 S 5 S 1 2 S 9 S 1 2宿主中 的成斑率 菌株基 因 型突变蛋白质成 斑 率 Q B 9 4 4 Xc y 一 QB 9 4 4 c y s s s r Q B 9 4 c y s r p s L D S m QB 9 4 4 c y s r p j L R S m QB 9 4 4 c y s r p s L R 叼B 9 4 4 火2 7 6 QB 9 4 4 火7 0 QB 9 4 4 火5 1 QB 9 4 4 X 8 3 QB 9 4 4 火9 1 QB 9 4 4 X9 4 Q B 9 4 4 X 1 4 3 QB 9 4 4 X6 2 QB 9 4 4 又3 5 野生型核塘体 野生型核艳体 r p s L 0 r p s L R r p s L R r p s E r p r L I 同上 同上 同上 同上 同上 同上 r p s I r p s L 0 同上 野生型 野生型 S 1 2 D S 1 2 R S 1 2 R S 5 S 1 2 0 同上 同上 同上 同上 同上 同上 S 9 S 1 2 D 同上 1 1 0 0 8 1 0 3 1 0 9 0 5 5 0 7 1 0 4 6 0 61 0 8 8 0 2 7 0 8 3 0 6 7 0 6 9 a 培养基中含2 0 0 p g 了 m l链母素 b 表中回复突变体编号 见表 2 余类推 农4 X c 1 8 5 7在 A1 9及盆突变体中的成斑率和单细胞曦 体产f 细菌菌株改变的核塘体蛋白质 成 斑 率单细胞噬菌休产量 A1 9 VT VT2 0 6 VT2 6 5 VT4 2 0 VT44 2 VT49 3 VT5 1 7 VT54 9 VT5 6 7 VT5 9 3 VT5 9 4 VT5 9 7 VT60 0 VT61 1 V r6 0 l VTG1 6 VT61 4 VT61 7 VT71 1 VT71 5 V T71 6 V T97 8 VT91 4 V T9 9 0 VT9 8 2 VT97 7 VT61 3 野生型 w i l d t y p e S8 t 6 I L6 L7十L1 2 S 2 0 S21 十U S L3 3 L1 4 L2 4 L2 7 L3 S1 9 S1 6 S1 0 S 5 S 5 L2 4 S4 S 4 L 2 4 S 4 L2 4 S4 L6 L2 4 S4 L6 L2 4 S4 L6 L2 4 无 L 1 n o L I 无 S 3 n o S 3 S3 L2 2 S 3 S1 8 L1 9 L2 4 S3 S1 8 L6 L2 4 L2 7 弥 S 1 8 1 2 4 1 0 0 8 9 0 6 4 0 74 0 7 4 1 0 1 0 7 2 0 6 3 1 0 4 3 5 6 0 4 3 0 2 7 0 2 8 0 7 4 0 8 4 0 4 0 0 9 5 0 3 9 0 4 2 6 0 火1 0 2 0 又1 0 7 1 0 6 1 0 1 1 0 3 因此各种核搪体蛋白质基本上保持等分子合 成 在细胞质中 不会有很多多 涂的 游离的核糖体蛋 H质 上述实验结果虽然涉及两种细菌共 3 2种核塘 体蛋白质的基因突变 但突变了的蛋白质仍然是作为 核搪体的组成部分而起作用的 不是作为游离的蛋白 质而起作用的 核 塘体蛋白 质衫响某些基因表达的分子机理 至 今仍不明白 枯草杆菌S 1 2 的依赖链霉 素突变不影响 D N A和 R N A合成 而蛋白 质合成 大大降低 所以作 用可能发 生在翻译水平 但所用的分析方法不够 精细 仍需用其他方法进一步确证 综合上述已有的实验结果 可见不同的核 L id 体蛋 白质突变对同一基因表达 a l 影响不同 有的降低 最低 达 到 l u 1 1 0 1 有的升i 最高可达 6 倍 与此相 仿 同一核糖体蛋白质突变对不同基因表达的影响 也 不相同 Y il 如E c o l i 1 1 4 8 5 Ac1 8 5 7 S l 2依赖链霉素 突变 使 又 的基因表达降低 而 T 4的基因表达上升 还 有一 4 核V i 体蛋白 质发生突变以后 对基因表达 没 有明显的影响 参考文献 童克忠等 1 9 6 3 科学通报 1 0 月号 5 3 0 童克忠等 1 9 6 5 微生物学报 1 1 5 4 4 5 S 3 童克忠 1 9 7 7 遗传学报 4 4 3 1 6 3 1 9 翁曼丽等 1 9 8 0 遗传学报 7 4 3 1 2 3 i 3 童克忠等 1 9 8 6 科学通报 3 1 3 0 1 3 0 4 白应林等 1 9 8 5 遗传学报 1 2 2 1 0 2 1