异丙酚对大鼠局灶性脑缺血再灌注时_省略_Caspase_3基因表达的影响_冯春生.pdf

456 由坐 度醉堂杂志2以断年5月第 肠 卷第 5 期 c 拉 JA n es山esio l M即2既 vd 肠 N 5 重症医学 异丙酚对大鼠局灶性脑缺血再灌注时 NF 一 沼 活化和 B e l 一 2 Ca sp as e 一 3 基因表达的影响 冯春生 麻海春 岳云于洋王 云 摘要I 目的观察异丙酚对大鼠局灶性脑缺血再灌注时 NF 一虑 的 活化和B c l 一2 c a sPa s e一3 基因 表达的影 响 并探讨其脑保护的机制 方法9 0只雄性Wi st a r大 鼠 采用大脑中动脉线栓法建立局灶 性脑缺血再灌注模型 随机将大 鼠分为假手术组 缺血再灌注组 u R 和异丙酚组 缺血 前r o mi n 腹腔 注射异丙酚 10 0mg 吨 一 各组根据再灌注时间不同又分为缺血 Z h再灌注2 3 6 1 2 2 4 7 2 h 亚组 每亚组各 5 只大鼠 于再灌注2 6 1 2 2 4 h 采用免疫组织 化学染色法分析 NF 沼的移位 蛋白质印迹 法检测 NF 虑的表达量 于再灌注3 6 2 4 7 2 h 采用原位 杂交法法检测脑组织B c l 一2 mRNA c a spa s e一3 m R N A 的表达 于再灌注 2 4 h作神经 功能缺陷评分及苏木精 一伊红 HE 染 色观察缺血皮 层组织形态 学变化 结果与假手术组比较 I R 组缺血侧大脑皮层 NF沼 于再灌注 2 一 2 4 h 明显从细胞浆移位 于细胞核内 NF 沼和B c l 一Z mR N A c as Pa s e一3 m R NA 的表达量增加 尸 0 0 1 大鼠神经功能缺陷评分 升高 尸 0 0 1 组织形态学观察可见皮层水肿 淤血 神经元变性坏死 与 I R 组比较 异丙酚组 NF B 从细胞浆 向细胞核的移位被抑制 NF 沼和 Ca spa so3mRNA 的表达量减少 尸 0 0 5 B c l 一2 m RNA 的表达量增加 尸 0 05 神经功能缺 陷评分降低 尸 0 05 缺血大脑皮层组 织形 态学损 伤减 轻 结论异丙酚的脑保护作用可能与其抑制 NF 沼的活化 上调B c l 一2 基因 和下 调 ca spa s e一3 基因的表 达 从而抑制神经组织细胞凋亡有关 关键词 二异 丙酚 脑 缺血 再 灌注损伤 NF 妞 基因 B c l 一2 半胧氨酸内肤酶类 E6 沁et o f Prop of olo n activ ation o fNF 一d and t h eexPre时o n o f Bel 一Z a nd Ca SPa se 一3 g en ei n cer ebr a c o r t ex 肠 wing t i叨tf o cal c e reb 旧 i s che a r eP er f山io n加r at s FE刀G C h sh e n g 赫IH a 乡c h u n 班 E K切 e tJ 刀甲a材斌记刀 o fAn e sth忍3沁Z昭了 B ei j i 刀召 人口 犷 了峭 刀b印h a l 即i t al U n滋r s勿o f M七d衣 al 反 及女 动召 10 X 20 C h in a A bs t ra etl o 讨伙 v eT o in v e st igateth eef f eet pr op of o l on 奴 a c6 v而 o f NF B a n d 止e ex pres sio n o fBel 2 and Ca s pa s e一3 g en e i n ee rebraleo r t e x 曲 er t r a n sient f o ea le er ebr a l is ehemia r epe而sio n I R a nd t h e po s sib l e m e ehan ism M etbo d s Nin et yhe althyma l e 私 s t a r r ats a罗d 3一4 mo nthsweig hin g250 一3的g w e r e r a n d o mly divsdedin t o 3gr o ups n 30 e aeh 脚 up 1 oha moper at io n 脚叩1 1 1 R a n d 脚即 1 1 1 pr opo f ol I R T h e 丽m 日 5w e r e anest het iz ed 初t h in t r ape五to neale扭or a l hyd r ate30 0m g kg 一 玩f t eo n u n o n inter na l a nde x ten扭I e a r o 6d a r t e石es Ce A Ie A ECA w er eexposed Mid dl e e er e br a l ar ter yoe eh is咖 MCAO wa s 卿d u e记 b y in ser t ing 呵I O n thre a d 0 2 6 一0 2 8 m m ind i anl ete r a n d4 0 em inle ng t hin t o ICA a n d adv anein g it er ania l lyunt il r es i st a ne e w a s f elt A f t e r 2hMCAOt h enyf on th r e ad wa swithd r a w n t o a l l ow 比p er f usion In n r o po f ol 脚 up 卿p ofbll0 0 mg kg 一 w a s g i v en 护 10 而 n be f ooMCAo 仆 ea币m 目s r ede eapitatedar Z 3 6 12 2 4a nd 7 2h of op er f usion n 5 are aeh t im e 即in t in ea eh 脚 up T h eir br ain s wer e imm edia t e l y r em o ved f o r deter n 刀 n ation o f t ransloea t i o nof NF B int h ene u r o n s 场 im m u n o一hist oehem ist r y a ndexn r ess ion O f NF KB in eer e br a leo r t e x 场 跳s t e m bI Ot t i ng The e xpr e s si o n o f Bel 一2 m R NA a n dCa印a se 一3 m R N Ain e eo br a leor to w a s de t n e d 场 i nsit u hybr idizatio n N eurologiea l de f i eit w a ss e or e d a n dmier o seopiee x a m in ation O f is ehe而e e er ebraleo r tex w a s per f o r m ed a t 2 4 h of r e per f u sion R e su l t SInl R 脚 up 1 1 NF 一 B w a s51脚f ie a lltly t r a n slo ea ted f r o m ey topla s m in t o the n u eleus O f t h eneu r ons int h e is ehemie eer e br a l e o r t e x d而ngZ 一24 h of 作者单位 1侧刃20 北京市 首都医科大学附属北京朝阳医院麻醉科仁冯春生 现在吉林大学第一医院麻醉科 岳 云 于洋 王云 l 吉林大学第一医院麻醉科 麻海春 通信作者 岳云 10 以 2 o 北京市 首都医科大学附属北京朝阳 医院麻醉科 E 一 l YU Y U N ho tma i l m 中华麻醉学杂志 20 06 年5月第 2 6卷第5期 Cbi nJ Ma vZ X 6 V ol26 No 5 r ep e而sion wh ilein n o n一isehem ie e o r t e x NF Bwase or击n e d tothe e y t o P l a sm T h e oP r essio n O f NF 一 B Bel 一2 m RNA a nd Ca sPa se 3 m R NAw a ssigllif ieantly highe rinis ehemie e or tex t h an in non一isehemiee or t e x def i eits eor eswer e hig h er inIIR 脚 up than i nsha m 一o Pe ra tio n 脚 up Mier o s eoPieex am ina tio nsh owed c onge 劝 o n anded e m a f is ehe而 c er ebr a l o r te xa rl 1 degen er auon a lldneer osis o f the ne u r o ns inl R 歹o up Ing r o ul 1 1 1 Pr opof olpr et r ea tm entsig n i f ie a ntl inhibi ted t h e t r a n sl oe a t i on o f NF 一 B deer e a sedexpr es sionof NF B a n d Ca spas e 一3 m R N A a nd ine r ea sed Bel 一2 m RNA e xpr essiona se om pa r e dwithl R 脚 up 1 1 Ne u r olog i e dif i eitand histof og iedam ag e indu e ed b y l R w e r e sig n i五e an i ly ao e lio r ated b y pr opo f olpl 姗at m 朗t Co n c l u s i onPr 0Po f ol pr e饥atm e nte a n i咖bit apoPto sisofneons i nd u e ed b y l R b y in hibiting the a etiv ationofNR B uP一r e g u l ating Bel 一2 g ene a n d do 一r e 酗a t i ng Ca sPase一3 gen e Key w o rds 阮 p of o l Br ainisehem ia R eper f usson in j恻 N F 一kap pa B c e n es Bel 一2 场 steinee n d o p eptida se s 有研 究 表 明脑缺血再灌注损伤与 NR 沼的 活 化川 神经 元 凋 亡 及其调 控基因 Bel 一2 ea spa s e一3 的 表达 密切相关团 异 丙酚具有 脑保护作用 能抑制 脂质 过氧 化引起的神经元坏 死 及脑缺血 再灌注后 神经 元凋亡 阻止 延 迟性 神 经元死亡闭 但其脑保 护作用 的确切 机制目前尚不 完全清楚 本研究拟观 察异 丙酚 对大鼠局灶 性脑缺 血再灌注 时 NF 一沼 的活 化和凋 亡调控 基 因B cl 一2 ca spa s e 一3 基因表达 的 影 响 探讨异 丙 酚脑保护作用 的机制 材 料 与方 法 实验动物 及分组 健康雄 性w i s t ar 大 鼠9 0只 鼠龄 3 一 4 个月 体重 25 0 一 30 09 吉林大学医学 动物 部 随机分 为假手 术组 缺 血再灌注组 I IR 异 丙 酚组 每组3 0只 各组 根据再灌注时 间不同又分 为 缺血 Z h 再灌注 2 3 6 12 2 4 7 2 h亚 组 每亚 组各 5 只大 鼠 局灶 性 脑 缺 血再灌注模型的制作参 照 文 献 5 大 脑 中动 脉线栓 法 加以改 进 栓线 采 用 直 径 0 26 一o 28m m 长 4 o em 的尼龙 线 以 10 水合氯 醛 30 0 m g kg 一 腹 腔 注 射麻醉后 仰 卧固定 分离 并暴露左侧颈总及 颈 内外动脉 栓线从颈 外 动 脉 至 颈 内动 脉插人大 脑 中动 脉 遇 阻 即止 进线 长 度1 8 一 20 mm 假 手术 组线栓深 度为1 0 栓塞 成 功的 大 鼠在缺血后 Zh 拔线 至颈外 动 脉残端内进行再灌 注 异丙酚 组 于 缺 血前1 0而n给 予 异 丙 酚 批号 CA354 Astr a Z e n eea 公司 英国 10 0雌 kg 一 腹 腔 内 注射 而 I R 组 给予 等体积生理盐水 按分组设定 的再灌注 时间断 头取脑 一部分标本 迅速人液 氮 保 存备用 另一部分标本准备制作石 蜡切 片 脑组 织 石 蜡 切 片的制 备各 组分别于再灌 注 2 3 6 12 2 4 72h 再次以 10 水合氯醛麻 醉 经 含 4 多聚甲醛 的磷 酸 盐缓 冲液 p BS o 0 1 m o l L p H 7 4 灌 注液心脏灌注固定后 取脑 以视交 叉和其后 4 mm 处 两点冠状 切 片 片厚 4mm 常规脱水 透 明 浸 蜡 包 埋 切 成 5拼m 厚的连 续冠状石蜡切片 神 经功 能缺 陷评分 参照文献 5 评分标准进 行行为 学评分 O分 正常 无神经缺 陷征象 l分 不能完全 伸展 右前肢 2 分 行走 时 向右侧转圈 3 分 行走 向右 侧 跌 倒 4 分 不 能 行 走 意识水 平 下 降 累积 1 分以上即为模型成功 脑组 织形态 学检 查将制作好 的石 蜡 切 片 行 HE 染色 光镜下 观察缺血侧大脑皮层 的组织形 态学 变化 N F 一 B 移位采 用免疫组 织化学染 色 法 一抗 NF 一沼 p6 5 多 克隆抗体由武汉博士德生 物试剂 公司 提供 链霉 菌抗生物 素蛋白 一过 氧化 物酶 SP 试剂 盒 和 3 3 一二 氨基 联苯胺 D AB 由福建迈新公司提供 取再灌注 2 6 1 2 2 4 h鼠脑 石蜡 切 片经常规脱蜡 水 化 滴 加第一抗体后 按试剂 盒说明 常规 SP法 对 切 片标本进行 染色 DAB 显 色 蒸馏水 洗 脱水 透明 封 片 胞 浆或胞核棕 色颗粒为 染色阳性 阴性对照 以 PBS或 正常山羊血清代替 一抗 余步 同上 NF咐B 的表达采 用 蛋白质 印 迹 法 We s t er n b lo t ti ng法 参照 文献 6 方法 进 行 取再灌注 2 6 1 2 2 4 h 的鼠 脑标本 加人细胞 裂 解 缓 冲液 经 过 破坏 细胞膜和核膜后 进行核 蛋 白抽 提 采用布拉 得 福德 Br adf or d 法蛋白定 量 后 保存于 一 8 0 备 用 以2 0 拼g 蛋 白 泳 道 上 样 经1 0 十 二 烷 基 硫 酸钠 SDS 一聚丙烯 酞胺 凝 胶电泳 后 电转 移 至硝 酸 纤 维 膜 先后 加人一 抗 NF 一沼 P6 5 抗体 及辣根过 氧 化 物酶标记 的二抗 DAB 显 色 剂 显 色 并 通 过 Ko d ar k 凝胶 成像系统 定量 扫描灰度值代 表 NF 一 沼的表 达 Bcl 一2 m RNA Ca spa s e 一3 m R NA 的表 达采用原 位 杂交 法 采 用武汉博士德生物试剂公司提供 的原 位杂 交试 f J 盒检测 Bel 一2 m R NA Ca spa se 一3 m R NA 的 表达 取再灌注3 6 2 4 7 2 h 鼠脑 石蜡 切 片经 常规 中华麻醉学杂志 2仪巧年5 月第2 6卷第5期 ChinJAn e othesiol MayZ以拓 v o l肠 N 5 组和异 丙 酚组缺血侧大脑皮层可见明显表达 与假 手术组比较 I R 组于再灌注 6 24 72 h表 达增强 异 丙酚 组于再灌注2 4 h表 达增强 与UR组比较 异 丙 酚组于再灌注 6 2 4 7 2 h 表 达 降低 尸 0 0 5或 0 01 见 表 l 假手术组 l j R组 异丙阶组 0 0 8 04 0 6 02 00 划 侧挑 脱蜡 水 化 按试剂 盒说明书操作 D AB 显 色 酒精 脱水 二甲苯透明 中性树胶封片 胞浆或胞 核棕色 颗粒为染 色阳性 将已染好的切 片在i x 5 0 光 学 显 微镜 ol ym Pu s公司 日本 下放大10 0 倍 随机选择 不 重叠 的 5 个视野 计数阳性 细 胞 并 经 L U z E x 一F 型图像分析仪 N i ko n 公司 日本 在计算机下测 定其 灰度值 统计学处理应用 SAS6 1 2统计软件 计量资 料以均数 土 标 准 差 无 士 表 示 组 间 组 内比较 采 用单因素方 差分析 尸 0 0 5为 差异有统计学意义 结果 神经 功 能 缺陷评分假 手 术 组无神经 功 能缺 陷 UR 组评分 2 2 8 士 0 4 7 高于异 丙 酚组 1 3 4 土 0 5 1 P 0 05 组织 形 态 学光镜 下假手 术 组 大 脑 皮 层 无 水 肿 充 血 神经元形态 结构完 整 l R组缺血侧 大 脑 皮层充 血明显 细 胞 间 质水肿 神经元 体积 缩 小 与 周围组织脱离 细 胞 呈 三 角 形 或 长 条 形 胞 浆空泡 状 胞核固缩 深染 有 核分裂 及 核 溶解 神经 纤 维走 行 不清 或消失 异丙酚组 大脑皮层轻 度水肿 充血 部分核膜增厚 染色质呈空网状 神经 元 核固缩极 少 神经 纤维走 行 尚清晰 NF 一 B 移 位 的比较假手 术组 I R 组及 异 丙酚 组未缺血侧大脑皮层 N F 一沼 无明显移位 与假 手术 组比较 FR 组 缺 血 侧 大 脑 皮 层于再灌 注 2 一 2 4 h N F 一 B 从细胞浆移位于细胞核 与 I I R 组比较 异 丙 酚组 缺血侧大脑 皮层于再灌注后 NF 一虑 从细胞浆向 细胞 核的移位被明显抑制 NF 一 B 的表达 假手术 组 I R 组 及异 丙 酚组 未 缺血 侧大 脑 皮层 仅 见 有微量 NF 一 姗的表 达 组 间比 较差异无统计学 意义 与 假手 术 组 比较 I R组缺血 侧大脑皮 层于再灌 注后 2 一 2 4 h核NF 一沼 的表 达 均 增 加 尸 0 01 与UR 组比较 异 丙 酚组 的缺 血 侧 大脑皮层 于再灌注后 2 一 2 4 hNF 一沼 表 达降低 尸 0 0 5 见图 1 Bd一mRNA 表 达 的比较假 手 术 组 I R 组和 异丙 酚组非缺血侧大脑 皮 层可见微量 表 达 F R 组 和异 丙酚组缺血 侧大 脑皮层 可见明显表 达 与假手 术组比较 I R 组于再灌注 3 6 2 4 h表达增 强 异 丙 酚组于再灌 注 3 6 2 4 72 h 表达 增 强 与 I R 组比 较 异丙酚 组表 达增强 p 0 0 5或 0 0 1 见表 1 Ca spa s e 一3 m R NA表 达的比较 假 手术 组 I R 组 和异丙 酚 组 非 缺 血 侧 大 脑 皮 层可见微量 表达 I R 2脚2五 2L16 hZ曰12h Zhl24 h 缺血l再灌注 时 间 图 l 各组缺血侧大脑皮质NF 一沼 p6 5 表达的比较 与假手术组比较 尸 0 0 1与I R组比较 p 0 0 5 表 1 各组再灌 注后大脑缺血侧皮质B c l 一2 m R NA C a s Pa s e一3 m R N A 表达的比较 灰度值 n二 5 无士 指标 Bel 一2 m R NA 组别 3h6 h 2 4 h 7 2 h 假手术组 123 土4 I R 组 14 0 士4 份 异丙酚组 15 5 土6久 Ca s钾旧e 一3 m R NA 假手术组 12 5 士5 I jR 组 132土5 异丙酚组 12 7 土5 12 4 士5 122 士4 125士5 16 0 士5 135 士4 势 127士5 178士4兰x50 士4久 14 0 士 6且 12 4 士4 125士51劝土4 14 3士3 母 16 2 士5译 14 2 士4 书 131土7公143 士5么 132 士8 与假 手术组比较 尸 0 0 5 p 0 0 1 与I I R组比较 么P 0 0 5 讨论 研究表明脑 缺血后缺血 中心区域的神经元很快 出现坏死 但其周围的神 经元却发 生 延 迟性神经元 死 亡 已证明这种延 迟性死亡 主要是 细胞凋 亡 它的 发生 受 一 些 相关 基因的调 控 如 B c l 一2 Ca sP as e 一3 等川 B c l 一2 是目前 发现 的最 重要的抗凋亡 基因 它 具有 抑制凋亡 的作用 C a sP a s e 一3 为半胧氨 酸蛋 白酶 C as Pa s e 家族的 成 员 是所 有 细胞凋 亡途径的最后 效应 子 它 激活 脱氧核糖核 酸酶 裂解 D NA 成 碎 片 导致 细胞凋亡 可以认为B c l 一2 和 ca spa s e一3 表 达的 改变 决定或 至少部分决定了缺 血神经元是存 活还 是死 亡 NF 一沼 是 一 种 重 要 的转录 因子 广泛 存 在于真 核细胞 中参与许多基因表达 的调控 NF 一沼 还存在 于脑 血管内皮细胞 神经元 和胶质细胞中 具有传递 中华麻醉学杂志 2仅拓年5 月第 2 6卷第5期 c hi nJAn es the si o l Ma y20 06 Vo l 2 6 N O 细胞核内外信息 的功 能 在免疫 应激反 应 炎 症和 细胞凋亡等方面具有重 要作用川 与脑缺 血 及再灌 注损伤的机制密切相关 有报 道脑 缺血再灌注 能够 引起 NF 一 B 的活化 细胞核内NF 一 B 的移位增加 脑缺 血后 NF 一 姗持续活化的神经元注 定 死亡 而存 活 的神经元中 NF 一超 仅短暂表达 s 研究 表 明 N F 沼持 续 活化 与 脑缺血再灌注 后神经元程序性 死 亡 有关 2 并且认为 活化的 N F 一 沼是通 过诱导 p5 3 c 卿 c Fas APo 一l 配体 Ca spase一3 等凋 亡促进 基因的 表 达和抑制抗凋亡 基因B c l 一2 的生 成 而产生促凋 亡作 用I o 脑缺 血再灌注后 发生 的神经元凋亡 一般在再灌 注 3h出 现 6h增 多 24 一 4 8 h 达 到高峰 72h后 减 少川 本研究采 用 的大 鼠局灶性脑缺血再灌注模型 是最 常用 有效 的脑缺 血再灌注损伤动物模型阁 模 型完 成后 大 鼠神 经 功 能缺 陷评分明显 升高达 2 2 8 分 实验结束后脑 组 织 形态 学 检 查 可 见缺血 皮 层 有 较 明显 的淤血 水肿 神经 组 织 细胞 变 性 坏死 表明 模型成功 本 实 验结果 表 明 脑 缺血再灌注 时 NF f c B在再灌注 2 一 2 4 h 明显活化 B c l 一2 mR卜A 于再灌 注 6h达高峰 再灌注 24h减 少 而 ea sp ase一3 m R N A 在再灌注 6h增 多 再灌 注 2 4 h达峰值 再灌注7 2 h 减少 这进 一步证明B c l 一2 抑 制神经组织细胞凋亡 N F 一 B Ca sP as e 一3 促进细胞 凋 亡 大鼠腹 腔注射异丙 酚的常用麻醉 剂量 为 5 0 一 15 0mg kg 一 有报道腹 腔 注射异丙 酚 10 0mg kg 一 预 处 理 能 减少 大 鼠脑缺血 再灌注损伤 抑制脑缺 血再灌注后 神 经 组 织 细胞 凋 亡闭 这也是本研究 选此药 物剂 量的依据 本研究 结果表明 异丙 酚 给 药后 显著改善脑缺 血再灌注后 神经功 能缺 陷和减 轻缺 血再灌注后脑 组织形态 学损 伤 同时 抑制 脑 缺血再灌注后 N F 一 B 从细胞浆向细 胞核的移位及 N F 一 B 的表 达 促进B c l 一2 m R NA 的表 达和抑制 Ca sp a se 一3 1llR NA 的表 达 stephen s on 等 川 研究认为抗氧 化剂 L Y 34 112 2 可以抑制 NF 一 姗活 性 保护神 经元缺 血 性 损伤 而 给予 抗 氧 化 剂 N 一乙 酞 半胧 氨酸能抑 制 NF 一 B 活化 缩 小脑 梗死 体积 从而 在脑 缺血再灌注 损伤中起 到保护作 用 2 静脉麻 醉药 异丙酚 由于具有较强的抗氧化特性 而显示 出脑 保护作用 异 丙 酚还具有 一定 的抗炎作用 不但能 抑制 炎性反应 综 合征 时细 胞因子 的释 放 而且 还 能 抑制 中性粒细胞的激活 呼吸爆发和趋化能 力 3 还有 研究表明在 脑 缺血再灌注 时 应用 异丙酚能明 显减少 脑缺 血再灌注损伤的 白细胞浸 润及神经元损 伤程度 4 综上所述 异 丙酚 的脑保 护作用可能 与其抑制 NF 一 B 的活化 上调 Bol 一2 基因和下 调 Ca spa s e 一3 基因 的表 达 从而抑制神经组 织细胞凋亡 有关 参考文献 1 冯春生 王虎山 李淞 等 大鼠短暂局灶性脑缺血再灌注后核 转录因子 一K B的表达 中风与神经疾病杂志 20 0 3 2 0 11 一1 3 2 王越晖 孟召样 汪林 等 大鼠脑缺血再灌注损伤后NF沼蛋 白 c a s P a se 3 m R N A 表达及细胞凋 亡的研究 中风与 神经疾病杂 志 20 04 2 1 2 0 8 一2 1 0 3 Ya m aguchi S H a lnag t eh i S Mis hioM e t a l P r叩汕习 r r even t s l ip id p da t i on f o ll o l 甲ing t r a ns i朋t fo r ebrain is c卜e n n a jngerbils CanJ An aes th 2 j k 4 7 1025 一 10 30 4 杨宾侠 王永利 赵砚丽 异丙酚对大鼠局灶性脑缺血 再灌注 后 细胞凋亡 的影响 中华麻醉学杂志 2 X归 2 3 288 一2 9 0 5 业 ng aEZ W eins t ein PR Ca r l son S et a l Rev e玲 ib le 而d沮 eeer ebr a l a r t盯 oedu 苗叨 w i thou ter an ieeto哪in r a t 3 S t r o k e 1989 2 0 84 一91 6 黄培堂 编译 分子克隆实 验指南 第 3 版 北 京 科学出版 社 2朋2 x75 2 一175 3 7 陈红兵 王鲁民 许贞峰 等 脑缺血再灌流损伤神经细胞凋亡 与Bd 一2 和 a s pa s e一3 的关系 中国老年学杂志 20 03 2 3 84 0 84 2 8Cleme n s JA Ce r ebral