自制纤维素金属螯合亲和膜的部分吸附性能及纯化牛血SOD.doc

自制纤维素金属螯合亲和膜的部分吸附性能及纯化牛血SOD刘建荣1，张昊2，顾雅君1，赵晓瑜1（1.河北大学生物工程技术研究中心院,保定 071002;2.河南双汇投资发展股份有限公司, 漯河 462000）摘要：目的 自制纤维素金属螯合亲和膜，研究亲和膜对金属离子（Cu2+、Ni2+、Fe3+）和蛋白质的吸附性能，以求建立一种简便实用的纯化SOD的方法。方法 以纤维素滤纸为原料，经交联制成可螯合金属离子的纤维素亲和膜，筛选确定与亲和膜吸附量最大的金属离子，并以卵清蛋白的吸附-脱附实验考查该膜对蛋白质的吸附性能。结果 在Cu2+、Ni2+和e3+中，亲和膜对Cu2+的吸附量最大，多次重复实验Cu2+吸附量稳定维持在15.0mol(cm2)-1左右。Cu2+亲和膜对生理盐水溶卵清蛋白的吸附量高于无离子水溶卵清蛋白，但蛋白脱附率前者低于后者。吸附-脱附方式（静态法）分离纯化SOD，脱附样品比活达8770 Umg-1，纯度为81%；吸附-洗脱方式（动态法）分离纯化SOD，穿柱流出样品比活达12400 Umg-1，纯度为85%。结论 自制的纤维素亲和膜有较好的吸附性能和纯化效果，重复使用性能良好，制备和纯化过程简便易行。关键词：亲和膜；金属螯合；纤维素；SODPartial Adsorption Characteristics of Self-made Cellulose Metal-Chelated Affinity Membrane and Its Application for Purification of Bovine SOD from BloodLIU Jian-rong1, ZHANG Hao2, Gu Ya-jun1, ZHAO Xiao-yu1 (1. Research Center of Bioengineering, Hebei University, Baoding 071002 , China; 2. HenanShuanghuiInvestmentDevelopmentC.,LTD, Luohe 462000,China ) ABSTRACT: OBJECTIVE To study adsorption characteristics for metal ion (Cu2+,Ni2+,Fe3+) and proteins of self-made cellulose metal-chelated affinity membrane, and establish an efficient and convenient method for purifing superoxide dismutase (SOD). METHODS Affinity membrane with Cu2+, Ni2+ and Fe3+ was prepared with cellulose filter paper. Adsorption characteristics of proteins were studied with affinity membrane by adsorption-desorption experiments of ovalbumin after the affinity membrane of the largest adsorption capacities for different metal ions were carried out. RESULTS The adsorption capacity of affinity membrane for Cu2+ was the largest among Cu2+,Ni2+ and Fe3+, and the adsorption capacity kept steadily at about 15mol(cm2)-1 repeatedly. The adsorption capacity of Cu2+ affinity membrane for ovalbumin dissolved in 0.9% NaCl was higher than that dissolved in deionized water, but as for protein recovery, the former was lower than the latter. The sample with specific activity of 8770 Umg-1, purity of 81% was desorbed by static adsorption-desorption. The liquid that passed through column by dynamic adsorption-elution was specific activity of 12400 Umg-1 and purity of 85%. CONCLUSION Self-made cellulose metal-chelated affinity membrane has a rather good absorbing characteristics and purifying effect, adapt well to repeated use, the preparation and purifying process is easy and convenient. KEY WORDS: affinity membrane; metal chelating; cellulose; superoxide dismutase (SOD)固定化金属螯合亲和色谱(Immobilized metal ion affinity chromatography，简称IMAC)是Porath等1在上世纪 70年代提出一种新的蛋白质分离纯化方法，支撑材料为琼脂糖凝胶。但凝胶颗粒易压缩变形，机械强度差，蛋白质在凝胶颗粒间扩散传质慢，分离操作只能在低流速下进行，从而使其在大规模蛋白质分离纯化中的应用受到限制。使用微孔膜作支撑材料始于80年代2。近年来,人们结合亲和色谱特异性高和膜分离速度快、成本低、处理量大等优点,提出以膜(如纤维素滤纸)作为亲和配基载体制备金属螯合亲和膜用于蛋白质和其他生化制剂的毒素去除和分离纯化，并取得了良好的效果3-5。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)广泛存在于生物界，是生物体防御自由基氧化损伤的一种十分重要的酶，其中Cu,Zn-SOD已广泛应用于医药、食品和化妆品等领域6。本实验对自制的纤维素金属螯合亲和膜进行了金属离子和蛋白质吸附性能的研究，并利用金属螯合亲和膜对牛血SOD进行纯化。1 材料与方法1.1 材料与仪器SDS（Amresco公司，进口分装），纤维素滤纸（中国杭州新华造纸厂），以下其他试剂均为国产分析纯：抗坏血酸（维生素C），邻苯三酚，二甲亚砜（DMSO），环氧氯丙烷（EPI），亚氨基二乙酸（IDA），EDTA，Na2CO3，NaOH，Tris，NH4Cl，CuSO4，NiSO4和FeCl3等。WFJ 2100 型可见分光光度计（尤尼克上海仪器有限公司），WD-9413B凝胶成像分析系统（附带蛋白含量分析软件gel-pro 32，北京六一仪器厂），SHY-2型水浴恒温振荡器（金坛县环保仪器厂），HD-2000型核酸蛋白检测仪（上海嘉鹏科技有限公司），DYCZ-24D型垂直板电泳槽（北京六一仪器厂）。1.2 方法1.2.1 纤维素金属螯合亲和膜的制备 参照文献 7制备。所制得的纤维素金属螯合亲和膜直径d=6cm，膜面积为28.3cm2。1.2.2 亲和膜对金属离子的吸附性能 将1张偶联好配基的亲和膜用大量去离子水冲洗至中性，再分别浸入5mL的50mmolL-1 CuSO4，NiSO4和FeCl3溶液中2h，将溶液倒出，该膜以无离子水洗至无残余金属离子（Me），并测定浸泡过亲和膜的该金属盐溶液的Me浓度，从Me-EDTA标准曲线查出并计算膜单位面积（cm2）对Me的吸附量。亲和膜对Me的吸附量=（浸泡前初始溶液中Me的总量浸泡后残余溶液中Me的剩余量）/ 亲和膜面积经过吸附-脱附蛋白质的亲和膜，先用50mmolL-1 EDTA解析螯合膜上残余的Me及蛋白质，然后重新用50mmolL-1 Me溶液浸泡进行Me再吸附，并重新测定计算其重复使用时Me的吸附量，然后将多次重复使用时Me的吸附量进行比较，确定其重复使用性能。1.2.3 亲和膜对卵清蛋白的吸附性能 取新鲜鸡蛋将蛋清分离，无离子水适当稀释后以纱布和滤纸过滤。量取两份3mL上述卵清蛋白，一份用3mL无离子水稀释，另一份用3mL的2倍生理盐水稀释。取1张吸附了Cu2+的纤维素亲和膜以无离子水浸洗至无残余Cu2+，浸于6mL无离子水溶卵清蛋白液中，室温静置吸附3h，收集吸附剩余液，将吸附了卵清蛋白的Cu2+亲和膜以5mL无离子水洗涤2次，收集洗涤液，亲和膜最后以5mL的pH5.0柠檬酸盐缓冲液室温脱附1h，收集脱附样品。分别测定各步样品的蛋白质浓度,计算得出亲和膜对卵清蛋白的吸附量及脱附量，由已知膜面积求出每平方厘米膜上蛋白质的吸附量（mg(cm2)-1）。此膜用50mmolL-1 EDTA浸泡，螯合解析膜上吸附的Cu2+和未脱附的蛋白质，然后用无离子水冲洗数次，去除残余的EDTA，留作重复上样使用。取另1张吸附了Cu2+的纤维素亲和膜，待吸附样品卵清蛋白为溶于0.9%生理盐水中，各步洗涤均为0.9%生理盐水，处理过程完全同上。1.2.4 吸附-脱附方式亲和膜对牛血SOD的分离（静态法） 准确称取60mg牛血SOD，以20mL无离子水溶解，得牛血SOD溶液，经测定蛋白质浓度2.8gL-1，比活5400 Umg-1。取2.5mL上述牛血SOD样品，加2倍生理盐水2.5mL稀释，得0.9%生理盐水溶SOD样品。将1张Cu2+ 螯合亲和膜(d=6cm)浸于上述5mL牛血SOD样品液中，于4过夜吸附，将溶液倒出，吸附了蛋白的亲和膜用15mL生理盐水洗涤35次，然后置于5mL的1molL-1 NH4Cl中，于4过夜脱附。分别取样测定各步骤样品的蛋白质浓度和活性，由此可计算亲和膜对牛血SOD样品的吸附量及各步样品的比活。 1.2.5 吸附-洗脱方式亲和膜色谱柱对牛血SOD的分离（动态法） 取一个内径为25mm的针头式过滤器，先在底部放入1张未吸附Cu2+的亲和膜（用以吸附泄漏的Cu2+），再将3张同样大小已吸附Cu2+的亲和膜置于其上，然后旋紧。完成装柱后，用核酸蛋白检测仪在280nm波长下监测牛血SOD样品的上样、平衡和洗脱。上样3mL生理盐水溶SOD（同1.2.4样品），以生理盐水平衡后，先以0.2molL-1 NH4Cl洗脱，再换用1molL-1 NH4Cl洗脱。上柱过程中分段收集上样穿柱流出液、平衡流出液和洗脱峰，分别测定蛋白质含量及活性。实验均在室温下进行，流速为0.5mLmin-1。1.2.6 分析方法 金属离子密度用可见光吸收法测定Cu2+-EDTA浓度（A740nm）、Ni2+-EDTA浓度（A380nm）和Fe3+-EDTA浓度（A340nm），考马斯亮蓝染色法（Bradford法）测定蛋白质浓度，终止剂改进的邻苯三酚自氧化法（终止剂法） 8测定SOD活性，12%分离胶SDS-PAGE分析吸附前后SOD样品纯度变化，WD-9413B凝胶成像分析系统扫描凝胶，以蛋白含量分析软件gel-pro 32测定目的蛋白纯度。2 结果与讨论2.1 亲和膜对金属离子的吸附性能及重复使用性选用Cu2+、Ni2+和Fe3+三种金属离子对金属螯合亲和膜的吸附量进行了比较，实验结果见表1所示。亲和膜对金属离子的吸附量和吸附重复性是衡量所制备的金属螯合亲和膜质量好坏的标准。由表1可见，在Cu2+、Ni2+和Fe3+ 三种金属离子中，亲和膜对Cu2+的吸附量最大，单位面积（cm2）可达16mol，其次是Ni2+，对Fe3+吸附量最低。将吸附了金属离子的亲和膜以0.5mol/L的EDTA螯合除去膜上的金属离子，无离子水洗净后再分别用50mmolL-1的CuSO4，NiSO4和FeCl3再生，对Ni2+和Fe3+的吸附量逐渐降低，但对Cu2+的吸附量保持不变。表明亲和膜对Cu2+吸附重复性良好，可维持在16.0mol(cm2)-1的水平不变。魏琪9和杨严俊10等人制备所得纤维素亲和膜Cu2+吸附量分别为4.15mol(cm2)-1和6.5mol(cm2)-1 ，均低于该亲和膜。亲和膜对金属离子的吸附量愈大，对蛋白质的吸附容量才愈高。表1 亲和膜对不同金属离子的吸附量和重复使用对吸附量的影响Table 1 Adsorption capacity of affinity membrane for different metal ions and influence of reuse times of the membrane on adsorption capacity.Reuse timesadsorption capacity /mol(cm2)-1Cu2+Ni2+Fe3+116.513.78.4216.013.05.4315.910.24.2416.5-516.6-2.2 Cu2+亲和膜对卵清蛋白的吸附性能选用Cu2+螯合亲和膜，以卵清蛋白作为亲和吸附对象考察Cu2+亲和膜对蛋白质的吸附性能，结果如表2所示。亲和膜对生理盐水溶卵清蛋白的吸附量大于无离子水溶样品的吸附量，前者是后者的2.7倍，但脱附率却低于无离子水溶卵清蛋白。表明一定浓度的NaCl有助于亲和膜对蛋白质的吸附，但同时也会使被吸附的蛋白的脱附率有所降低。单位面积Cu2+螯合亲和膜初次使用最大可吸附卵清蛋白113g(cm2)-1，远高于以聚丙烯中空纤维微孔膜为材料制得的Cu2+螯合亲和膜对溶菌酶8.1g(cm2)-1的吸附量11。重复使用3次后，对卵清蛋白的吸附量仍维持在80g(cm2)-1，表明该亲和膜对蛋白质的吸附量较高，且重复使用性较好。表2 Cu2+亲和膜对卵清蛋白的吸附-脱附结果Table 2 Adsorption-desorption result of ovalbumin by Cu2+ affinity membraneOvalbumin Total protein/mgRemnant protein/mgWashed protein/mgAbsorbed protein/mgadsorption capacity /g(cm2)-1Absorbed rate/%Desorbed protein/mgDesorbed rate/%Dissolved in deionized water5.403.760.471.174221.71.24100dissolved in 0.9% NaCl5.401.910.293.2011359.32.0463.82.3 Cu2+亲和膜对牛血SOD的吸附-脱附分离（静态法） 将亲和膜浸于生理盐水溶牛血SOD样品液中，于4条件下过夜吸附，经平衡液洗涤后进行脱附，结果如表3所示。由表3可知，亲和膜吸附蛋白后剩余的样品以及脱附样品的比活均高于上样前样品。将吸附前后样品及脱附样品进行SDS-PAGE，结果见图1。尽管上样量偏大，致使27%的蛋白没有被吸附，但从吸附后残余液样品的电泳结果（图1-2）中可见，除一条杂蛋白外，其他杂蛋白均明显被亲和膜所吸附，且比活由5400Umg-1提高到8160Umg-1。脱附样品中（图1-3）这些被吸附的杂蛋白仍保留在亲和膜上没有随SOD一起脱附下来，脱附样品比活达8770Umg-1，表明该亲和膜对被分离样品中目的蛋白SOD和杂蛋白之间起到了一定程度的分离作用，样品获得到了一定的纯化。经凝胶成像分析系统软件分析，上样前SOD纯度为51%，上样残余样品纯度为74%，脱附样品SOD纯度则可达81%，纯化1.6倍。表3 Cu2+亲和膜对牛血SOD的吸附-脱附结果Table 3 Static adsorption-desorption result of bovine SOD from blood by Cu2+ affinity membraneTotal protein/mgRemnant protein/mgWashed protein/mgAbsorbed protein/mgAdsorption capacity/g(cm2)-1Absorbed rate/%Desorbed protein/mgDesorbed rate/%Specific activity / Umg-1Before adsorptionAfter adsorptionDesorbed sample7.01.860.055.0917072.72.2644.4540081608770图1 Cu2+亲和膜吸附-脱附方式分离牛血SOD的SDS-PAGE图谱1- 吸附前样品；2- 吸附后样品；3- 脱附样品；4- 蛋白质标准分子量Fig 1 SDS-PAGE analysis of static adsorbed-desorbed bovine SOD from blood by Cu2+ affinity membrane1- before adsorption；2- After adsorption；3- Desorbed sample；4- protein maker2.4 Cu2+亲和膜色谱柱对牛血SOD的吸附-洗脱分离（动态法）以色谱柱吸附-洗脱方式分离牛血SOD的结果见表4。从表4可知，上样时穿柱流出液及平衡流出液的比活均高于上柱前样品，洗脱样品的比活也高于上柱前样品。将上述样品进行SDS-PAGE，结果见图2。由图2-5和2-6可以看出，先以0.2molL-1 NH4Cl洗脱，再以1mol/L NH4Cl洗脱时，大部分杂蛋白伴随少量SOD一同被洗脱下来，洗脱样品中目的蛋白SOD的纯度反而下降。相反，上样穿柱流出液和平衡液中杂蛋白却明显减少，经凝胶成像分析系统软件分析，穿柱流出样品和平衡样品纯度由上样前的51%分别提高到76%和85%，比活是上柱前样品的1.78和2.3倍。这表明，尽管亲和膜色谱柱容积小，蛋白吸附量有限，样品在流动上柱时一部分蛋白穿柱流出，但流动上样时杂蛋白与亲和膜的吸附能力强于目的蛋白SOD，优先挂于亲和膜柱上，穿柱流出液由于一些杂蛋白被吸附去除从而使比活得以提高，起到了一定的纯化效果。表4 Cu2+亲和膜色谱柱对牛血SOD的吸附-洗脱结果Table 4 Dynamic adsorption-elution result of bovine SOD from blood by Cu2+ affinity membraneSampleTotal protein/mgTotal activity/USpecial activity/Umg-1Protein recovery/Activity recovery/Initial4.2115715400100100passed through column0.5770761241813.661.2Equilibrated0.232426105275.521.0Eluted by 0.2mol/L NH4Cl0.20191894694.816.6Eluted by 1mol/L NH4Cl0.202025101254.817.5图2 亲和膜色谱柱分离牛血SOD的SDS-PAGE图谱1,2-上样前样品；3-上样流出液；4- 平衡流出液；5- 0.2mol/L NH4Cl洗脱峰；6- 1mol/L NH4Cl洗脱峰Fig 2 SDS-PAGE analysis of dynamic adsorbed-eluted bovine SOD from blood by Cu2+ affinity membrane1,2- before adsorption；3- passed through column；4- Equilibrated；5- Eluted by 0.2mol/L NH4Cl；6- Eluted by 1mol/L NH4Cl采用静态法获得比活为8770Umg-1的脱附样品，蛋白收率为63.8%，高于动态法的9.6%。该方式操作极其简便，不需要特殊仪器设备，适合于放大规模。采用动态法，上样穿柱流出液比活为12418 Umg-1，高于静态法的脱附样品比活，但13.6%的蛋白收率明显低于静态法的脱附样品蛋白收率。两种方式各有优劣，可根据设备情况和纯度需求选择合适的纯化方式。参考文献1 Porath J, Carlsson J,Olsson I,et al.Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fraction J.Nature,1975,258,18:598-599.2 Serafica G C, Pimbley J, Belfort G. Protein fractionation using fast flow immobilized metal chelate affinity membranes J. Biotech and Bioeng, 1994,43:21-36.3 SHANG Z H, ZhOU L M. Current situation,development and applications of membrane affinity chromatography J. Progress in Chemistr (化学进展),1995,7(1):47-59.4 GUO W, SHANG Z H, YU Y N, et al. Preparation of macropore cellulose membrane and its application in the endotoxin removal by affinity adsorption J. Chin Pharm J (中国药学杂志),1998,33(12):731-734.5 WEI Q,YAO R H,BAO S X. Preparation of immobilized metal-chelated affinity membrane and its application to purification of Cu/Zn-superoxide dismutase J. Chinese journal of Chromatography (色谱),2000,18(4):361-363.6 ZHANG Y,WANG J Z,WU Y J. Progress of pharmaceutical studies on superoxide dismutase J. Acta Pharmaceutica Sinica (药学学报),2003,38(1):71-74. 7 ZHANG Y H,YANG Y J. Study on the purification of functional proteins from egg white by cellulose metal-chelated affinity membrane J. Journal of Food Science and Biotechnology (食品与生物技术学报),2006,25(2):42-47.8 JING T Y, ZHAO X Y. The improved pyrogallol method by using terminating agent for superoxide dismutase measurement J. Prog Biochem Biophys (生物化学与生物物理进展),1995,22(1):84-86.9 WEI Q,YAO R H,BAO S X. Preparation of two kinds of immobilized metal-chelated affinity chromatography membranes J. Journal of Functional Polymers (功能高分子学报),2000,13(1):90-9