造血干细胞低温保存与临床应用.pdf

论著 北京 海军总医院血液科 邮编 100037 造血干细胞低温保存与临床应用 沈建良 黄友章 吴南海 唐湘凤 岑坚 杨平地 汪声恒 摘要 目的 观察低温保存造血干细胞 hematopoietic ste m cel l HSC 的效率及冻存 HSC的临床应用情况 方法 25例骨髓造血干细胞 bonemarro w ste m cel l BMSC 以 10 二甲基亚砜加 10 自体血浆为冷冻保护剂 采 用程控降温液氮保存 21例外周血干细胞 peripheralblood ste m cel l PBSC 采用 CP1 cryopreservatives1 加 4 人 血白蛋白为冷冻保护剂 非程控降温后液氮保存或低温冰箱保存 检测复温后单个核细胞 MNC 回收率 粒 单 细胞集落形成单位 CFU GM 回收率 台盼蓝拒染率 TBR 并行细菌学培养 移植后观察输注反应及植入情况 结果 BMSC冻存时间为 1 3个月 中位时间 1个月 复温后 MNC回收率为 97 74 0 85 TBR为 96 74 0 91 CFU GM 回收率为 72 04 1 87 PBSC冻存时间为 1 20个月 中位时间 2个月 复温后 MNC回 收率为 97 75 1 34 TBR为 96 28 2 16 复温后 46份标本细菌学培养均为阴性 实施自体骨髓造血 干细胞移植 ABM SCT 25例 中性粒细胞绝对值 ANC 0 5 109 L 的时间为 10 79 0 93 d 血小板计数 PLT 20 109 L的时间为 12 88 0 95 d 实施自体外周血造血干细胞移植 APBSCT 21例 ANC 0 5 109 L的时间为 10 1 14 d PLT 20 109 L的时间为 12 04 2 13 d 两组间 MNC回收率和 TBR 比较均无 显著性差异 移植后 APBSCT组 ANC 0 5 109 L的时间早于 AB M SCT组 有显著性差异 P 20 109 L的时间两组无显著差异 出院前所有患者复查骨髓均示增生活跃或明显活跃 BMSC输注出现的不良反 应明显多于 PBSC输注 结论 采用联合冷冻保护剂 非程控降温后液氮保存或低温冰箱保存来冻存 HSC是切实 可靠的 这种方法操作简便 价格低廉 安全有效 建议今后冻存 BM SC前应去除红细胞 关键词 造血干细胞 低温保存 移植 Cryopreservation and clinical application of he m atopoietic ste m cells SHEN Jian liang HUANG You zhang WU Nan hai et al Depart ment ofHe matology NavalGeneralHospita l Beijing 100037 Abstract Objective To investigate the effectiveness and clinical application of he matopoietic ste m cell HSC cryopreservation M ethods 25 units ofbonemarrow ste m cell BMSC were frozen by a programmed freezer and preserved in liquid nitrogen w ith 10 DMSO plus 10 autologous plasma as cryopreservative 21 units of peripheralblood ste m cell PBSC were frozen at an uncontrolled rate and preserved in liquid nitrogen or 80 refrigeratorwith CP1 plus 4 hu man album as cryopreservative M ononuclear cell MNC recovery granulocyte monocyte colony for m ing unit CFU GM recovery typeran blue resistance TBR and bacteriological culture were detected after thawing Adverse reactions af ter infusion of cryopreservedHSC were observed and infor mations for engraft mentwere also collected Results The median duration ofBM SC cryopreservation was one month 1 3 months MNC recovery was 97 74 0 85 95 5 99 5 TBR was 96 74 0 91 94 5 98 CFU GM recovery was 72 04 1 87 69 5 76 5 Themedian duration of PBSC cryopreservation was two months 1 20 months MNC recovery was 97 75 1 34 96 99 5 TBR was 96 28 2 16 93 5 99 5 46 speci menwere tested for ger ms by bac teriological culture and allof them was negative 25 units of cryopreserved BM SC were grafted to 25 patients autologous bone marrow ste m celltransplantation ABM SCT Among the m the average ti me for absolute neutrophil count ANC 0 5 109 L was 10 79 0 93d 10 13d and the average ti me for platelet count PLT 20 109 L was 12 88 0 95d 12 15d after transplantation 21 units of cryopreserved PBSC were used for autologous peripheralblood ste m cell trans 85 北京医学 2009年第 31卷第 2期 plantations APBSCT The average ti me forANC 0 5 109 L was10 1 14d 8 12d and the average ti me for PLT 20 109 L was 12 04 2 13d 8 17d after APBSCT The differences of bothMNC recovery and TBR bet ween two groupswere not significant statistically P 0 05 A fter transplantation the ti me for ANC 0 5 109 L inAPBSCT was earlier than that inABM SCT P 20 109 L in two groupswas notdifferent statistically P 0 05 Every patient had a cellular or hypercellular bone marrow picture before leaving hospita l BM SC infusion caused muchmore adverse reactions thanPBSC infusion Conclusions Freezing at an uncontrolled rate and storage in liquid nitro gen or 80 refrigerator is a si mplified low costly effective and safe cryopreservationmethod for HSC It is suggested that red blood cell depletion should be perfor med before BMSC cryopreservation Keywords He matopoietic ste m cell Cryopreservation Transplantation 造血干细胞 hematopoietic stem cel l HSC 的来 源包括骨髓 外周血 脐血和胎肝等 已广泛用于临 床造血干细胞移植 hematological stem cell transplan tation HSCT 科学研究等领域 在自体造血干细 胞移植 AHSCT 科研和其他相关情况下 往往需 要对 HSC进行冷冻保存 我院从 1985年开始进行 HSC冻存研究与应用 先后冻存了 183份 HSC 为 观察不同冷冻保护剂及不同冻存方法对保存效率的 影响 以及冻存 HSC输注后不良反应和临床植入情 况 我们对 1985年 1月至 2007年 12月资料较完整 的 46份冻存 HSC相关情况进行了总结 报告如下 材料与方法 一 材料 46份 HSC样本中来源于骨髓 25份 来源于外 周血 21份 采集自 46例患者 男 29例 女 17例 年龄 3 50岁 中位年龄 23 5岁 其中急性白血病 20例 恶性淋巴瘤 20例 风湿病 6例 系统性红斑 狼疮 4例 皮肌炎和幼年型类风湿各 1例 采集时 间 急性白血病在诱导化疗达完全缓解并巩固强化 3 4个疗程后 恶性淋巴瘤在完全缓解或部分缓解 期 风湿病处于疾病稳定状态 骨髓造血干细胞 bonemarrow ste m cel l BMSC 的采集在硬膜外麻醉 下进行 外周血造血干细胞 peripheral blood stem cel l PBSC 采集前均通过化疗和细胞因子动员处 理 应用 CS 3000PLUS血细胞分离机 美国百特医 疗用品有限公司 采集 二 方法 1 冷冻保护剂和冻存方法 冷冻保护剂有两种 一种是 10 二甲基亚砜 美国 Baker公司 加 10 自体血浆 均为终浓度 下同 另一种是 CP1 cryo preservatives1 日本极东制药工业株式会社 加 4 人血白蛋白 即由 5 二甲基亚砜 6 羟乙基淀粉 和 4 人血白蛋白组成的联合冷冻保护剂 B MSC 采用 10 二甲基亚砜加 10 自体血浆为冷冻保护 剂 PBSC 采用 5 二甲基亚砜 6 羟乙基淀粉和 4 人血白蛋白作为冷冻保护剂 冻存方法有 3种 第 1种为程控降温液氮保存 即先将待冻标本置入 4 冰箱 30m in 再置入程控降 温仪 Cryomed1010B 美国 以 1 m in的降温速 度降至 40 再以 10 m in 的降温速度降至 80 投入液氮内保存 第 2种是非程控降温后液 氮保存 即先将标本置于 80 冰箱降温并保存 24h 后取出标本投入液氮内保存 第 3种是非程控 降温后低温冰箱保存 即将标本置于 80 冰箱降 温并保存 早期的 B MSC均采用第 1种方法 后期 若 PBSC需长期保存 则多采用第 2种方法 若不需 长期保存 则采用第 3种方法 所有标本冻存前均 未去除红细胞 2 复温方法 冻存标本自冰箱或液氮中取出后 直接投入 38 水浴箱中 待融化后立即取出使用 3 冻存效果观察指标 冻存前后检测单个核细 胞 mononuclear cel l MNC 数量 CD34 细胞比例 粒 单细胞集落形成单位 grannulocyte monocyte colony for m ing uni t CFU GM 台盼蓝拒染率 type ran blue resistance TBR 和细菌学培养 计算 MNC 回收率和 CFU GM 回收率 以评价冻存效果 CD34 细胞比例应用流式细胞仪检测 CFU GM 检 测方法参见文献 1 受年代限制 BMSC 未做 CD34 细胞比例检测 PBSC未做 CFU GM检测 4 移植类型与观察指标 46份 HSC均应用于 AHSCT 移植后观察指标包括输入的 MNC数量 CD34 细胞数量 CFU GM 数量 输注反应 是否使 用细胞因子及植入情况 外周血象 骨髓象恢复情 况 三 统计学方法 应用 Stata 4 0统计软件 组间比较采用 t检验 86 北京医学 2009年第 31卷第 2期 结 果 一 不同来源造血干细胞采用不同方法冻存的 效果观察 1 BMSC的冻存效果 25例 BMSC以 10 二甲 基亚砜加 10 自体血浆为冷冻保护剂 采用程控降 温液氮保存 冻前 MNC为 7 44 2 64 10 8 kg 3 16 12 31 CFU GM 为 7 02 3 84 10 5 kg 2 79 17 86 冻存时间 1 3个月 中位 时间 1 个 月 复温后 MNC 回 收率为 97 74 0 85 95 5 99 5 TBR 为 96 74 0 91 94 5 98 CFU GM 回 收率为 72 04 1 87 69 5 76 5 2 PBSC的冻存效果 21例 PBSC 采用 CP1加 4 人血白蛋白为冻存保护剂 非程控降温后液氮保 存或低温冰箱保存 冻前 MNC为 10 04 4 57 10 8 kg 2 59 21 43 CD34 细胞 比 例为 0 82 0 92 0 15 3 6 冻存时间 1 20个月 中位时间 2个月 复温后 MNC回收率为 97 75 1 34 96 99 5 TBR为 96 28 2 16 93 5 99 5 BMSC和 PBSC采用不同的冷冻保护剂 不同的 冻存方法 经中短期保存后 两组间 MNC回收率和 TBR比较均无显著性差异 P 0 05 见表 1 3 细菌学培养结果 HSC样本冻存复温后进行 细菌学培养 46份标本培养结果均为阴性 二 冻存造血干细胞的植入情况 1 自体骨髓造血干细胞移植 autologous bone marrow stem cell transplantation ABMSCT 25例 回 输 MNC量为 7 26 2 58 10 8 kg 3 1 11 2 CFU GM 为 5 16 2 75 10 4 kg 2 12 5 5 例 20 移植后使用了粒细胞集落刺激因子 中 性粒细胞绝对值 absolute neutrophil coun t ANC 0 5 10 9 L的时间为 10 79 0 93 d 10 13d 血小板计数 PLT 20 10 9 L的时间为 12 88 0 95 d 12 15d 出院前所有患者复查骨髓均示 增生活跃或以上 2 自体外周血造血干细胞移植 autologous pe ripheral blood stem cell transplantation APBSCT 21 例 回输 MNC数量为 8 71 4 34 10 8 kg 2 5 21 CD34 细胞数量为 7 04 8 07 10 6 kg 1 4 38 1 21例移植后均使用了粒细胞集落刺 激因子 ANC 0 5 10 9 L的时间为 10 1 14 d 8 12d PLT 20 10 9 L 的时间为 12 04 2 13 d 8 17d 出院前所有患者复查骨髓均示 增生活跃或以上 移植后 APBSCT 组 ANC 0 5 10 9 L 的时间 早于 ABMSCT组 有显著性差异 P 20 10 9 L的时间两组间无明显差异 见表 1 三 输注冻存复温后 HSC的不良反应 B MSC输注后 24例 96 出现一过性血红蛋 白尿 6例 24 有轻度恶心 5例 20 出现寒 战 发热 体温 38 左右 3例 12 出现一过性血 压轻度偏高 上述症状在观察 24h后均消失 1例 系统性红斑狼疮患者输注当天即出现无尿 发生急 性肾衰竭 经透析治疗 1个月后逐渐恢复 PBSC输 注后无 一 例出 现一 过 性血 红蛋 白 尿 但 2 例 9 5 出现一过性轻度血压偏高 无寒战 发热 恶心等不良反应发生 表 1 造血干细胞低温保存和植入情况 x s 项目例数冷冻保护剂 降温和保存 方法 单个核细胞 回收率 台盼蓝 拒染率 单个核细胞 输注量 109 L ANC 0 5 109 L 时间 d PLT 20 109 L 时间 d 骨髓造血干细胞 自体 骨髓造血干细胞移植 25 10 二甲基亚砜 10 自体血浆 程控降温 液氮保存 97 74 0 85 96 74 0 917 26 2 58 10 79 0 93 12 88 0 95 外周血造血干细胞 自体 外周血造血干细胞移植 21 5 二甲基亚砜 6 羟乙基淀粉 4 人血白蛋白 80 冰箱降温 保存或 80 冰 箱降温液氮保存 97 75 1 34 96 28 2 168 71 4 3410 1 14 12 04 2 13 t值0 030 971 402 591 76 P 值0 97560 33790 16770 0130 0845 与自体骨髓造血干细移植比较 P 0 05 保存效率相近 我们采用非程控降温后液氮保存方法冻存 HSC的 最长时间为 20 个月 该 例标本 MNC 回收率为 97 TBR为 93 7 移植后第 1天即应用细胞因 子 惠尔血 300 g d ANC 0 5 10 9 L 为 9d PLT 20 10 9 L为 11d 移植效果良好 提示采用联 合冷冻保护剂 非程控降温后液氮保存或低温冰箱 保存来冻存 HSC 是切实可靠的 这种方法操作简 便 价格低廉 安全有效 完全可以满足临床中短期 保存 HSC的要求 虽然 AHSCT时输入的 MNC数量无明显差别 但移植后造血重建时间有所不同 APBSCT 时 ANC 0 5 10 9 L的时间早于 ABMSCT P 20 10 9 L 的时间两组间无显著性差异 P 0 05 究其原因有二 一为早期 AB MSCT 时无粒 细胞集落刺激因子应用 二为外周血所含祖细胞比 例较骨髓高 本组冷冻保存效率较高 分析其原因 可能与操作有关 建议待冻标本先在 4 下预温 并 在 4 下将冷冻保护剂加入标本 动作应轻稳 本 组移植病例造血恢复时间也比文献报道结果略短 可能与细胞活性相对较高有关 我们发现输注 BMSC时几乎所有患者均出现一 过性血红蛋白尿 这与冻存时未去除红细胞 输入大 量游离血红蛋白有关 1例原有肾脏累及的系统性 红斑狼疮患者还出现了急性肾衰竭 出现的寒战 发 热也可能与此有关 少数患者出现恶心 血压轻度 升高 与二甲基亚砜有关 8 本研究冻存 B MSC的 二甲基亚砜浓度高于冻存 PBSC 同时未去除红细胞 导致大量游离血红蛋白输入体内 因此 输注 BMSC 的不良反应明显高于输注 PBSC 我们建议今后冻 存 B MSC前应去除红细胞 采用联合冷冻保护剂 非程控降温后低温冰箱 保存或液氮保存方法 对 HSC进行长期冻存的结果 尚需进一步研究观察 参 考 文 献 1 黄友章 沈建良 杨平地 等 二甲基亚砜与羟乙基淀粉程控降 温与低温冰箱降温保存造血干细胞的比较 海军总医院学报 2006 19 129 132 2 黄友章 汪声恒 杨平地 等 人骨髓细胞低温保存的研究 中 国应用生理学杂志 2001 17 359 382 3 M ugishi ma