转基因作物叶片蛋白浓度测定方法.docx

转基因作物叶片蛋白浓度测定方法托普云农转基因作物叶片蛋白浓度测定用特异性抗 Cry1C 单抗包被的微孔板和酶标记抗 Cry1C 单抗，双抗体夹心法检测 Cry1C 基因表达产物，可以高灵敏度和特异性的检测转基因植物中的 Bt-Cry1C 蛋白。一、转基因作物叶片蛋白浓度测定简介随着分子生物学和植物基因工程的不断发展，越来越多的育种工作者开始利用转基因技术获得常规育种技术难以得到的新种质和新品种。植物转基因技术最大的好处在于可以打破自然界物种间原有的生殖隔离，促进基因在不同物种间的交流，极大地丰富变异类型，增大遗传多样性，为植物新品种的培育提供丰富的育种资源。通过对基因功能的研究，筛选m目的基因，还可实现植物性状的定向改良。因此该技术自1983年首次获得转基因植物以来，便深受育种工作者青睐，得到了蓬勃地发展。至今已有30多科约200多种植物转基因成功；国际上相继有30多个国家批准3000多例转基因植物进入田间试验，并且在美国、加拿大、中国等20多个国家成功进行了商品化生产。到2006年止，全球转基因作物的商业种植面积达102亿hm2，比2005年增长13，是1996年的62倍。转基因作物品种在农业生产中日益显现出巨大潜力。植物转基因操作中，除利用抗生素抗性和除草剂抗性等选择基因排除非转化细胞而留存转化细胞，以及利用Gus和CFP等报告基因显示转基因成功外，更重要的是从分子水平鉴别出阳性转化体，明确目的基因在转基因植株中的拷贝数和转录与表达情况。本文就常用的转基因植株检测与鉴定方法作一概述，并对近期发展起来的新方法做简要介绍。二、PCR(p01ymerasechainreaction)检测技术1、优点PCR技术对目的片段的快速扩增实际上是一种在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下利用DNA聚合酶的酶促反应，通过3个温度依赖性步骤(即变性、退火和延伸)完成的反复循环。经PCR扩增所得目的片段的特异性取决于引物与模板DNA间结合的特异性。2、缺点然而，PCR检测易出现假性结果。引物设计不合理，靶序列或扩增产物的交叉污染，外源DNA插入后的重排、变异等因素都会造成检测的误差。因此常规PCR的检测结果通常仅作为转基因植物初选的依据，有必要对PCR技术进行优化，并对PCR检测为阳性的植株做进一步验证。三、Southern杂交技术Southern杂交是利用经过标记的DNA、RNA探针与靶DNA进行特异性杂交，分析外源基因在植物染色体上的整合情况(如拷贝数、插人方式)以及外源基因在转基因后代的稳定性问题。Southern杂交可以不受操作过程中的DNA污染影响和清除转化中的质粒残留所引起的假阳性信号，准确度高同，特异性强，是研究转基因植株外源基因整合最可靠的方法。已广泛应用于水稻、小麦、玉米、大豆、油菜、桃等各类作物转基因植株的检测。然而该方法程序复杂，成本高，且对实验技术条件要求较高，使其使用受到了限制。四、转基因植株外源基因表达情况的检测与鉴定尽管在mRNA水平也能一定程度地研究外源基因的表达，但存在mRNA在细胞质中被特异性地降解等情况，mRNA与表达蛋白质的相关性不高(相关系数低于05)，基因表达的中间产物mRNA水平的研究并不能取代基因最终表达产物的研究。转基因植株外源基因表达的产物一般为蛋白，外源基因编码蛋白在转基因植物中能够正常表达并表现出应有的功能才是植物基因转化的最终目的。外源基因表达蛋白检测主要利用免疫学原理，ELISA及Western杂交是外源基因表达蛋白检测的经典方法。五、基因芯片技术检测 1、优点eDNA芯片能够检测出由外源基因整合及外源基因不同的整合方式所引起的植物基因组任何微小的表达差异。将不同被测样品的mRNA分别用不同的荧光物质标记，各种探针等量混合与同一阵列杂交，可以得到外源基因表达强度差异的信息，从而实现外源基因表达调控的比对研究。2、缺点由于受到成本高的局限，使得该项技术的推广应用受到了限制，同时，一些假阳性背景也使得其应用受限。相信随着生命技术的不断向前发展，计算机处理软件的进一步开发利用，生物芯片必将得到越来越多的应用。六、试纸条技术与ELISA原理相似，不同之处是以硝化纤维膜代替聚苯乙烯反应板为固相载体。先将特异性抗体吸附在膜上，将膜放入混有样品的溶液中，蛋白质随着液相扩散，遇到抗体，发生抗原一抗体反应，通过阴性对照筛选阳性结果，并给出转基因成份含量的大致范围。试纸条方法是一种快速简便的定性检测方法，将试纸条放在待测样品抽提物中，510rain就可得出检测结果，检测过程不需要特殊仪器和熟练技能，经济便捷，特别适用于田间和现场检测。托普云农试纸条检测了转基因水稻中CrclAe蛋白质的含量，精度可达0012mgg-1。但试纸条检测只能对特定的单一靶蛋白进行检测。另外，近来有文献报道了试纸条检测技术的新发展，可利用试纸条技术对样品中某一核酸序列进行特异性的检测，并且实现了在同一试纸条上对多个核酸序列的同时检测。这无疑拓展了这项技术的应用范围，有助于检测效率的提高。七、转基因作物叶片蛋白浓度测定简介托普云农转基因作物叶片蛋白浓度测定用特异性抗 Cry1C 单抗包被的微孔板和酶标记抗 Cry1C 单抗，双抗体夹心法检测 Cry1C 基因表达产物，可以高灵敏度和特异性的检测转基因植物中的 Bt-Cry1C 蛋白。八、转基因作物叶片蛋白浓度测定技术参数托普云农转基因作物叶片蛋白浓度测定适用于玉米、棉花、大豆以及其各种农作物中转基因成分的快速定量测试。九、转基因作物叶片蛋白浓度测定储存条件及有效期托普云农转基因作物叶片蛋白浓度测定储存条件及有效期试剂盒储存于 2-8，切勿冻存；未开封试剂盒有效期 12 个月，开封后 3 个月内用完。（见包装盒上标签有效期）十、转基因作物叶片蛋白浓度测定产品编号规格：96孔检测样本：种子/叶片检测时间：约2小时有效期：12个月储存条件：28避光保存，切勿冷冻。十一、转基因检测国家标准十二、转基因作物叶片蛋白浓度测定试剂盒组份（规格）预包被板（抗 Cry1C 单抗） 12 孔8Cry1C 酶标抗体 12 ml1 瓶20浓缩洗涤液 30 ml1 瓶5抽提液/稀释缓冲液 30 ml1 瓶底物液 A 7 ml1 瓶底物液 B 7 ml1 瓶终止液 7 ml1 瓶使用说明书 1 份0ppb 阴性对照 1ml3 个不同浓度的标样：0.6 ppb，2.5 ppb，6.0 ppb 各 1ml十三、转基因作物叶片蛋白浓度测定试剂准备托普云农托普云农转基因作物叶片蛋白浓度测定试剂盒中的 20浓缩洗涤液 30 ml 加 570 ml 灭菌 ddH2O 溶解稀释至 1洗涤液，5抽提液（30 ml）加 120 ml ddH2O 稀释至 1抽提液，4存放备用。十四、转基因作物叶片蛋白浓度测定样品准备称取约 20 mg 叶片，加 0.5 ml 1抽提液（使用前 30 min 放置室温）研磨至匀浆，室温放置 30 min，测定前把样品上清液稀释 5-20 倍。测定茎干和胚乳中的 Bt 蛋白时，样品称取约 40 mg，加 1 ml 1抽提液研磨。十五、转基因作物叶片蛋白浓度测定ELISA反应依次加 100 l 阴性对照，标准品（3 个不同浓度的标样： 0.6 ppb，2.5 ppb，6.0 ppb）和待测样品至 96 孔板；用封口膜盖住 96 孔板，快速摇动平板混匀样品；37恒温箱孵育 30 min；倒掉 96 孔板中液体，每孔加入 1洗涤液 250 l 洗涤微孔板，洗板 5 次，用吸水纸拍干；按顺序在每个小孔中加入 100 l Cry1C-酶标抗体，然后重复步骤 2；37 恒温箱孵育 30 min；倒掉 96 孔板中液体，每孔加入 1洗涤液 250 l 洗涤微孔板，洗板 5 次，用吸水纸拍干；依次加入 50 l 底物 A 液，50 l 底物 B 液，重复步骤 2；37 恒温箱孵育 10 min，加 50 l 终止液，充分混匀终止反应，15 min 以内在酶标仪上读取结果。 在 450 nm 为主波长，630 nm 为次波长（或单波长 450nm）下，用空白孔校零，再读取各孔 OD 值。十六、转基因作物叶片蛋白浓度测定注意事项测定中需使用的所有试剂和 96 孔板提前 30 min 放置室温温育（否则会影响试验准确性），注意 12 连管必须温育后再从平板上取下，未使用完的预包被板条应置于有干燥剂的封口袋中密封保存；试剂使用前应充分摇匀；摇动平板混匀时注意避免样品之间交叉污染；使用洗涤液漂洗时，洗涤液需要填满每个小孔，进行充分漂洗；研磨好的样品如果不能一次全部测量，可以暂时在 4 避光保存，但是最好在 24 h 内测定；结果判读请在反应终止后 15 min 内完成。十七、转基因作物叶片蛋白浓度测定计算公式Bt 蛋白浓度（g/g）= 公司简介：浙江托普云农科技股份有限公司 农业物联网、农业信息化综合解决方案服务商托普云农潜心十二年致力于