假基因作为竞争内源性rna.docx

假基因作为竞争内源性rna: 目标预测和验证摘要：假基因可以通过各种机制来调节他们的亲本基因的表达以及其他蛋白质编码基因。其中一个调节机制就是可以作为竞争性内源RNA(ceRNA )和参与microRNA介导的交叉调节。在这里,我们描述如何用生物信息学技术来预测ceRNA 的目标及如何验证实验。1 Introduction假基因可以分为三类：假基因分为三类：未加工假基因，加工假基因和单一假基因，未加工假基因是通过基因复制而来，保留了内含子和调控序列，相比之下，加工假基因来源于反转录转座，这种假基因缺乏调控序列和内含子，但含有相当于它们亲本的5 and 3UTR序列元件unitary pseudogenes 来源于突变的蛋白质编码基因，但不具备编码功能，所有三种类型的假基因，即使被转录成mRNAye也最终无法被转录为蛋白质。重要的是，加工假基因和未加工假基因跟他们的亲本基因高度相似，经常引起一种状况就是：两种几乎完全相同的mRNA来源于基因组上的不同基因座。当然，在多种mRNA种类中只有一种是来源于亲本基因,家基因曾经被认为是遗传遗迹,在过去十年中研究的相对较少。但是，最近的研究显示：假基因是在进化中被特意保留下来的，他们参与了多种监控职能。假基因的监控职能是多方面的，并且具有亲本基因依赖性或独立性，它的作用通过假基因的正义和反义mRNA、DNA，甚至是通过由假基因编码的蛋白质和氨基酸来发挥调控作用。其中一种功能就是最近发现的通过竞争性内源RNA（ceRNA）调控基因表达。ceRNA具有一个或多个mRNA响应调控元件(MREs)，并参与到对有限的mRNA竞争性的结合中。比如，A、B ceRNA具有相同的MREs，改变A ceRNA的表达，会改变共有靶mRNA的生物使用，并且引起B ceRNA表达的改变，A、B ceRNA会采用相同的变化趋势，这种交谈反过来也可以进行。任何包含MREs的转录都能作为ceRNA，包括长链非编码RNA和假基因、mRAN。此外每一个转录本可能包含许多MREs，这大大增加了网络的复杂程度，确保对众多生物过程的精确调控。异常的ceRNA表达会导致生物调控网络混乱和疾病的产生。ceRNA首先在植物和病毒中被找到，然后我们又在脯乳动物细胞中找到具有ceRNA活性的mRNA、lncRNA和假基因。特别是我们证明了PTENP1是一种亲本基因PTEN的ceRNA，负调控了PTEN的表达，再比如KRAS1P负调控了KRAS的表达。假基因不仅跟他的亲本基因形成负调控，同时也跟所有具有MREs的转录本形成负调控，最终形成一个极为复杂的ceRNA调控网络。在本章我们讲述一下ceRNA的鉴别和用实验来证明他的方法。这种方法不仅适用于假基因的目标检测，同样适合和任何带有MREs的转录本。2 Materials2.1组织培养1组织培养制品2. 合适的细胞系生长介质3. 磷酸盐缓冲生理盐水4胰蛋白酶2.2 siRNA、DNA和双重转染1. Opti-MEM reduced 血清2. siRNAs重组液3. siRNA转染物4. pCDNA3等哺乳动物表达质粒5DNA转染试剂2.3 RNA和蛋白质分析1RNA提取设备或试剂盒2. DNAse3. cDNA合成试剂盒4. 实时PCR5. 蛋白裂解缓冲液6免疫印迹分析2.4 荧光素酶实验1避光96孔板2. 双荧光素酶分析系统3.生物发光感光板3 Methods3.1生物信息学预测假基因ceRNAs考虑到假基因和RNA尚由于多个MREs的存在而引起的放大效应，因此，要选出具有最好吻合度的假基因候选者。这里我们要通过一种计算的方法，寻找出给定假基因中最可能的ceRNA，这种计算方法是基于MREs的共有属性的统计学分析。考虑到假基因A会产生大量的数据，定义T为转录本的预定义列表，并且按照假基因与靶标之间的相互作用程度来排序，同时定义M为microRNAs的螯合度列表，|M|和|T|将会分别指出microRNAs的总数和转录本的总数。3.1.1 输入建立一个非负整数矩阵，每一行的数据来源于转录本列表T，每一列的数据来源于microRNAs列表M，PB则代表MREs的数量，该矩阵来源于microRNA数据库RNA interactions的预测数据，在这里，我们只考虑至少有一个被预测到并属于列表T的MRE。3.1.2 空假设基于MREs在所有microRNA中随机分布的空假设相异性测试：在假基因A中找出microRNA的MRE的概率为一个积累的泊松分布：（。）3.2ceRNA验证1:siRNA沉默为了调查假基因和它的ceRNA靶标之间的关系，我们评估了对假基因作用于RNA和蛋白表达的沉默效应。1. 在12孔板上每孔800 L培养基，并种植1 105 个细胞，在组织培养箱中，准备siRNA转染混合物：添加100pmol的siRNA到100 L 的Opti-MEM，并在一个单独的试管中加2L转染试剂到100 L 的Opti-MEM；温育5分钟,结合siRNA和转染试剂，继续温育15 - 20分钟, 然后定容在1ml并加至细胞。2. 4-24小时以后替换培养基3. 转染48-72小时以后，回收细胞用于表达分析，用PBS冲洗并剥下细胞，离心分离细胞，每一个孔的细胞单独分离RNA和蛋白质。4. RNA表达分析：利用cDNA合成试剂盒从1-2g的总RNA中合成cDNA,按照1:20的比例稀释cDNA, 然后每次提取4 L的稀释后cDNA用于RT-PCR。5. 蛋白质表达分析：将10-20g的总蛋白注射到SDS-PAGE中，利用特定的一抗，通过标准的Western blotting流程搜寻蛋白质编码假基因ceRNAs。6. 预期的结果：如果假基因A真实地能调节ceRNA B的表达，那么沉默假基因A应该会导致ceRNA B的下降。由于miRNA通过促进RNA的周转代谢和抑制其翻译来调控表达，所以ceRNA的交互作用只能在蛋白水平或RNA与蛋白质水平作为证据来使用。3.3 ceRNA 验证II: 3UTR 超表达为了与沉默实验互补，通过过表达假基因的3UTR来作用于ceRNA 靶标的表达也必须得到实验的证实，这样才能确定这些RNA之间的交互作用。1. PCR扩增假基因的3UTR，然后把它克隆到哺乳动物表达载体中2. 在12孔板上每孔800 L培养基，并种植1 105 个细胞3. 在组织培养箱里准备3UTR转染混合物：加入1 g质粒到100 L的 Opti-MEM；在分离管中加入3 L Lipofectamine 2000转染试剂至100 L的Opti-MEM。温育5分钟，使DNA与转染试剂结合，再温育15-20分钟，然后定容在1ml并加至细胞4. 4-24小时后替换培养基5. 转染后72小时，回收细胞并如前所述进行RT-PCR流程6. 预期的结果：如果假基因A调控ceRNA B的表达，那么在过表达假基因A的 3UTR后必然会引起ceRNA B水平的的升高，同样的该实验的结果只能在蛋白水平或RNA与蛋白质水平作为证据来使用，然后定容在1ml并加至细胞。7. 。3.4 ceRNA 验证III: 荧光素酶报告分析为了排除一些间接的实验干扰，例如：通过转录或者是RNA、蛋白质的稳定性引起的siRNA介导的沉默效应和3UTR的过表达。为了证实假基因ceRNA靶标的交互作用，建议使用带有假基因ceRNA靶标3UTR的荧光素酶报告体系。1. PCR扩增假基因ceRNA靶标的 3UTRs,然后将它们克隆到荧光素酶报告质粒中，建议使用包含萤火虫和海肾萤光素酶的荧光素酶报告质粒，它们可以提高转染的效率，2. 在12孔板上每孔800 L培养基，并种植1 105 个细胞3. 基于不同的对照需求可以参考Table 1。准备siRNA转染混合物：100 pmol的siRNA和150 ng的荧光素酶报告质粒到 100 L 的 Opti-MEM，在另一试管中，加入2 L的Dharmafect Duo 转染试剂to 100 L的 Opti-MEM.温育5分钟，使siRNA和转染试剂结合，再温育15-20分钟，然后定容在1ml并加至细胞4. 4-24小时后替换培养基5. 转染72小时以后，用PBS冲洗并裂解细胞，务必使用双荧光素酶试剂盒里的100 L温和裂解缓冲液6. 在避光的96孔板上选两孔，每孔移入20 L转染物，然后按试剂盒的操作说明检测样本荧光素酶的活性7. 为了量化荧光素酶活性，所有样品都要与对照孔进行标准化检测，以了解转染的效率，然后对试验样品进行标准化，同时确定对照孔的阳性对照和阴性对照，最后将试验样品与阳性对照和阴性对照进行标准化比较。8. 除了分析3UTR荧光素酶活性siRNA下调效应，ceRNA 3UTR荧光素酶活性的假基因3