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离子通道研究综述摘要: 近年来，随着分子生物学、电生理学和离子通道的结合研究，人们已经能从植物细胞中单独分离并克隆出离子通道基因，从而对离子通道有了进一步的了解。结合过去的经典研究实验以及国内外的最新研究成果，本文将从离子通道的主要检测手段、主要种类、药物研究、最新进展以及前景展望等几个方面进行综述。关键词：离子通道 植物K+离子通道 药物设计 中图法分类号：Q952. 5 文献标识码：AAbstract: In recent years, with the combination of molecular biology, electrophysiology and ion channel research, people had separated and cloned single ion channel gene from the plant cells, and have had a further understanding about the ion channels. Combined with the past classic research laboratory and the latest research results home and abroad, this paper will mainly introduce the testing methods, the main types, drug research, the latest progress and prospect of the ion channel.Keywords: ion channel; Plant K+ ion channels; drug design离子通道是细胞膜（包括细胞质膜和细胞内膜）上具有特殊功能的跨膜蛋白质，由于带电的离子不能自由通过磷脂双分子层，只能通过细胞膜上的离子通道进行转运，因此离子通道在生物体的生命活动中起着至关重要的作用。20世纪40年代末，Hodgkin等学者最先提出了“Na+-K+双通道模型”1振撼了神经生理学界，随后科学家们不仅对动物和人体细胞上的离子通道开展了研究，而且对植物、昆虫细胞2,3,4上的离子通道也进行了探索。离子通道具有选择性、饱和性、可控制性等多种特性5，同时又受到多种因素的调控，如膜电压、机械刺激、配体刺激和G蛋白活化6等。1、离子通道的主要检测手段离子通道的主要检测手段有电压固定技术和膜片钳技术，电压固定技术7的基本思想是用负反馈的电子线路将膜电位固定在实验所希望的一定值上，同时测量膜电流的变化，以电压与电流之比求出膜电导率的变化。该方法是用离子通道电导特性的变化来描述生物膜的兴奋与变化，以及解释有关的各种生理现象。这一技术现已成为可兴奋细胞膜上电生理研究的基本手段与分析方法。膜片钳技术，最早又称斑片电压固定技术，是在电压固定技术基础上发展起来的一种新技术。其原理是将尖端为1um的玻璃微电极吸附到细胞表面，使微电极与细胞膜形成高阻封接，从而可记录到膜上pA级的离子通道电流。很明显，高阻封接是实现膜电位固定的关键，其实质是使电极尖开口处与相接的细胞膜小区域（膜片）形成不管是在机械上还是在电学上都极为紧密的封接，从而可反映细胞上单一（或多数）离子通道的分子活动8。随着膜片钳技术的出现，目前有四种不同的记录方式：细胞吸附式、内面向外模式、外面向外模式和全细胞模式9。细胞吸附式(cell-attached patch)：将两次拉制后, 经热抛光的微管电极置于清洁的细胞膜表面，形成高阻封接，在细胞膜表面隔离出一小片膜，即通过微管电极对膜片进行电压钳制，从而测量膜电流。内面向外模式(inside-out patch)：高阻封接形成后，将微管电极轻轻提起，使其与细胞分离，电极端形成密封小泡，在空气中短暂暴露几秒钟后，小泡破裂再回到溶液中，使小泡的外半部分破裂即得。外面向外模式(outside-out patch)：高阻封接形成后，继续以负压抽吸，膜片破裂，再将玻管慢慢从细胞表面提起，断端游离部分自行融合成脂质双层而得到。全细胞模式(whole-cell mode)：在细胞吸附式的基础上，继续以负压抽吸，使电极管内细胞膜破裂，电极内液与胞内液直接相通而得到，这种方式既可以记录膜电位又可以记录膜电流。膜片钳技术广泛用于研究细胞离子通道，逐渐成为细胞水平生理功能的常用技术；膜片钳技术还可准确监测出微小的与细胞分泌有相关性的膜电容变化，因而它还是一种研究细胞分泌机制的电生理学新方法；膜片钳技术已和其他多种技术结合并得到运用，其中和分子生物学手段的结合已取得了新的进展，使得细胞上离子通道的研究进入到分子水平10。2、离子通道的主要种类2.1 K+离子通道离子通道中，K+通道是最庞大的家族，其对K+的选择性远高于其他阳离子，K+通道的存在对于营养元素的吸收，尤其是K+的低亲和性吸收具有重要的意义，同时也为其他离子的出入维持了一个较为稳定的膜电势。从生物学角度，依据不同的结构和功能可将K+通道分为三大类: Shaker家族通道、KCO家族通道和其他通道。 Shaker家族通道是在植物细胞中发现最早的一种通道；具有选择性，并且在很大程度上受电压的调控，按照受激活的电压范围及离子流方向不同可细分为3 类：内向整流 K+通道、外向整流K+通道和弱内向整流K+通道。KCO通道即钾通道（K+ channel）、钙激活的（Ca2+ activated）和外向整流（outward-rectifying）的缩写，植物的KCO通道具有区别于哺乳动物的手性结构域。其他通道有环核苷酸门控通道(CNGC)，这是一种非选择性配体阳离子门控通道，植物 CNGC结构具有6个跨膜区，其结构与Shaker 家族基因相似。2.1.1根细胞中的K+离子通道植物根系对钾的吸收牵涉到两类系统，即高亲和性吸收系统和低亲和性吸收系统。高亲和性吸收系统被认为是植物在低钾浓度下的主要吸收途径，而低亲和性吸收系统则是植物在高钾浓度下的主要吸收途径11。有研究表明，低亲和性吸收系统下主要以K+离子通道为主。有人提出，在根毛的质膜上，离子通道和转运蛋白有控制养分吸收、渗透调节和促进极地生长的功能12。2.1.2保卫细胞中的K+离子通道保卫细胞是研究离子通道以及离子转运调节的模式系统，而气孔就是植物表皮上由保卫细胞包围而成的微小孔隙，也是植物吸收CO2 、散失水分的主要途径。研究发现，保卫细胞中气孔的运动（大小的调节）与离子通道和离子运载体有关，这两种物质均存在于保卫细胞的质膜或液泡膜上13。Ca2+作为第二信使参与保卫细胞信号转导过程14，而K+以及各种阴离子则作为渗透物质直接参与调控细胞渗透势。2.2 酸敏感离子通道酸敏感离子通道（ASICs）是一类由H+门控的阳离子通道15，广泛表达于中枢与外周神经系统，神经元可以通过酸敏感的离子通道来感受细胞周围的pH值的降低。目前已知有6个成员16，它们在痛觉中发挥尤为重要的作用。ASICs家族的6个亚基可以组成同聚体或异聚体酸敏感离子通道，通过免疫共沉淀及共表达等方法已鉴定的ASICs异聚体通道主要包括ASIC1a+3、ASIC1a+2a、ASIC2a+2b、ASIC2a+3和ASIC2b+3。这些异聚体通道表现出很多与同聚体通道不同的特性如电流表型、离子选择性等。目前已利用基因敲除等技术证明，酸敏感离子通道在触觉、痛觉16、酸味觉17以及学习记忆中18具有重要作用。许多病理情况如发炎、缺血缺氧、癫痫、肿瘤等均伴随着剧烈的组织酸化，这种酸化可以使组织的pH降低两个单位，同时也会激活多种ASICs，推断ASICs在这些病理反应中可能起着传递病理信号的作用。细胞水平的研究还发现，发炎可以引起ASICs表达量的显著增加19，而常规的抗炎止痛药如阿司匹林等能直接抑制ASICs介导的电流；这些结果一方面提示了ASICs在炎症痛中的作用，另一方面也表明ASICs是此类抗炎药的新靶点。2.3阴离子通道阴离子通道在高等植物细胞的生命活动中起着重要的作用，如参与渗透调节、气孔运动、信号转导等。阴离子通道在植物胞内pH调节20，以及花粉粒早期萌发21过程中也起着决定性作用。在一般情况下，大多数阴离子的平衡电位都偏正或者稍微偏负，这主要和细胞质内阴离子的浓度有关。胞外渗透压的增加或胞内Ca2+浓度的增加22，胞外Al3+浓度的增加23都可能引起阴离子通道的激活。植物体中的阴离子通道往往与阳离子通道及膜电位变化等过程协同作用，作为整个信号转导过程的一部分，通过渗透调节来调控气孔开闭24。3、离子通道与药物研究现已发现离子通道是许多药物作用的重要靶位点，在某些药物作用下，离子通道能呈现一个或多个同时开放的不同状态。药物依不同的离子通道状态而起不同的作用，因而可以根据离子通道的结构来设计和研发新的药物。有关离子通道的药物主要有通道开放剂、通道阻滞剂、通道失活促进剂等，其中对钠通道和钙通道的研究较早，而近些年来对钾通道的研究也比较深入。随着分子生物学、分子图形学和蛋白质结构测定技术等的发展，药物设计进入了一个崭新的阶段，出现了合理药物设计（Rational Drug Design）这一新思想，它应用大分子靶标原子水平上的三维结构信息，指导和辅助药物分子的设计。由于目前研究清楚的只有极少数离子通道的三维结构，绝大多数离子通道的三维结构尚未完全被阐明，因而只能以一级结构测定的结果作为参考。未来可以通过阐明离子通道的三维结构，将其作为合理药物设计的靶标，进而给离子通道的功能研究和基于通道的药物设计带来重大突破25。在一代又一代人的努力下，人们发现了越来越多与离子通道有关的疾病，探究出了其中的原因，并且找到了相应的治疗方法。比如，心律的控制与多种离子有关，其中最为重要的是钙离子、钠离子和钾离子，当其中的一种或多种通道发生病变时，往往导致心律失常，造成心肌缺血、心动过速等严重疾病，甚至导致猝死。细胞内钙离子或者钠离子的水平长时间超出正常水平会导致血管平滑肌异常收缩，造成脑部缺血。支气管哮喘往往由支气管平滑肌异常收缩造成的支气管痉挛、变窄引起，钙离子在平滑肌细胞内的过量积累是导致支气管哮喘的重要原因之一，因此使用钾通道开放激活剂可以刺激钾通道开放，缓解支气管哮喘症状。神经细胞的兴奋性与钾、钙、钠等离子密切相关，如果供这些离子通过的通道蛋白出现变异，将引发大脑神经元过度放电而导致一系列的癫痫症状26。针对病因，人们采用多种方法对这些疾病进行治疗。一方面，采用离子通道的激活剂或者抑制剂来治疗一些疾病，如采用克罗卡林、来马卡林等钾离子通道激活剂治疗支气管哮喘；另一方面，对于先天性离子通道有缺陷的人群，应当探索基因治疗的方法，缓解其症状，并防止其遗传到下一代。4、离子通道的最新进展4.1大肠杆菌外膜蛋白 OmpF结构研究进展27外膜蛋白也被称为膜孔蛋白，是革兰氏阴性细菌外膜的主要组成成分。OmpF是大肠杆菌最重要的外膜蛋白之一，它形成的离子通道是大肠杆菌与外界进行物质交换的重要通道，能够允许不超过600Da（道尔顿）的小分子水溶性物质通过细胞膜，也是抗生素进入细胞的主要通道。目前，大肠杆菌的耐药性受到研究者的高度广泛重视，耐药性的产生给大肠杆菌疾病防治带来了严峻的考验，给畜牧业生产和医疗卫生事业等带来了严重危害，也危害到人类的健康。未来的研究热点可以是利用定点突变技术，研究外膜孔蛋白的某些重要氨基酸的功能以及外膜孔蛋白结构的变化，充分阐述大肠杆菌的耐药机制并加以利用。4.2离子与离子通道在精子获能中的调控机制28哺乳动物精子存在多种离子通道和载体，它们在精子生理和配子互动过程中发挥不同的作用。离子通道是精子、精子所在的环境和卵母细胞之间对话的工具，Ca2+、Na+、K+、Cl-、HCO-3等多种离子及离子通道在获能等精子生理过程中扮演了重要角色。因此研究精子的离子通道结构，有利于更好地理解精子功能障碍的机制，寻找有效的诊断和治疗方法，从而为因精子引起的不孕、不育提供新的解决途径，也为研发一种新型、高效、安全的避孕药物提供新的思路。5、离子通道研究的前景展望由于各种研究方法都存在一定局限性，目前离子通道的研究走向了理论与实践相结合的综合性道路。一方面，理论研究可以为实验研究节省时间及经费，同时可以阐释实验研究所不能解释的机制问题，另一方面，实验研究可以为理论研究提出佐证，从而验证理论模型的正确性。离子通道研究的综合不仅涉及理论方法和实验方法内部的综合，还出现了实验与理论之间、学科之间、科研队伍之间的综合。这不仅有助于人们在分子水平上认识离子通道的结构和功能的关系，也为不同领域的科学家提供了更多的机会。科学技术是第一生产力，任何一种理论研究最终都要回归到与实际相结合的路上，同样，关于离子通道的理论研究只有达到一定高度后，才能研发出有利于人们健康和生活的药物。离子通道在关于疾病治疗和药物研发方面，的确有很大的研究潜能，未来可以先一步一步的慢慢探索出其反应机制，再向不同的方向作深入研究。1魏尔清.药理学前沿信号、蛋白因子、基因与现代药理.北京：科学出版社,1999：92-1362王震宇,张福锁.离子通道的研究进展.世界农业,1995,4：38-40 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