（微生物学专业论文）低橘霉素高色价红曲霉固态发酵研究.pdf

摘要 本试验利用紫外线和氯化锂对m o n a s c u s p u r p u r e u sg x 菌株进行复合诱变 在最佳 紫外线照射时间为8 0 秒和最佳氯化锂浓度为1 0 0 的情况下 获得了一株橘霉素产量 低 色价中等的突变菌株m s 9 突变株m s 9 发酵的红曲米色价为8 7 3 u g c i t r i n i n 含量为1 8 m g k g 将该菌株连续培养五代后 其红曲米色价为8 9 2 u g c i t r i n i n 含量为 2 6 m g k g 可见 突变菌株m s 9 的橘霉素和色素代谢是比较稳定的 以色价为目标函数 初始p h 值 x 1 初始温度 x d 接种量 x 3 乙醇浓 度 4 豆油浓度 x 5 为试验因子 选用二次饱和d 一最优设计法 r 5 2 1 d 设 计试验方案 利用d p s 和s p s s 统计软件 对试验数据进行分析 得到红曲米色价与 各试验因子的最优回归方程为 y 9 6 6 0 9 6 5 5 6 3 7 x 1 7 9 0 3 5 x 2 2 1 7 2 7 1 x 4 1 4 5 2 3 5 x 5 1 2 7 3 1 x 1 2 1 6 9 9 x 2 z 2 0 7 0 x 3 2 8 0 3 9 5 x 5 2 1 2 2 8 x l x 2 1 8 9 6 9 x l x 5 8 3 6 x 2 x 3 5 6 1 2 x 2 x 4 4 5 3 x 2 x 5 4 0 2 8 5 x 4 x 5 并在此基础上进行了单因素和双因素的效应分析 当红曲米色价达到理论最高值 1 4 11u g 时 各因素的最佳组合为 初始p h 值为3 8 初始温度为2 6 8 c 接种量为 1 3 5 乙醇浓度0 5 豆油浓度1 经过试验验证 各因子最佳组合时 红曲米 色价为1 4 2 3 u g 同时 我们将分离自茶泡上的一种坏损外担子菌 e x o b a s i d i u mv e x q n 8 的无性型 作为一种真菌激发子对突变菌株进行相关试验表明 其无性型菌株h x 的发酵粗提物 对红曲霉突变株m s 9 色素的代谢没有明显影响 关键词 红曲 红曲霉 红曲色素 橘霉素 诱变 最优回归设计 真菌激发子 a b s t r a c t i nt h i se x p e r i m e n t w es e l e c t e do n eo r i g i n a ls t r a i nm o n a s c u sp u r p u r e u sm a r k e dg x c h a r a c t e r i z e db yi t sh i g hl e v e lo fp i g m e n tp r o d u c t i o nah i g h e rp i g m e n t sv a l u e t h e n t h e o r i g i n a ls t r a i nw a st r e a t e dw i t hu va n dl i c l w i t ht h ee x p o s u r et i m eu n d e ru v 嬲8 0 sa n d t h ec o n c e n t r a t i o no fl i c ii nt h em e d i u ma s1 0 9 6 0 t h eo p t i m a lm u t a t e ds t r a i no fm o n a s c u s n a m e ds 9w a so b t a i n e da n dd e t e c t e db yu l t r a v i o l e ts p e c t r o m e t e r w i t ht h ec o n t e n to fc i t r i n i n a s2 6 m g ga n dt h ep i g m e n t sv a l u e 硒8 9 2 u gi nr e d y e a s tr i c e 越a f t e ri n c u b a t e df o rf i v e s u b s e q u e n tg e n e r a t i o n f i v e e x p e r i m e n t a lf a c t o r s o r i g i n a lp h o r i g i n a lt e m p e r a t u r e i n o c u l a t ev a l u e c o n c e n t r a t i o no fa l c o h o la n db e a n o i lw e r es e l e c t e da n dw et o o kr e d y e a s tr i c ep i g m e n t s v a l u e 豁t a r g e tt od e s i g no u re x p e r i m e n tb ya no p t i m i z a t i o nr e g r e s s i o nm e t h o d u s i n gs p s s a n dd p st oa n a l y z et h ee x p e r i m e n t a ld a t a w eo b t a i nt h a tw i t ho r i g i n a lp h3 8 o r i g i n a l t e m p e r a t u r e6 8 i n o c u l a t ev a l u e1 3 5 c o n c e n t r a t i o no f a i c o h o l0 5 a n dc o n c e n t r a t i o n o f b e a n o i l1 t h ep i g r n e n t sv a l u eo f r e dy e a s t r i c ef e r m e n t e dw a s1 4 2 3u gb ym o n a s c u s s 9 a tt h es a m et i m e t h ea n a m o r p ho fe x o b a s i d i u mv e x a n s n a m e da si xw a st e s t e da sa f u n g a le l i c i t o rc o n t r i b u t i n gt op i g m e n t sp r o d u c t i o n t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o w e dt h a t t h ef e r m e n t e dp r o d u c t i o no fh xh a dn os t i m u l a t e da f f e c to nm e t a b o l i z eo fp i g m e n t si n m o n a s c u ss 9 k e y w o r d s r e d y e a s tr i c e m o n a s c u ss p p m o n a s c u sp i g m e n t s c i t r i n i n m u t a t e o p t i m i z a t i o nr e g r e s s i o nm e t h o d f u n g a le l i c i t o r 第一章绪论 红曲古代称丹曲 起源于中国 是以红曲霉为主的一种独特的酒曲 它具有耐酸 耐高温的特性 在工艺制造上也有独到之处 是我国先人的一大发明 在 日用本草 天工开物 和 本草纲目 中均有记载 载 红曲 甘 温 无毒 主治消食活血 李时珍在 本草纲目 谷部第二十五卷记 健脾燥胃 治赤白痢下水谷 然而对红曲 及红曲霉的基础理论研究长期以来没有重视 对红曲的功能成分及作用机理研究很少 2 4 1 直到1 9 7 9 年 日本学者远藤章例从红曲霉 m o n a s c u sr u b e r 培养物中分离出一 种叫莫纳可林k m o n a c o l i n k 的生物活性物质后 才引起了全世界科学家的关注 日本 美国 欧洲国家的众多学者对红曲的功能性 安全性 药用价值 作用机理以 及代谢物的分子结构等进行了广泛而深入的研究 并取得了令人瞩目的成果 最近几 年 我国学者也开展了一系列研究 并取得了一些成果 以红曲为主要成份的药物已 正式面市 如北大维信的 血脂康 成都地奥的 脂必妥 等 已造福于广大患者 1 红曲霉在真菌界的分类地位 1 1 红曲霉属的分类地位 对于红曲霉在真菌界的分类地位 在各个时期 真菌学家的意见是不一致的 目 前多数真菌学者趋向将红曲霉属归于真菌界 t h ef u n g i 真菌门 e u m y c o t a 子 囊菌亚门 a s c o m y c o t i n a 不整子囊菌纲 p l e c t o m y h c e t e s 散囊菌目 e u r t o t i a l e s 红曲霉科 m o n a s c a c e a e 于散囊菌目下建立红曲科 从而与散囊菌科分开 红曲科 里仅一个属 即为红曲霉属 m o n a s c u sv a n t i e g h 1 2 q 1 2 红曲霉属内分类状况 自1 8 8 4 年 v a n t i e g h e m 建红曲霉属以来至今百余年间 文献中已经有2 9 种种名的 记载 见下表1 1 t 15 1 表1 1 文献中曾出现过的红曲霉种名 t a b 1 1m o n a s c u ss p p i nt h ep a p e 璐 生州土学2 0 0 6 届硕士学位论文低捕霉素高色价的红曲霉固态发酵研究 ma l b i d u ss a t o 发白红曲霉 ma l b i d u sv a r g l a b e rs a t o 光滑发白红曲霉 ma n k a n a k a s s a w ae ts a t o 红曲红曲霉 ma n k av a r r u b e l l u s s a t o 稍红红曲红曲霉 ma r q n e o 1 1 ss a t o 蛛网状红曲霉 ma u r a n t i a c u sl i 橙色红曲霉 fb a r k e r id a n g e a r d 巴克红曲霉 m 6 印o r l l 5 f r a s e r v a r x 双孢红曲霉 m e r e m o p h i l u s h o c k i n g p i t t 旱生红曲霉 m f l o r i d a n u sc a n n o n b a m a r d 佛罗里达红曲霉 m f u l i g i n o s u ss a t o 烟色红曲霉 m h e t e r o s p o r u s h a 嘞s c h r o t e r 异孢红曲霉 m k a o l i a n g t s a i h s e u s h e n 高粱红曲霉 m l u n i s p o r a su d a g a w a b a b a 新月红曲霉 m m a j o rs a t o 常见红曲霉 mm u c o r r o i d e v a nt i e g h c m 毛霉状红曲霉 mo l e ip i d a l l u s 油脂红曲霉 m p a l l e n sc a n n o n a b d u l l a h a b b a s 苍白红曲霉 m p a x x il i n g e l s h e i m 柏斯红曲霉 m p i l o s u ss a t o 从毛红曲霉 m p u b i g e r l i ss a t o 软毛红曲霉 肛p u r p u r e u sw e n t 紫色红曲霉 mr u b e rv a nt i e g h e m 红色红曲霉 m r u b i g i n o s u ss a t o 锈色红曲霉 m r u b r o p u n c t a t u ss a t o 红斑红曲霉 ms a n g u i n e u sc a n n o n a b d u l l a h a b b a s 血红红曲霉 ms e r o r u b e s c e n ss a t o 变红红曲霉 mv i n is a v u l e s c u h u l e a 葡萄酒色红曲霍 m v i t r e u ss a t o 透明红曲霉 2 墙州大学2 0 0 6 届硕士学位论文低橘霉素高色价的红曲霉固态发 堑壅 1 9 9 9 年 l a k r o d 等 5 7 1 运用r a p d 技术分析2 5 株红曲霉的系统发育关系 2 0 0 2 年 c h a i s r i s o o k 4 9 1 根据营养亲和群对红曲霉进行分析 建立的亚类 与l a k r o d 根据r a p d 建立 的亚类不一致 2 0 0 3 年 h o u n gg p a r k s h u n g c h a n gj o n g 2 9 1 以大亚基 l s u d 1 d 2 区域作为遗传标记 比较分析了其r r n a 基因序列 得到的红曲霉系统发育分析结果与 前人的研究仍不一致 因此 在红曲霉的分类地位和分子发育进化上仍存在较大的争 议 尚需完善 2 红曲的医疗保健功能 2 1 降胆固醇及降血脂作用 1 9 7 9 年 远藤章 2 0 从红色红曲霉 膨r u b b e r 发酵液中分离得至u m o n a c o l i nk 后 至今已从红曲霉发酵产物中分离至u m o n a e o l i nl m o n a c o l i nj m o n a c o l i nk m o n a c o l i n m 和m o n a c o l i nx 等1 1 种化合物 在胆固醇的合成途径 列中 h m g c o a 还原酶是控制 体内胆固醇合成的关键酶 而m o n a e o l i n 类化合物是h m g c o a 还原酶的竞争性抑制剂 它可以有效减少或阻断内源性胆固醇的合成 其中以m o n a c o l i nk 的活性最为显著 m o n a c o l i n k 有内酯式和酸式两种结构 化学合成药洛伐他汀为内酯式m o n a c o l i n k 需在体内水解成相应的酸式而发挥药效 由于需要消耗体内的羟基酯酶 长期使用会 增加肝肾负担 其常见副作用还有腹痛 腹泻 便秘 恶心 呕吐及消化不良等胃肠 道症状 天然红曲中的m o n a c o l i nk 多为酸式 其空间结构与体内h m g c o a 更为接近 无需水解 直接发挥抑制体内胆固醇合成的作用 其活性较内酯式高约一倍 5 引 临床 试验表明 当血液中m o n a c o l i nk 的浓度达到0 0 0 1 一o 0 0 5 p g m l 时 体内胆固醇的合成 就会受阻f 5 8 1 2 2 降血压作用 红曲具有活血化瘀功效可以追溯到古代 在 本草纲目 和 日本草 中就有记 载红曲具有 酿酒 破血行药势 杀山岚瘴气 治打补损伤 活血化淤 由于淤滞腹 痛 跌打损伤等 1 9 8 7 年 小滨靖弘等 7 经研究发现 红曲具有降血压的作用 经实 验分析后 认为其降血压物质为红曲菌所产生的y 氨基丁酸 g a b a 1 9 9 2 年 迁 启介n u 及其同事利用s h r 大白鼠 本态性高血压症大鼠 进行了一系列的实验 发现 米曲霉及红曲霉 尤其是红曲霉具有很强的降血压作用 经实验分析后 也认为红曲 中的降血压物质为g a b a 主要存在于红曲霉发酵液中 日本国立营养研究所曾经进 行了将红曲霉培养物添加到饲料的动物实验 发现添加o 2 0 3 的红曲霉培养物的饲 墙州击学2 0 0 6 届硕士学位论文低搞霉素高色价的红曲霉固查垄 堕 料可使患有先天高血压症老鼠的血压由超过1 9 0m m h g 降到1 8 0 m m h g 以下 7 j o 2 3 降血糖作用 山内等曾直接以红曲菌的培养物做饲料进行动物试验 除确定含有 红曲培养物 的饲料可有效地使兔子的血清胆固醇降低1 8 2 5 之外 又额外发现所有的试验兔子在 进食饲料之后的半小时内血糖降低2 3 3 3 而在l d 时之后的血糖量仍比对照组下降 了1 9 2 9 不过其有效成份尚待进一步分析鉴定 4 0 2 4 治疗骨质疏松作用 目前 骨质疏松症在世界常见病 多发病中居第7 位 现患病人数超过2 亿人 3 2 1 目前认为与下列因素有关 激素因素 雌激素 甲状旁腺素 营养因素 钙磷代谢 其它微量元素和蛋白质 运动因素 免疫因素 而维生素d 在众多因素中均发挥重 要作用 麦角固醇 e r g o s t e r 0 1 又称麦角甾醇 它是脂溶性维生素d 2 的前体 经紫 外线光化学反应生成维生素d 2 维生素d 2 在调节生命代谢功能上有重要作用 它能促 进人体对钙 磷的吸收 能有效预防和治疗婴幼儿维生素d 缺乏性佝偻病 并对骨折 骨结核 龋齿等病症也有较好的预防和治疗作用 作为饲料添加剂使用的维生素d 能 显著增加家禽 鸟类的产蛋率和孵化率 毛宁口5 1 等报道红曲菌除产红曲红色素外 还 产较高的麦角固醇 2 0 0 0 年美国科学家发现红曲具有预防骨质疏松的作用 并且它与 一般的单纯补钙不同 它能防止钙流失 因此能从根本上解决问题 其中起作用的应 为红曲中的麦角固醇 1 2 5 抗癌功能 现在认为红曲中起抗肿瘤作用的是m o n a c o l i n k 形成的碱金属盐 土族金属盐 也有可能为红曲色素的梦那玉红 m o n a s c o r u b r i n e 梦那玉红具有活泼的羟基 易 与氨基反应 所以不但可以治疗胺血症 而且是优良的防癌物质 m o n a c o l i nk 能降低 肝癌细胞的核分裂指数和n a k a t p 酶的活性 并对体外培养的肝癌细胞的增殖具 有明显的抑制作用 2 6 其他营养保健功能 毛宁等 2 5 检测了3 株红曲菌丝体里的蛋白质含量达到3 0 左右 而且含有1 7 种氨基 酸 必需氨基酸占7 0 左右 中国商办工业报道红曲菌丝体里的常量元素磷含量最高 比大豆高出好几倍 此外 菌丝体里还含有微量元素f e z n m n c r 等 c r 与人体 抗衰老有关 z i l 是人体大脑发育必需的元素 缺z n 会导致智力下降和生长发育不良 4 墙 i f 大学2 0 0 6 届硕士学位论文低橘霉素高色价的红曲霉固态发酵塑究 3 红曲色素的结构 功能与应用 近年来 化学合成色素毒性问题已逐步引起人们的关注 其中有些化学合成色素 确证其有毒 已被禁止使用或限制使用 为满足食品及化妆品工业的需求 需要大力 开拓和提倡天然色素 红曲色素是一种天然色素 是红曲霉的次级代谢产物 红曲色素主要有6 种成分 其中红色色素 黄色色素和紫色色素各两种 它们的 化学组成和结构见图1 1 这6 种色素的物理化学性质各不相同 具有实际应用价值的主要是醇溶性的红色 素 红斑素和红曲红素 红曲色素中的黄色成分约占5 性质比红色素稳定 但其含 量少 红曲色素中的红 紫两种色素的分离效果不好 故一般混合使用 捌 红曲色素具有对p h 稳定 耐热 耐光 不易被氧化还原 不受食品中常见金属离 子的影响 对但蛋白质染色好以及抗菌 抗癌等特点 1 7 l 在古代 我国就已利用红曲米者色各种食品 例如用它酿造红曲黄酒 香肠着色 酱 腐乳和粉蒸着色等 现在用它制成着色剂用于各种调味品 糕点 禽类 火腿 等食品 红曲色素色调纯正 水溶 醇溶清亮透明 已广泛应用于肉制品 糕团 糖 果 饮料 医药 化妆品等行业中 特别是红曲色素在发酵香肠中代替亚硝酸盐发色 的应用取得很好效果1 1 7 1 青州大学2 0 0 6 届硕士学位论文低橘霉素高色价的红曲霉固态奎 堕 图1 1 红曲色素的结构 f i g 1 1t h ec h e m i c a ls t r u c t u r e so fm o n a s c u sp i g m e n t s 4 红曲中橘霉素含量的标准 自1 9 9 5 年法国人b l a n c d 8 1 发现红曲霉的两个菌株紫红曲霉c b s l 0 9 0 7 和红色红曲 霉v a nt i e g h e n 能产生具有肾毒性并有致畸 致癌作用的真菌毒素橘霉素以来 红曲 产品的安全性已引起全世界的广泛关注 同时也使各国对红曲的研究进入了一个新阶 段 纷纷出台一系列限制橘霉素含量的措施 日本率先制订出红曲色素中橘霉素国家限量标准0 2 m g k g l 2 0 1 美国食品药品管理 局明确提出 对红曲色素中含有的橘霉素必须进行安全性评价 合格后方可作为食品 添加剂使用 欧洲某些国家也正在制订严格限制我国出口红曲中橘霉素含量的新标 准 生产红曲的菌种必须经过鉴定 生产过程经过认定 红曲产品进行橘霉素检测 只有不含桔霉素的产品才被允许进口和销售 因此 橘霉素问题已成为限制我国红曲 产品出1 2 1 的瓶颈 降低红曲产品中橘霉素含量是一个迫切需要解决的课题 荷兰u t r e c h t 大学的研究者对收集的各种红曲样品也进行了分析 发现都含有橘霉 素 含量在o 2 1 7 i m g k g l o 中国疾病预防控制中心营养与食品安全所曾于2 0 0 1 年对 我国食品工业用红曲霉产桔青霉素能力进行了研究 结果显示 所试验的3 5 个菌株在 大米培养基上均产橘霉素 3 0 个株菌在液体培养基上产毒 两种培养基上的产毒范围 分别o 2 8 2 4 5 8 8 0 m g k g 和0 0 9 5 5 6 5 m g k g 1 引 现在我国尚未制定出红曲产品中橘霉素含量的国家标准 5 红曲中部分活性物质分子水平的研究进展 红曲霉代谢产物如胆固醇酶抑制剂m o n a c o l i nk 色素 真菌毒素橘霉素等均是 聚酮体类物质 表明红曲酶蕴藏着丰富的聚酮体合成酶基因 p k s s 6 3 1 目前为止 有关红曲中聚酮体合成酶编码基因仅报道了两例 紫色红曲霉橘霉素 编码基t 骄n s l 的e d n a 序列 但尚未见功能鉴定的报道 此外 台湾食品工业研究所 和十几家企业合作完成了m p u r p u r e u s 的全基因组序列草图 但尚未完成注释工作 序 列也未公布 有关红曲霉天然代谢产物包括聚酮体的途径基因簇和途径调控的研究国内外都 尚处于起步阶段 还有巨大的工作和艰巨的任务需要去完成和解决 任重而道远 6 墙州大学2 0 0 6 届硕士学位论文低橘霉素高色价的红曲霉固态发酵研究 6 本论文研究的内容及意义 本研究对一株色素含量高的紫色红曲霉 m p u r p u r e u sg x 菌株进行紫外线和氯 化锂复合诱变 以期获得低产橘霉素 高色价的稳定突变株 然后根据最优回归设计 原理 找到突变菌株高产色素的最适固体培养条件 为以后工业化生产提供重要的参 考价值 本研究内容是贵州省科技计划课题 新型 三高一低 优质红曲产品研发 的一 部分 课题任务合同编号 黔科合g y 字 2 0 0 5 3 0 2 7 7 第二章红曲霉菌株的诱变育种研究 1 前言 1 1 诱变育种的原理和方法 诱变育种的理论基础是突变 突变主要包括染色体畸变和基因突变两大类 染色 体畸变指染色体或d n a 片断发生缺失 易位 逆位 重复等 基因突变指的是d n a 中的碱基发生变化即点突变 诱变育种是利用各种物理和化学等诱变剂处理微生物细 胞 提高基因突变频率 再通过适当的筛选方法获得所需的高产优质菌种的诱变方法 4 1 1 常见的诱变剂包括物理 化学和生物三大类 见下表 表2 1 常用的各类诱变剂 t a b 2 1t h ev a r i o u sm u t a g e ni nc o m m o nu s e 诱变育种中应注意的几个问题 1 选择简便有效的诱变剂及合适诱变量 2 挑选优良的出发菌株 3 所处理的细胞必须是处于均匀的单细胞悬浮液状态 4 利用复合处理的协同作用 5 设计和采用高效筛选方法 1 2 几种有效的诱变育种方法 1 2 1 紫外线 紫外线是一种使用最早 沿用最久 应用广泛 效果明显的微生物诱变剂 也是 目前使用最多的一种诱变剂 其诱变率高 且不易回复突变 省纠大学2 0 0 6 届硕士学位论文低桶霉素高色价的红曲霉固态客 塑 紫外线是一种多功能的诱变剂 当照射微生物可以使其d n a 与蛋白质交联 嘧啶与尿嘧啶之间水合 d n a 断裂 形成嘧啶二聚体 其中最重要的突变原因嘧 二聚体的形成 1 3 l 1 2 2 亚硝酸 亚硝酸很不稳定 易分散放出n o 及n 0 2 n o 见空气变成n 0 2 可使d n a 子上的嘌呤或嘧啶碱基氧化 并进行脱氨基作用最后由羟基取代了氨基 因此h n 常引起碱基缺失和置换的突变 h n 0 2 诱变效率高 易于控制 毒性小 1 2 3 激光 激光技术是2 0 世纪6 0 年代发展起来的 1 1 新兴学科 1 9 6 1 年l r s o l o n 等发 了 激光的生理作用 这是有关激光生物学的第一次报道 以后随着激光研究成 的发展 国内外近几十年来有关激光生物学方面的研究报道越来越多 激光对各种 物均能产生生物学效应 一般公认 激光对生物组织的效应有热 光 压力和电磁 四种 蚋 激光在动物 植物方面研究和应用较多 近年来 微生物学者逐渐将其引入 生物育种领域 并取得了一定的成就 1 9 9 7 年 陈五岭教授1 2 6 首次用氦 氖激光辐射香菇菌丝体 选育出几株生长率 亲本明显加快的 过氧化物酶 p o d 活性相应提高的诱变株 2 0 0 1 年 郭爱莲教授阳等用氦 氖激光对高木质素降解率的白腐真菌l x 进行 种 选育出的突变菌株对木质素的降解率提高了5 0 2 0 0 2 年 洪智勇 2 8 1 等用n d y a g 激光照射红曲霉孢子 使洛伐它仃的产量提 了3 6 倍 迄今为止 在实验条件下已育种成功的突变菌株有 白僵菌 纤维素酶产生菌 果胶酶产生菌 赤霉素产生菌 龟裂链霉菌 黑曲霉 红曲霉 米曲霉 青霉素产 菌 啤酒酵母 大肠杆菌等 常用的激光器有 燃料激光 铜蒸汽激光 c 0 2 激光 氦 氖激光等 诱变材料多为 菌体 孢子 原生质体等 1 2 4 原生质体诱变技术 原生质体 p r o t o p l a s t 这一术语来自于植物细胞学 在微生物的应用始于1 e 年 s a l t o n 6 1 1 为了分离细胞壁 利用溶菌酶解微球菌细胞壁 原生质体是微生物在 定酶的作用下 脱去细胞壁后所剩余的结构 由于原生质体失去细胞壁的屏蔽而觑 9 啬州大学2 0 0 6 届硕士学位论文低摘霉素高色价的红曲霉固态发酵研究 形 只能在高渗透压培养基中存活 并在合适的培养基中恢复细胞壁而再生 对环境 诱变剂等更为敏感 因此用原生质体作为诱变材料 诱变效果较传统方法更为理想 1 9 9 9 年 谌斌 3 9 1 用紫外线照射红曲霉的原生质体 使红曲霉色素产量提高了2 7 倍以上 1 9 9 9 年 郭爱莲教授 3 6 1 等用氦 氖激光诱变黑曲霉s x 的原生质体 得到淀粉糖化 酶活力提高5 1 的优良菌株 2 0 0 2 年 王卫卫教授 2 等用氦 氖激光对少根根霉原生质体诱变 使诱变株g l a 含量比出发菌株提高了2 7 6 2 1 2 5 紫外线和氯化锂 l i c l 的复合诱变 物理和化学方法结合起进行复合诱变 可以提高诱变效果 因为不同的诱变因子 作用机制不一样 主要是d n a 分子上的不同基因位点对各种诱变剂吸收阈值有较大 差异 即不同诱变剂对基因作用位点有其一定的专一性 有的甚至具有特异性 因此 多因子复合处理 可以取长补短 动摇d n a 分子上多种基因的遗传稳定性 以弥补 某种不亲和性或热点饱和现象 容易得到更多突变类型 2 0 0 4 年 朱国胜等 9 1 采用紫外线复合氯化锂诱变得到一株高产亚油酸的拟青霉突 变菌株 孙伟等 8 1 对红曲霉菌株进行紫外线和氯化锂的复合诱变 得到一株高产 m o n a c o l i n k 的突变菌株 本试验通过对红曲霉菌株进行紫外线和氯化锂的复合诱变 以期获得色价较高 橘霉素含量较低的红曲霉突变菌株 2 材料与方法 2 1 材料 2 1 1 红曲霉菌株 m o n a s c u ss p z z 分离自福建省漳州所得到的红曲米 m o n a s c u sr u b b e rz k 购自中科院微生物所菌种保藏中心 m o n a s c u s p u r p u r e u sg x 来自广西师范大学 m o n a s c u ss p x m 来自厦门酒厂 以上菌株均保存于贵州大学真菌资源研究所 1 0 货州大学2 0 0 6 届硕士学位论文低橘霉素高色价的红曲霉固态塞6 1 1 翌壅 2 1 2 实验用培养基 2 1 2 1p d a 斜面培养基 4 马铃薯2 0 0 9 切块 用水煮沸3 0 m i n 过滤取汁 加葡萄糖2 0 9 琼脂2 0 9 水补 足1 0 0 0 m l p h 自然 1 2 1 灭菌3 0 m i n 以下灭菌条件与此相同 2 1 2 2 菌丝生长培养基 s a b o u r a u d 培养基 葡萄糖2 0 9 麦芽糖5 9 蛋白胨1 0 9 酵母膏5 9 琼脂2 0 9 水1 0 0 0 m l p h 自 然 2 1 2 3 孢子活化培养基 4 6 l 蔗糖3 蛋白胨0 2 n a n 0 3o 2 k 2 h p 0 4o 1 k c lo 0 5 m g s 0 4 7 h 2 0 0 0 5 f e s 0 4o 0 0 1 p h5 0 2 1 2 4 麦芽汁琼脂培养基 1 4 l 将麦芽汁粉按4 1 0 的比例加水混合 在5 5 c 下进行糖化 过滤取汁 测定其中 的糖度 加水使其糖度为1 2 然后加入琼脂2 0 9 水补足1 0 0 0 m l p h 7 8 2 1 2 5 液体种子培养基嘲 甘油7 葡萄糖3 牛肉膏3 蛋白胨o 8 硝酸钠0 8 硫酸镁0 1 加水至1 0 0 0 m l p h 自然 2 1 2 6 固体发酵培养基 6 取大米4 0 克 放入罐头瓶 4 0 0 m 1 中浸泡1 2 h 1 2 1 灭菌3 0 r a i n 2 1 3 试剂及设备 2 1 3 1 试剂 橘霉素 美国s i g m a 公司 乙醇 分析纯 重庆川江化学试剂厂 甲醇 分析纯 重庆川江化学试剂厂 硅胶 化学纯 青岛海洋化工有限公司 甲苯 分析纯 重庆川江化学试剂厂 乙酸乙酯 重庆川江化学试剂厂 甲酸 重庆川江化学试剂厂 氯化锂 广东汕头西陇化工厂 瑶州大学2 0 0 6 届硕士学位论文低橘霉素高色价的红曲霉固查壅 堕 其他一般实验室常用化学药品 均为分析纯 2 1 3 2 设备 紫外 可见分光光度计6 0 1 0 安捷伦科技 z d 8 5 a 恒温振荡器 江苏金坛市富华仪器有限公司 多功能培养箱 上海实验仪器总厂 高速台式离心机t g l 1 6 b 上海安亭科技 上海 仪器厂 高压蒸汽灭菌锅 上海医用核子仪器厂 m l 9 0 2 磁力搅拌器 上海浦江分析仪器厂 h h 系列恒温水浴锅 江苏金坛中大仪器厂 z k 8 2 a 型真空干燥箱 上海仪器总厂 超净工作台等一般实验室常用设备 2 2 实验方法 2 2 1 红曲霉菌株的活化 将红曲霉菌株转接于s a b o u r a u d 斜面培养基上 3 0 1 2 培养7 天 活化三次后取一 部分备用 剩余部分在低温下保存 以免菌种退化影响实验结果 2 2 2 红曲霉液体种子的制作 o 0 5 吐温8 0 洗活化好的菌种斜面 再分别装入无菌的三角瓶中 瓶内装有玻璃 珠 装量以铺满瓶底为宜 振荡3 0 m i n 用垫有脱脂棉的灭菌漏斗过滤 制成浓度为 1 0 6 个 m l 的孢子悬液 按1 0 v v 接种于s a b o u m u d 液体培养基中 3 0 c 2 0 0 r m i n 振荡培养4 天 2 2 3 红曲霉固态发酵 将培养4 天的红曲霉液体种子接入大米培养基中 4 m l 瓶 3 0 c 培养1 2 天 2 2 4 红曲米色价的测定 5 取红曲米样品0 5 0 0 9 放入带刻度的1 0 0 m l 具磨口塞试管中 加入7 0 7 醇至 5 0 m l 摇匀后放入6 0 c 水浴保温萃取2 h 取出冷却 必要时补充定容 用普通定性 滤纸过滤入具塞试管或三角瓶中 约滤出1 0 m l 左右即可 吸取滤液l m l 放入2 5 m l 刻 墙州又学2 0 0 6 届硕士学位论文低橘霉素高色价的红曲霉固赶鳖 堕 度试管或容量瓶中 加入7 0 乙醇稀释定容至2 5 m l 用l c m 比色皿以7 0 7 醇作空 白 在分光光度计上取波长5 0 5 r i m 测定样品萃取稀释液的吸光度 将测得的样品平 均吸光度乘以2 5 0 0 稀释倍数 即红曲米的色价 2 2 5 红曲霉色素产生周期曲线的制作 将选定的高色价的红曲霉菌株接入s a b o u r a u d 液体培养基中 培养4 天后 将液 体种子接入大米培养基中 接种量1 0 v w 4 m l 瓶 3 0 c 培养1 8 天 每两天测 定一下红曲米色价 以培养时间为横坐标 红曲米色价为纵坐标绘制色素产生周期曲 线 2 2 6 橘霉素标准曲线的制作 称取橘霉素标准品2 m g 加入2 0 m l 甲醇溶解 以此作为母液 分别吸取0 0 2 0 4 0 6 0 8 1 0 1 2 1 4 m l 于1 0 m l 比色皿中 然后往每支管中加入甲醇至1 0 m l 混匀后 以甲醇作空白对照 在紫外分光光度计上取波长2 5 4 n m 测定标样的吸光度 值 o d 值 制作出橘霉素标准曲线 2 2 7 红曲中橘霉素含量的测定 4 1 2 2 7 1 红曲米的预处理 取红曲米粉0 5 9 加入1 0 m l 甲醇 超声波处理2 0 m i n 取上清液l m l 1 5 0 0 0 转 分 离 t m 0 分钟 待测 2 2 7 2 橘霉素的薄板层析 t l c 2 2 7 2 1 薄板的制作1 1 9 称取3 克硅胶h 然后称取9 m 1 0 5 c m c n a 在研钵里将两者混合 研磨均匀后 在1 0c m x 2 0c n l 的玻璃板上 自然晾干后在1 1 0 c 下活化1 小时备用 2 2 7 2 2 薄板层析展开 2 7 取一定体积的甲醇溶解物 用硅胶h 进行薄板层析分离 再用展开剂 v v z v 7 3 1 展开 在紫外灯下 x 3 5 0 3 6 5n m 观察 将层析板上与橘霉素标样相 对应位置的黄绿色硅胶刮下 用甲醇浸泡静置 过滤三次 收集滤液于2 5 m l 小烧杯 中 6 0 c 水浴加热蒸发至干 加2 m 1 甲醇溶解 2 2 7 3 紫外分光光度计法测定红曲米中橘霉素的含量 肯州大学2 0 0 6 届硕士学位论文低橘霉素高色价的红曲霉固查垄 堕 用l c m 比色皿 以甲醇作空白 在紫外分光光度计上取波长2 5 4 n m 测定样品的 吸光度值 对照标准曲线得出发酵物中橘霉素的含量 2 2 8 红曲霉菌株的紫外线和氯化锂 l i c i 复合诱变 4 2 4 2 2 8 1 孢子悬液的制备j 将活化好的菌株转接p d a 斜面培养基 培养7 天后 用无菌生理盐水 约1 0 m 1 洗下斜面孢子 装入三角瓶中 内装有玻璃珠 装量以大致铺满瓶底为宜 振荡3 0 分钟 镜检分散即可 然后用无菌的垫有四层擦镜纸的漏斗过滤 制成孢子悬液 2 2 8 2 单孢子的活化 将单孢子悬液接入孢子活化培养基中 3 0 0 摇床培养1 6 2 0 h 即的活化的单孢子 悬液 取一定量活化的单孢子悬液 4 0 0 0 r m i n 离心1 5 m i n 沉淀用无菌生理盐水洗涤 两次 再加入一定的生理盐水 调整浓度 使孢子浓度达到1 0 6 个 m l 备用 2 2 8 3 紫外线照射处理 打开紫外灯预热2 0 分钟 紫外灯功率3 0 w 取l m l 菌悬液于无菌平皿 6 e r a 中 同时制备6 份 重复操作 将平皿放在离紫外灯约为3 0 c m 垂直距离 处的磁力搅拌 器上 照射1 0 秒后打开平皿盖 同时打开磁力搅拌器 并开始计算时间 照射时间 分别为1 0 秒 2 0 秒 3 0 秒 4 0 秒 5 0 秒 6 0 秒 7 0 秒 8 0 秒 9 0 秒和1 0 0 秒 结束后将 诱变悬液放在黑暗中保存4 小时 温度控制在2 5 左右 然后在红灯下稀释诱变悬液 并涂麦芽汁平板进行培养 并计算致死率 选取合适的处理剂量 2 2 8 4 氯化锂处理 取单孢子悬液0 i m l 涂含有氯化锂的麦芽汁平板 其中氯化锂的浓度梯度设为 0 6 0 o 8 o 1 0 9 6 0 和1 2 o 每个稀释梯度对应的每个氯化锂浓度梯度做三个重复 涂 布后静置 等到菌液完全渗入培养基后倒置 于3 0 c 暗室中培养l o 天 然后观察菌 落生长情况 并计算致死率 选取合适的处理剂量 2 2 8 5 成活率 致死率的计算 将经诱变处理过的红曲霉于3 0 0 暗室中培养1 0 天 然后观察菌落生长情况 处 理前后的孢子作为活菌计数 统计存活率 致死率 存活率 诱变培养基上生长出来的菌落数 对照平板上生长出来的总菌落数 1 0 0 致死率 1 0 0 一成活率 4 墙 i i 大学2 0 0 6 届硕士学位论文 低橘霉素高色价的红曲霉固态发酵研究 2 2 8 6 紫外线与氯化锂的复合处理 将经过最佳u v 照射时间处理后的孢子悬液涂布在含有最佳诱变剂量的l i c i 的麦 芽汁平板上 于3 0 暗室中培养l o 天 2 2 8 7 突变菌株的筛选 2 2 8 7 1 突变株的保存及液体种子的制作 选取菌落特征 包括形态 颜色 生长速度等 发生变异的菌株 转接到麦芽汁 平板上连续培养7 天 用打块法接种到液体培养基中 同时固体斜面接种保存 3 0 c 1 2 0 转 分钟振荡培养4 天 2 2 8 7 2 突变株固态发酵 将培养4 天的液体种子接入大米培养基中 4 m l 瓶 3 0 培养1 2 天 2 2 8 7 2 突变株固态发酵物中橘霉素的测定 同2 2 7 2 2 8 8 突变菌株的稳定性实验 将筛选出来的突变菌株在斜面培养基上连续传接5 代 每代菌株通过固体发酵方 法测定其中c i t r i n i n 的含量 并分析菌株的稳定性 3 结果与分析 3 1 不同的红曲霉菌株产色素的差异 表2 2 不同的红曲霉菌株产色素的比较 t a b 2 2c o m p a r i s o no ft h ec o l o rv a l u eo fp i g m e n tf e r m e n t e db yd i f f e r e n ts t r a i n s 菌株 红曲米的色价 u g m o n a s c u ss p z z m o n a s c u ss p x m m o n a s c u s p u r p u r e u sg x m o n a s c u sr u b b e rz k 9 8 5 7 3 5 1 1 2 0 8 4 1 结果表明 红曲霉mp u r p u r e u sg x 菌株固体发酵时 红曲米的色价最高 色价 为1 1 2 0o g 故选择mp u r p u r e u sg x 作为原始出发菌株 对其进行紫外线和氯化锂 的复合诱变 3 2 红曲霉坛p u r p u r e u s g x 色素发酵时间的确定 对所挑选的出发菌株的色素产生特性进行分析 以确定发酵时间 1 2 0 0 1 0 0 0 芒8 0 0 v 6 0 0 翥4 0 0 2 0 0 0 1 23 456 78 91 01 11 2 1 3 1 4 1 5 1 6 1 7 1 8 培养时间 天 图2 1 红曲霉的色素代谢曲线 f i g 2 1p r o d u c t i o nc u r v eo fm o n a s c u sp i g m e n t sb ym g x 从图2 1 中 我们可以看出在前三天 红曲霉色素产生的很少 从第三天到1 0 天 红曲霉色素的产生迅速增加 并在第1 4 天左右达到最大值 并趋于一定时间的稳定 根据我们的试验结果 选择培养时间1 4 天作为我们获取色素的最佳发酵时间 3 3 橘霉素标准曲线 根据c i t r i n i n 在2 5 4 n m 波长下有最大吸收峰的原理 绘制c i t r i n i n 含量标准曲线 警0 5 o 0 4 0 3 0 2 0 1 0 0 2 4681 01 21 4 橘霉素的浓度 1 i g m 1 图2 2 橘霉素的标准曲线 1 6 瑶 l i 大学2 0 0 6 届硕士学位论文低橘霉素高色价的红曲霉固态发酵研究 f i g 2 2t h e s t a n d a r dc u r v eo fe i t r i n i n 将上图中的数据即c i t r i n i n 标准曲线经e x c e l 软件分析 其回归方程为 y 0 0 3 0 8 x 0 0 0 1 1 7 相关系数 r o 9 9 9 9 4 5 x 样品中c i t r i n i n 的浓度 1 a g m 1 y 样品在2 5 4 n m 下的吸光度值 方程表明 c i t r i n i n 在2 1 t g m l 1 4 1 t g m l 范围内与吸光度里良好线性关系 利用上面的标准曲线 分别检测样品中的c i t f i n i n 的含量 并进行比较 3 4 红曲霉菌株的紫外线和氯化锂 l i c i 复合诱变 3 4 1 孢子悬液的制备 下面是红曲霉单孢子悬液在显微镜下镜检的图片 图2 3 红曲霉的单孢子 f i g 2 3s e p a r a t es p o r e so f m p u r p u r e u sg x 3 4 2 紫外线照射时间的选择 如图2 4 所示 红曲霉孢子在紫外线照射时间为7 0 9 0 s 时 致死率达到9 0 以 上 故选择7 0 9 0 s 作为处理剂量 省州大学2 0 0 6 届硕士学位论文低橘霉素高色价的红曲霉固态巷 堕 1 02 0 3 04 0 5 06 0 7 0 8 0 9 0 1 0 0l l o 照射时间 s 图2 4 紫外线照射时间对致死率的影响 f i g 2 4e f f e c t so ft h ee x p o s u r et i m eu n d e r u v