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荧光分光光度技术 张培敏 一 实验目的 1 了解荧光分光光度计的主要结构及工作 原理 2 掌握荧光光度计的操作技术 3 掌握测定维生素片B2中核黄素的实验方 法 二 基本原理 一 定性分析 根据激发曲线 发射 曲线的特性 二 定量分析 稀溶液中 荧光强度 与浓度成正比 三 荧光分析法的特点 灵敏度高 选择性好 一 定性分析 荧光 磷光 光致发光 照射光波长如何选择 1 荧光 磷光 的激发光谱曲线 ex 固定测量波长 选最大发射波长 化合物发射的 荧光 磷光 强度与照射光波长的关系曲线 图中曲 线I 激发光谱曲线的最高处 处于激发态的分子最多 荧光强度最大 通过激发光谱 选择最佳激发波 长 发射荧光 磷光 强度最大的激发光波长 常 用 ex表示 2 荧光光谱 或磷光光谱 emem 固定激发光波长 选最 大激发波长 化合物发射 的荧光 或磷光强度 与发 射光波长关系曲线 图中曲 线II或III 通过发射光 谱选择最佳的发射波长 通过发射光 谱选择最佳的发射波长 发射荧光 磷光 强度最 大的发射波长 常用 发射荧光 磷光 强度最 大的发射波长 常用 emem 表示 表示 200260320380440500560620 荧光激发光谱荧光激发光谱 荧光发射光谱荧光发射光谱磷光光谱磷光光谱 室温下菲的乙醇溶液荧 磷 光光谱室温下菲的乙醇溶液荧 磷 光光谱 3 激发光谱与发射光谱的关系 a Stokes位移a Stokes位移 激发光谱与发射光谱之间的波长差值 发射光谱 的波长比激发光谱的长 振动弛豫消耗了能量 b 发射光谱的形状与激发波长无关b 发射光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级 吸收不同波长的能 量 如能级图 2 1 产生不同吸收带 但均回到 第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态 产生波长一定的荧光 如 2 c 镜像规则c 镜像规则 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱 与激发光 谱形状一样 成镜像对称关系 二 定量测定 If 荧光相对强度 f 量子效率 I0 入射光强度 吸收系数 b 光程长 c 浓度 该式只有 bc 0 05时才成立 即荧光测定只 有在极稀溶液中才可测定 否则校正曲线向浓度 轴弯曲 If 2 3 f I0 bc KC 三 荧光分析法的特点 1 灵敏度高 前面已述 荧光分析法的灵敏度比吸光分析法 高2 4个数量级 检测下限在0 1 0 001 g mL 1 之间 主要原因有二 一是荧光信号是在暗背景下检测的 噪声 小 较微弱的信号也能被检测 且可以高倍放 大 二是荧光强度和激发光强度成正比关系 可 以提高激发光的光强以增大荧光强度 2 选择性好 荧光分析法的光谱比较简单 特征性强 而且有 激发光谱和发射光谱 选择的余地大 如果某几种 物质的激发光谱相似 就可以从它们发射光谱的差 异进行鉴别和分析 相反如果发射光谱相似 可以 从它们激发光谱的差异进行鉴别和分析 尤其是有 机化合物的分析更是如此 对于金属离子的分析来说 往往选择性不太高 这是由于金属离子的分析往往是通过产生具有荧光 特性的配合物或荧光猝灭进行测定 而且荧光特性 又往往取决于配位体 不同金属离子经常与同一配 位体形成相似的配合物 具有相似的荧光特性 故 会互相干扰 3 荧光法提供比较多的物理参数 可提供包括激发光谱 发射光谱和三维光谱以 及荧光强度 荧光效率 荧光寿命等多种物理参 数 这些参数反映了分子的各种特性 能从不同 角度提供研究对象的分子的信息 荧光分析法的缺点是应用还不够广泛 这是因 为本身能发射荧光的物质相对较少 用加入某种 试剂使非荧光物质转化为荧光物质来进行分析 其数量也还不多 此外 荧光分析的灵敏度高 测定时对环境因素较为敏感 干扰因素较多 四 产生荧光的条件 1 分子具有与辐射频率相应的荧光结构 内 因 2 吸收特征频率的光后 应可产生具一定量子 效率的荧光 即量子效率 足够大 发射的光量子数 吸收的光量子数 五 影响荧光及强度的因素 1 跃迁类型 具有 及n 跃迁结构的分 子才会产生荧光 且具 跃迁的量子效率比n 跃迁的要大得多 芳香族分子 2 共轭效应 共轭度越大 荧光越强 平面环系统 绝大多数荧光物质含有芳香环或杂环 3 刚性结构 分子刚性 Rigidity 越强 分 子振动少 与其它分子碰撞失活的机率下降 荧 光量子效率提高 如荧光素 大 与酚酞 0 芴 1 与 联苯 0 18 4 取代基 给电子取代基增强荧光 p 共 轭 如 OH OR NH2 CN NR2等 吸电子 基降低荧光 如 COOH C O NO2 NO X 等 如苯环被卤素取代 从氟苯到碘苯 荧光逐渐 减弱到消失 5 溶剂效应 溶剂极性可增加或降低荧光强度 改变 及n 跃迁的能量 与溶剂作 用从而改变荧光物质结构来增加或降低荧光强度 6 温度 温度增加 荧光强度下降 因为内 外转 换增加 粘度或 刚性 降低 因此体系降低温度 可增加荧光分析灵敏度 7 pH值 具酸或碱性基团的有机物质 在不同pH值 时 其结构可能发生变化 因而荧光强度将发生改 变 对无机荧光物质 因pH值会影响其稳定性 因 而也可使其荧光强度发生改变 8 荧光猝灭 碰撞猝灭 静态猝灭 转入三 重态的猝灭 电子转移猝灭 自猝灭 三 荧光分析仪器主要部件 1 1 激发光源 提供能量 光源的光强度很强 高压 氙弧灯250250 800nm800nm 高压汞蒸气灯253 253 7nm 2 2 激发单色器 3 3 发射单色器 4 4 检测器 5 5 样品池 激发光的入射方向与发射光的接收方 向互成直角 1 激发光源 激发光源应具有足够的强度 适用波长范围宽 稳定等 特点 常用的光源有高压汞灯和氙弧灯 高压汞灯高压汞灯是以汞蒸气放电发光的光源 主 要有365 405 436nm 的三条谱线 尤以365nm谱线最 强 一般滤光片式的荧光计多采用它为激发光源 氙弧灯氙弧灯通常就叫氙灯 是目前荧光分光分度 计中应用最广泛的一种光源 它是一种短弧气体放电灯 外套为石英 内充氙气 室温时其压力为506625Pa 工作 时压力为2026500Pa 具有光强度大 在200 800nm 范围 内是连续光源的特点 氙灯的灯内气压高 启动时的电压 高 20 40KV 因此使用时一定要注意安全 此外 高功率的可调谐染料激光器是一种新型的荧光激 发光源 这种光源不需单色器和滤光片 具有单色性好 强度大 脉冲激光时间短而减少光敏物质的分解等优点 但是仪器设备较复杂 所以应用还不广泛 2 单色器 荧光分析仪中应用最多的单色器为光栅单色 器 称为荧光分光光度计 光栅有两块 第一块 为激发单色器 用于选择激发光的波长 第二块 为发射单色器 用于选择荧光发射波长 一般是 后者的光栅闪耀波长比前者来得长一些 在比较 低档次的荧光计中 采用滤光片作为单色器 多 使用干涉滤光片以获得纯度较好的 单色光 第 一滤光片用以分离出所需用的激发光 第二滤光 片用以滤去杂散光 瑞利光 拉曼光和杂质所发 射的荧光 3 样品池 荧光分析的样品池通常用石英材料做成 它与 吸光分析法的液池不同在于 荧光样品池的四面 均为磨光透明面 同时一般仅有一种厚度为1cm的 液池 4 检测器 简易型的荧光计可用目视检测 或用硒光电 池 光电管检测 现在的荧光计多采用光电倍增 管进行检测 检测器的方向应与激发光的方向成 直角 以消除样品池中透射光和杂散光的干扰 在现代的高级仪器中 光导摄象管用来作为光学 多道分析器 简称OMA 的检测器 它具有检测效 率高 动态范围宽 线性响应好 坚固耐用和寿 命长等优点 它的检测灵敏度虽不如光电倍增 管 但却能同时接受荧光体的整个发射光谱 5 记录 显示装置 荧光仪的读出装置有数字电压表或记录仪 现 代仪器都配上计算机 进行自动控制和显示荧光 光谱及各种参数 四 RF 5301PC操作步骤 一 测量过程 提供能量 光源 选择激发波长 吸收 照射样品 样品吸收与发射荧光 发射 选择发射波长 测量 1 定性测定 接通电源 打开电源开关 打开氙灯开关 打开 电脑 桌面RF530XPCRF530XPC 仪器自检 仪器预热2020分钟 扫描激发波长 工具栏Acquire ModeAcquire Mode 下拉菜 单spectrumspectrum 工具栏ConfigureConfigure 下拉菜单 ParametersParameters TypeType选择ExcitationExcitation EM Wavelength EM Wavelength中输入发射波长 EX Wavelength Range EX Wavelength Range中输入激发波长的扫描范围 Scanning Speed Scanning Speed选择MediumMedium OKOK StartStart 测量完毕 扫描发射波长 工具栏Acquire ModeAcquire Mode 下拉菜 单spectrumspectrum 工具栏ConfigureConfigure 下拉菜单 ParametersParameters TypeType选择EmissionEmission EX Wavelength EX Wavelength中输入激发波长 EM Wavelength Range EM Wavelength Range中输入发射波长的扫描范围 Scanning Speed Scanning Speed选择MediumMedium OKOK StartStart 测量完毕 激发光谱 激发光谱告诉我们什么 化合物吸收波长 吸收强度 溶剂吸收波长 发射光谱 发射光谱告诉我们什么 化合物荧光波长 荧光强度 拉曼和瑞利散射 2 定量分析 标准曲线制作和未知样品测量 工具栏Acquire ModeAcquire Mode 下拉菜单QuantitativeQuantitative 工 具栏ConfigureConfigure 下拉菜单ParametersParameters MethodMethod选 择Multipoint Working CurveMultipoint Working Curve OKOK EX WavelengthEX Wavelength 中输入激发波长 EM WavelengthEM Wavelength中输入发射波长 UnitsUnits中输入样品溶液浓度单位 Concentration Range Concentration Range中输入样品浓度范围 Recording RangeRecording Range中输入荧 光强度范围 OKOK Read 重复测量完所有样品溶液Read 重复测量完所有样品溶液 保存 打印 工具栏PresentationPresentation 下拉菜单 PlotPlot 选择所需打印的数据或图表或文件 printprint 标准表与标准曲线 维生素B2片剂中核黄素含量的测定 实验步骤 一 确定最佳激发和发射波长 1 配制10 g ml 1B2溶液 用5 HAc稀释 2 配制0 4 g ml 1B2溶液 用5 HAc稀释 3 search 最佳波长为 ex 452nm em 526nm 4 荧光波长暂设定在526nm处 在220 500nm波长范 围内对激发波长进行扫描 记录激发光谱曲线 5 然后将激发波长设定在452nm处 在460 700nm波 长范围内对荧光波长扫描 记录荧光光谱曲线 二 酸度的选择 于三只25ml容量瓶中各加入10 g ml 1的核黄素标 准溶液1 0ml 然后分别加1 1盐酸2 5ml 10 氢 氧化钠溶液2 5ml 用蒸馏水稀释至刻度 另一只 用5 醋酸稀释至刻度 摇匀后用酸度计或pH试纸 测定溶液的pH 并于荧光分光光度计上测出相应 的荧光强度 考察酸度对荧光强度的影响 从中 确定最佳调节pH的溶液 三 标准溶液的绘制 准确移取10 g ml 1的核黄素标准溶液0ml 0 5ml 1 0ml 1 5ml 2 0ml 2 5ml分别置于6 个25ml比色管中 用所确定的pH溶液稀释至刻 度 摇匀 测定标准系列溶液的荧光强度 四 样品测定 用移液管准确移取一定量的含维生素B2的溶液于 25ml容量瓶中 再用上述pH溶液稀释至刻度 摇 匀制成试液 在与标准曲线一致的实验条件下测 定试验的荧光强度 在标准曲线上查出维生素B2 的浓度并根据样品取样量和稀释倍数 计算出原 溶液中维生素B2的含量 mg ml 1 五 实验注意事项五 实验注意事项 作为初学者 需要对实验过程中出现的 各种现象进行必要的分析 探讨其中的 必然规律 以得出正确的结论 要正确区分瑞利散射峰 拉曼散射峰 2次 或3次光的波峰 六 思考题 1 为什么选择Ex452nm Em526nm为定量时的波 长对 2 未知液的稀释原则是什么 3 如何确定未知物的最佳激发波长和最佳发射波 长 七 开放性实验 1 验证 发射光谱的形状与激发波长无关发射光谱的形状与激发波长无关 2 如何区别瑞利散射峰 拉曼散射峰 2次或3次 光的波峰 附件 荧光分析法新技术简介 1 同步荧光测定法 同步荧光法是同时扫描激发光和发射光波长下绘制的光谱 由测定的 荧光强度信号与对应的激发波长 或发射波长 构成光谱图 根据激 发单色器和发射单色器在同时扫描过程中彼此间所应保持的关系 同 步荧光测定法还分为三种类型 第一种 在同时扫描过程中使激发波 长 ex 和发射波长 em 保持固定的波长间隔 即 ex em 常数 这种方法称为 固定波长同步扫描荧光测定法 即习惯 上讲的同步荧光测定法 是最早提出的同步扫描技术 第二种 以能 量代替波长关系 在两个单色器同时扫描过程中 使激发波长和发射 波长之间保持固定的能量差 即频率或波数差 这种方法称为 固 定能量同步扫描荧光测定法 第三种 使激发和发射单色器以不同 的速率同时扫描 即 ex em 常数 而是时间的线性函数 这 种方法称为 可变角同步扫描荧光测定法 同步荧光测定法具有使光 谱简单 光谱窄化 减少光谱重叠 减少散射光影响 提高选择性等 优点 2 导数荧光测定法 自从二十世纪50年代初期导数光谱技术应 用于分光光度测定之后 使分光光度法的 选择性得到很大的改善 直到1974年 导 数技术才引进到荧光分析 在解决荧光测 定中的背景干扰和谱带重叠问题上收到良 好的效果 已被证明是一种提高荧光分析 选择性的有效手段 导数荧光测定法的基 本原理与分光光度法类似 3 三维荧光光谱测定法 普通荧光分析所得的光谱是二维光谱 即荧光强度随波长 激发波长 或发射波长 的变化而变化的曲线 如果同时考虑激发波长和发射波 长同时对荧光强度的影响 则荧光强度应是激发波长和发射波长两个 变量的函数 描述荧光强度同时随激发波长和发射波长变化的关系图 谱 称为三维荧光光谱 三维荧光光谱是近一 二十年中发展起来的