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4 2 卷2 期 龇年4 月 微生物学报 A c 缸舭m 如g 扣 舶l 缸4 V n l4 2 u 2 A 叩l2 J 2 限制和修饰系统砌B 在构建抗噬菌体菌株中的作用 孔健1 J t eJ 0 s 印h s e n 2马桂荣1 1 山东大学微生物技术国家重点实验室济南2 5 0 1 0 0 2 丹麦皇家畜牧农业大学乳制品和食品科学系丹麦 关键词 乳酸乳球菌 噬菌体 限制和修饰系统 乳制品发酵 中田分粪号 Q 9 3 3文献标识码 A文章编号 0 0 0 l 6 2 0 9 2 0 0 2 0 2 一0 2 4 6 0 5 限制和修饰 陀 一c t i o n a n d 皿础6 c a o n M 系统是指由限制性内切酶和甲基化酶组成的单亚基或 多亚基复合酶系统 两者通常成对出现 具有相同的D N A 识别位点 其作用相反 R M 系统在脖 棱生物 中普遍存在 在保护细胞免遭外源病毒侵害方面具有重要作用 作为发酵剂的乳酸乳球菌在乳制品发酵中具有霞要作用 但这类菌株楹易遭受噬菌体感染 导致菌 株产酸力降低 甚至发酵失败 造成严重的经济损失 所以在乳制品发酵过程中防止噬菌体感染就成为 分重要的问题 通过自然筛选或诱变处理等手段筛选噍茁体不敏感突变株以及利用基因克隆技术构建抗噬菌株菌 株在发酵过程中起到了良好的抗噬菌体感染效果 质粒n l w 5 6 6 分离于乳酪发酵荆乳酸乳球菌 J 小眦D 曲 赫m b B p 击 w 5 6 4 发现携带有一种新的编码限制和修饰 M 系统的基圉 B I 0 1 G 8 柚k 注册号为A B 4 7 0 7 1 本文通过电转化方法将R M 系统 如B 导人到不问的乳酸乳球菌 中 分析含有R f 系统L k B I I I 的工程菌株对噬菌体的抗性 1 材料和方法 l l 首株 噬菌体和培养基 1 I 1菌株和噬菌体 本实验所有菌株和噬菌体列表于1 1 12 培养基 乳酸乳球菌培养基 G M l 7 为M 1 7 培养基 D l 忙o 加0 5 葡萄糖 转化培养基 s G 川7 为M 1 7 培养基 加1 葡萄精 25 m m o l 儿M g c k 2 5 m 啪 Lc a c l 5 p g m L 氯霉翥 嘴菌体感染培养基为 c M l 7 培养基加5 m m 0 1 儿c a c l 1 2 质粒蜊A 的提取 工 础培养刊指数生长期 离心收集菌体 菌体细胞用l o m m L 溶葡酶3 7 酶解2 0 m i n 片jG l A G E Np l a s m i dM i n i p 陀pk i t c l I a t s w o n h u s A 按照实验说明提取质粒D N A 1 3 嚏蕾体效价 e d e n c y0 f 山血g E o P 的舅定 噬菌体在抗性菌株中的噬菌斑数与在敏感菌株中的嘴菌斑数之比 敏感菌株的E O P 为l 噬菌斑 的测定采用双层平板法 1 4 电转化 参见H n k 和N e s 的方法 1 电穿孔仪为c e n eP L d B e r B i o R a d 公司产品 脉冲参数1 2 5 k V n 2 5 和2 0 0 n 作者简介 孔健 1 9 6 4 女 山东菏泽人 山东大学微生物技术国家重点实验室副教授 博士 主要从事乳酸菌 应用基础性研究 收羲日期 2 0 0 1 1 1 舶 修回日期 2 1 1 2 一t 9 万方数据 2 期孔健等 限制和修饰系统L l n m I I 在构建抗噬菌体菌株中的作用 2 4 7 2 结果 2 1 含有R M 系统L k B 的董株对噬曹体的抗性 R M 系统恤B I 蕞因位于质粒叫w 5 6 6 上 在转化实验中为了易于筛选古有彤M 系统踟B u l 的转 化于 将廿町6 6D N A 经c k I 内切酶不完全消化 所得片段与来自于质粒p v c 5 的氯霉素扰性基因c a t 连 接 构建了携带有完整 M 系统 如B I 叉具有氯霉素抗性标志的质粒 K l 1 将质粒p J K l 分别转化到无质粒且嘴菌体敏感的菌株 Z 州厶M G l 6 1 4 和无质粒且携带有染色体编 码的R M 系统I 型的菌株工胁几1 4 0 3 中 在含有氯霉紊平板上选取苗落 测定转化子对噬菌体的抗 性 茁株 赫M c l 6 1 4 是圆头状噬苗体s k l p 2 妒O 和长头状噬茵体c 2 的寄主菌 用L 地bM G l 6 1 4 释放的噬菌体感染转化子M G l 6 1 4 p J K l 结果菌株M G l 6 1 4 p J K l 表现出对四种噬菌体具有一定的抗 生 其E O P 值相同 约为1 0 一 结果见表2 菌株L 蛔b I L l 4 0 3 与M G l 6 1 4 具有较高的相似形 并且都不 古有质粒 鼢叭d e rd 越 1 9 9 8 发现菌株1L 1 4 0 3 携带有染色体编码的帅el M 系统 表现弱噬菌体抗 性 E O P 为l o 一1 0 一2 将质粒p J K l 转化到Lk 血lL l 柏3 菌株中 得到转化子I I 1 4 0 3 p J K l 对9 3 6 类型中的圆头状噬菌体b I L 6 6 b I L l 7 0 限制作用大幅度提高 E O P 为1 0 对c 2 类型中的长头状噬菌体 b I I 胛的作用由弱抗性提高到中抗性 E O P 由l O1 降低到25 1 0 说明基因 血B I 的导人 增强了菌 株l L l 柏3 对噬苗体的抗性 万方数据 2 4 8 微生物学 报4 2 卷 表2 含有质粒讨K l 的转化子对噬茁体的抗性 H Dn N d e 枷o T kE O P 锄a 忡r 8 萨0 fa l e 聃tt h 晰j d e 咖d 印td 咖删n a I l n T l s 2 2 且 M 系统L k B 与流产毫染A 肺s 机制的协同效应 质粒p w 6 0 l 携带有流产感染基因A s J o 神p h s e nJ 提供 将质粒p 瓜l 转化到含有流产感染质粒 p w 6 0 1 的菌株L 蛔缸M c l 6 1 4 p A w 6 0 1 中 测定所得转化于对噬菌体s k l c 2 的抗性 结果表3 所示 衰3R M 系统胁B I l l 与流产盛染基园舯i s 的协同作用 T kE O P a v 哪曰e0 fml e a s t 血 d 印c n 南n td e t e 珊确i o n s 两者的 怫同作用 表3 结果表明 质粒p J K l 的导 使菌株M c l 6 1 4 fp A w 1 对圆头状噬菌 体s k l 和长头状噬茵体抗性分别提高了 1 0 0 倍 也就是说 由于剐M 系统 c B I I I 中甲基化酶的识别错误 修饰了侵入噬 菌体D N A 的限制性内切酶的酶切位点 或噬菌体的突变 逃脱了体内胁B I I I 限 制性内切酶的切割作用 而欲生长繁殖 却被流产感染机制A 扰s 所阻断 表现出 2 3 含有R M 系统工肠咖的工业菌栋对噬蕾体的抗性 s M Q 8 6 和工z 耐bc H c c 2 2 8 l 是工业生产乳酪的常用菌株 s M Q 8 6 又是P 3 3 5 类型噬菌体的 表4 曹株s M Q 8 晦 c H c c 2 勰1 爰其转化子对噬曹体的抗性 N D 1 协d H o c t l o E O P 蛐a 他m g eo fmk 拙EL h 陆 l 刊印e n d e md e I e 姗n 0 n s 万方数据 2 期 孔健等 限制和修饰系统 止B I 在构建抗噬菌体菌株t p 的作用 2 4 9 寄主菌 工蛔西c H c c 2 2 8 l 是噬菌体c H P c 4 1 2 c H I c 8 3 l 和c H w 8 3 2 的寄t 菌 将厦札n J K l 分别转 化到菌株L 她缸s M 0 8 6 和 f 叩f c H c c 2 2 8 l 中 所得转化F 对噬菌体的抗性结果见袤4 由表4 可知 含有质粒p J K l 的菌株s M Q 8 6 p J K l 对P 3 3 5 类型中噬菌体的E o P 与M G l 6 1 4 p J K l 对 9 3 6 类型中噬菌体的E O P 相同 为1 0 而菌株c H c c 2 2 8 l p J K l 对腺始菌株c H c c 2 2 8 l 繁育的噬菌体 E O P 为一1 0 其抗性高于对P 3 3 5 和9 3 6 类型噬菌体的1 0 0 倍 表现出刚M 系统眦B I I l 能够赋予菌株 c H c c 2 2 8 l 极强的抗噬菌体性能 3 讨论 在乳制品发酵过程中 感染噬菌体的种类是多种多样的 根据D N A 同源件分为1 2 人类型 s p e r s 分布比较普遍的只有3 种类型 小圆头9 3 6 类噬菌体 长头状c 2 类噬菌体和圆头状P 3 3 5 类噬菌体 l 将携带有I k 啪基因的质粒p l 转化到不同的乳酸乳球菌中 所得菌株表现出对这3 种类型中的噬菌 体具有一定抗件 尤其对菌株 4 0 3 和c H c c 2 2 8 l 繁肯的噬菌体抗性较强 表明r 刚M 系统讹B I 在构 建抗噬菌体工业菌株中具有良好的应用潜力 由于乳制品生产的原料牛奶通常录用巴氏消毒 不能彻底杀死噬菌体 使得生产菌株总是受到嘴菌 体的威胁 在长期的噬苗体存在压力下 有些乳酸菌自身携带r 一蝗抗性基因 根据菌株与噬菌体作用 方式的不同 抗性机制分为四类 噬菌体吸附障碍 D N A 侵入抑制 限制修饰系统和流产感染机制 这些 抗性机制大部分由质粒基因编码 少数位于染色体上 Lk d 出s u b s p k 如M E 2 是从乳酪混合发群剂 中分离的一株具有较强噬菌体抗性的野生菌株 含有多个质粒 其中在质粒上携带一个吸附障碍 两个 R M 系统和两个流产感染 1 本文表2 和表3 结果表明 当R M 系统幽B I I I 基因与菌株I L l 4 0 3 的彤M 系 统基因和菌株M G l 6 1 4 p A w 6 0 1 的流产感染基因A 缸s 在细胞内同时存在时 对噬菌体的抗性表现出 协 同效应 这一结果与J o 挑p l l 螂 J 1 9 9 0 将三种编码不同的刚M 抗性机制的质粒共转化到乳酸乳球菌 M G l 3 1 6 时掏建的抗噬菌体苗株结沦一致 并证明了采用共转化法将 k B I I I 基因与其它抗性基因转 化到同一株乳酸菌中以构建抗噬菌体工业菌株是q r 行的 但是本方法的不足足有些质粒问往往存在着 复制的不兼容性而导致菌株遗传性状的不稳定 所以在采用质粒的共转化时应考虑质粒 日 的兼容性 将I I M 系统如B J 儿与氯霉素抗生基因连接构建质粒p J K l 只是为了筛选方便 如将 M 系统 m B 应用于工业生产菌株的构建 需要与食品级载体连接或自然存在质粒一w 5 6 6 的直接转化 这 面工作正在进行中 致谢本论文得到丹麦科学研究院的项目资助 并感谢丹麦皇家畜牧和农业大学食品科学和乳制品系 A n n d M a d s o n 和B 船h 打A i d e h 在实验操作中给予的指导 参考文献 1 R o b 叭sRJ 白 1 卯8 1 8 3 一1 9 3 2 M 啦h I l lRJ B 町r i d 萨NJ 删节如 1 9 7 6 躬 1 4 8 l 1 4 8 5 3 o 汕v 蛐DJ c o 呐A n 噼一dcr H 一 如一曲曲帆肼k 瞄 1 9 9 8 4 6 1 8 4 6 1 2 4 孔譬 顾笑梅 马桂荣微生物学报 2 0 l 4 l 5 5 4 2 5 4 7 5 孔健 J 咖p h 鸵nJ 马桂荣生物工程学报 2 0 0 l 1 7 6 6 8 7 3 6 H d oH N e s IF 印f M 1 9 8 9 5 5 3 1 1 9 3 1 2 3 7js c h d 山e rC C 删盯M E I l r l c hsD 一M M i 曲 1 9 9 8 蠲 1 0 9 一1 7 8 8 k Y uA w F l 啦m 上dGF M a i a M d 胁叭m H 出盯 1 呻 t 3 2 2 9 19 f h 小A H 8 旷r a l dcF 廊脚b n n n 棚 1 9 9 9 8 9 1 1 3 r l OJ c m w yP H I uc 孙苷f 8 l dcFA 耐E m 埘枷爿 1 9 9 6 t 6 2 6 7 6 6 7 9 万方数据 2 5 0 微 生 物学报 4 2 卷 1 1 1J J 0 6 e 雠n j K 础一f T P 如戚d 1 9 9 0 2 3 7L 一7 s 1 1 2 G a MJ m m 1 9 8 3 l 1 9 1 1 3J c h 叩i nA c h 叩i nMc M o i l l p B 叫 d fP k m d 1 9 8 4 2 6 0 一曲3 4 j C h 丑T I d qPS M 忙SC o a i d 鲫n BE n d 栅 1 9 9 4 1 朋 1 2 3 1 2 6 1 5M m T m 蚰s F 哪 e rJ c k e n 叫lH w 村4 耐踟 硼肼咖 f 9 9 3 s 9 1 9 7 2 0 2 1 n h eR e s i s t 卸c eC 伽睡r r e db ym eI t Ms y s t e m 砌B A 鲫n s tB a c t e r i o p h a g e s K 0 n gJ i a I l lJ l eJ o s 8 p h s e n 2 M aG u i R o g 1 眦研 咖叫矿M 矧T k h 如g y 舶 n 出嗜u r 日衅n 竹 且眦n2 5 0 1 0 0 c k 船 巩拊咖删矿m 竹 耐M 啪胛 m 铆缸 咖帆 扩枷啪 枷w 枷y 加 畦 A h t r a c t n B I i s o l a l e d mt h en a I u r a l l yo c c u 丌i gp l 曲I I l i d w 5 6 6f r o mL 砌o 叭蠡 s u b 5 p c 陀口m 廊w 5 6 e n c 0 i e dar e s t 五c 石o n 曲dm o d i n c a t i 帅 I U M 8 y s t e m T h 8p l 船I I I i dp J K lc a r r y i n gt h e M8 y s t e m 胁B I l lw 如t 砌s f o 同i n t oL Z 州bI L l 4 0 3w 岫t y p eIR M5 y s l e ml a t e d o nc h r o 1 0 8 0 啪锄d 忆s t 嘣nM G l 6 1 4 p A w 6 0 1 w i t hA 扰sg e eo p l a s dp A w 6 0 1 r e s p e c t i v e 1 y T h et 舢s f 0 咖a n t so b l a i n e ds h o w e ds 啪k i gr e s i s t a n c e8 9 a i n s l b a c t e d o p h a g e s 1 1 1 8p l a s 商dp J K l w a st 砌舶珊e di n oi n d u s I d a l8 t 商璐 1 d n 括s M Q 8 6a I l dC H C c 2 2 8 1 t I l et r a n s f b r