实时荧光定量PCR检测限的统计推断.doc

实时荧光定量PCR检测限的统计推断来源：中国论文下载中心-作者：王文清，王昌富，袁琳，彭长华，常武 【摘要】 检测限是检测方法的重要性能指标，用Poisson分布的概率函数分式计算一次抽样检测出现的结果推论总体出现该结果的概率。以实时荧光定量PCR(FQPCR)检测乙型肝炎病毒DNA结果为例，计算可知，一次抽样反应管的检测结果4时，才可推论总体与0(空白)差异有显著性(P0.05)。因而检测血清中病原体时扩增反应管中的检测限是4拷贝/ul计算也可知，1拷贝/ul表示一次抽样的结果为0的概率可达0.368，结果在0拷贝/ul4拷贝/ul的概率为0.996，而1000拷贝/ml表示一次抽样结果为0的概率为0。结果在905拷贝/ml1 095拷贝/ml的概率为0.997；而100 000拷贝/L表示一次抽样结果在997 000拷贝/L1 003 000拷贝/L的概率为0.997。抽样单位ul不能随意放大为ml甚至L。 【关键词】 实时荧光定量PCR；检测限；统计推断Statistical Conclusion of Limit of Quqntitation in Realtime Fluorescence Quantitative PCRAbstract:Limit of quantiation is a important performance index of assay methods.Results of sample drawing are calculated through possiblity function equation of Poisson distribution,then the possibility of results emerged in population is deduced.For example,in Realtime Fluorescence quantitaive PCR to assay HBV DNA,only when sample drawing results4,significance of difference(P0.581 92，总体为其他的概率之和0.5(此时报告0拷贝的可信限度低于50%)。总体为1时一次抽样结果分别为19时的概率见表1。当一次抽样结果4时，推论总体为1的概率0.015 33，所以对于病原体的检测，一次抽样反应管检测结果4拷贝时，才可推论总体与0(空白)差异有显著性(P0.05)。因而上述检测血清中病原体时一次抽样反应管的检测限是4拷贝/l。当总体为1、2、3时一次抽样结果为0的概率分别是0.367 88、0.135 34、0.049 79。如室间质量评价样本靶值选择1拷贝/l、2拷贝/l、3拷贝/l时，无论实验室实际检测质量如何高，都将有36.79%、13.53%、4.98%的实验室检测结果为0而被判为不符合按靶值的对数值GM0.5 log(10)9作为可接受的定量范围。2005年卫生部室间质量评价中靶值为1.51拷贝数/l的样本符合率仅35.2%；Mancini C 等9报道一些实验室对检测下限附近的样本(3.00 log IU/ml)准确定量有困难；Raggi CC等10也报道28.6%的实验室(12/42)对最低浓度的样本不能定量。这些都是因为检测下限附近的样本一次抽样结果为0的概率太大所致，对此我们将另文详细讨论。造成上述文献中检测限差异较大的可能原因如下：用于10倍系列稀释的已知高拷贝HBV DNA血清本身拷贝数的差异；对检测限的理解差异，由一次抽样没能检测到典型扩增的稀释血清管推论总体浓度为0的可信度太低(50时近似正态分布，范围是Xu*X，可信限为99.7%时u=3);总体为100 000拷贝/L时表示一次抽样结果在997 000拷贝/L1 003 000拷贝/L的概率为0.997。文中推理以HBVDNA的FQPCR检测为例，其他病源体核酸的FQPCR检测也与其相同，检测限是抽样反应管的检测限4拷贝/反应管；如反应管中加入模板量相当于12.5 l血清则检测限相当于0.32拷贝/ l。此推断仅是针对FQPCR技术本身的检测限度，未就临床上有意义的最小病源体核酸的拷贝数进行讨论。【参考文献】 1 冯仁丰.分析灵敏度(检测限)J.上海医学检验杂志，2002，17(3)：133134.2 郭晏海，张菊，赵锦荣，等.聚合酶链反应荧光偏振技术在乙型肝炎病毒DNA检测中的应用及价值J.中华检验医学杂志，2004，27(1)：2627.3 张东华，金根娣，陆志檬.二种分子杂交技术定量检测临床标本中HBV DNA的比较J.上海医学检验杂志，2003，18(3)：163164.4 何敏，杨朝霞，刘微，等.HBV DNA定量检测方法的评价J.国外医学临床生物化学与检验学分册，2005，26(2)：123124.5 刘停，韩亚萍，张永祥.荧光定量PCR检测慢性乙型肝炎患者血清HBVDNA及其意义N.南京医科大学学报，2003，23(1)：7879.6 黄希田，颜鸣鹤，凌乔，等.定量PCR微流芯片法定量检测血清HBV DNA含量.中国感染控制杂志，2003，2(2)：8991.7 王豪，陶其敏，吴娟，等.两种乙型肝炎病毒DNA定量检测方法的比较与评价J.中华检验医学杂志，2002，25(5)：318320.8 李金明，邓巍，王露楠，等.PCR测定乙型肝炎病毒DNA弱阳性质控血清的适用性研究J.临床检验杂志，2000，18(1)：67.9 Mancini C,Pisani G,Azzi A,et al.Interlabortory comparison of qualitative detection of hepatitis C(HCV)virus RNA in diagnostic virology:a multicente study (MS)in ItalyJ.J Clin Virol，2004，30(4):313319.10 Raggi CC,Verderio P,Pazzagli M,et al.An Itali