荧光免疫标本.doc

(3333) 免疫荧光免疫荧光免疫荧光免疫荧光 1.标本准备标本准备标本准备标本准备 解剖出的脑组织经4%多聚甲醛固定过夜，依次用15%、30%蔗糖脱水， 各10-24小时。将标本沿中线切开，去除多余部分，保留皮层，然后用OCT包埋剂包埋，液氮中速冻1分钟，用病冻切片机制做皮层的矢状面切片，切片厚度为10m，切片于40C烤箱中烤24-48小时，然后进行下一步的染色过程。 2.免疫荧光染色免疫荧光染色免疫荧光染色免疫荧光染色 (1) 切片：组织冰冻切片准备如上一步。如果是细胞标本则预先将细胞种植在多聚赖氨酸及纤粘连蛋白包被的玻璃片上，染色前4多聚甲醛固定20min，0.1 M PBS 洗涤3 次。 (2) 通透：0.5Triton X-100 室温通透20 分钟，0.1 M PBS 洗涤3 次(对于核染色的抗体如Sox2可适当延长通透时间，而对于膜染色的则不通透)，EGFR染色以5-10分钟为佳。 (3) 封闭：正常羊血清工作液或10%BSA室温封闭1 小时。 (4) 一抗：用抗体稀释液稀释一级抗体后，4 过夜。0.1 M PBS 洗涤3 次。 (5) 二抗：选择相应的二抗，用3牛血清白蛋白稀释，室温孵育1 小时。0.1 M PBS 洗涤3 次。 (6) 封片：滴加荧光防淬灭封片剂封片。 (7) 观察照相：在荧光显微镜或者激光共聚焦显微镜下观察照相。 免疫荧光技术原理及标本的制备、固定与保存优尔生门户网站 2009-9-13 7:10:35 作者：优尔生免疫荧光技术原理及标本的制备、固定与保存 一、 原理 亦称荧光抗体技术，应用化学方法将荧光色素(主要是异硫氰酸荧光黄，fluorescein isoth iocyanate,FITC)与抗体结合起来，即荧光抗体，这种结合荧光色素的抗体的免疫原性并不因此而发生改变，在特定条件下用其着染标本，如果标本中存在有相应的抗原，荧光抗体便与标本中的抗原发生特异性结合，在荧光显微镜的蓝紫光或紫外光照射下，标本中的抗原抗体复合物便发出特异的荧光，荧光的出现表明被检标本中特异抗原的存在；如果标本中不存在相应抗原，两者便不能结合，水洗时，荧光抗体便被洗掉，因而标本在荧光显微镜下观察不呈现特异荧光。因此，可以根据荧光的有无及强弱来判定抗原与抗体是否存在或相对应。 二、 标本的制备、固定与保存 (一) 标本制备标本的制备应力求保持抗原的完整性，并在染色、洗涤及固定过程中不发生溶解或变性，也不会扩散到邻近细胞或组织间隙中去。此外，为了便于抗原和抗体接触，形成抗原抗体复合物，以及有利于观察和记录，要求制备的标本尽量薄，对标本中干扰抗原抗体反应的物质应充分洗涤除去，以免影响标本的观察及结果的判定。1 病料等标本在一般诊断工作中最常用，适用于检查细菌培养物、血液、脓汁、粪便、尿沉渣、穿刺液以及感染动物的脏器和病变组织等，均可以做成涂片或压印片标本。(1) 涂片方法：先将玻片通过火焰3次，冷却后，以白金耳挑选被检材料均匀涂布成约1cm的圆形涂片。如材料太浓，则应预先加适量灭菌生理盐水于另一玻片上，用白金耳取材料与其混合稀释，待均匀后涂片，也可将生理盐水加入被检材料中，混合均匀后涂片。涂好后，晾干或以电风扇吹干备用。(2) 压印片方法：用无菌剪子将待检组织剪开，用无菌的清洁干净棉球或滤纸将切面的血液吸干，然后以玻片轻压切面，使之沾上12层细胞，然后再在玻片另一处以切面涂拭，得一较厚抹片，面积按需要而定，标本晾干或吹干。对于容易脱落的材料，如炭疽杆菌等的液体培养物或钩端螺旋体等，在压片之前，载玻片上应加入适量的粘稠物(如2%5%蛋清等)，以防压印的标本脱落。2 组织培养标本利用免疫荧光技术研究病毒时，多用组织培养的细胞。较好的方法是在方瓶或雷顿瓶内放半片盖玻片，培养的细胞在其上生长成单层以供使用。培养的细胞一般比组织中的细胞大而薄，适用于观察细胞内特异性抗原的详细分布情况，因为能分辨出在核内或在细胞质内的抗原。特别是研究病毒在细胞内的繁殖情况时，用这种方法制备的标本比其它方法好。 (二) 标本的固定被检标本的固定是免疫荧光技术中的重要环节，往往对荧光染色效果表现明显的影响。如所用固定条件不同，荧光抗体染色的抗原在细胞内的分布和形态就会发生变化。所以，当解释染色效果时，要注意固定条件的影响。除了研究细胞表面抗原可不固定外，一般均应先固定，然后进行荧光抗体染色。固定的目的及原则(1) 固定的目的：防止被检材料从玻片上脱落；清除阻止抗原抗体结合的类脂，使抗原抗体结合物易于获得良好的染色结果；固定的标本易于保存，如组织切片标本固定后，在-20下可保存一年，而不改变其染色性。(2) 固定的原则：不损伤细胞内的抗原；不损伤细胞的形态；固定后应保持细胞膜的通透性，以便抗体和抗原结合。由于实验目的不同，须选用不同的固定剂，如研究免疫球蛋白时，用四氯化碳比用丙酮固定好，因除组织内结合的球蛋白外，其它游离的球蛋白全被消除。固定后，须立即以pH值74 PBS浸泡冲洗，程序是经过三缸浸泡，每缸3min，末次再通过一缸pH值74的蒸馏水脱盐，否则因脂类存留，而增强自发荧光和非特异性荧光的出现。 (三) 标本的保存固定和干燥好的标本，应尽快进行染色镜检，如必须保存时，应在4以下干燥保存。若保存时间长了，抗原的活性会丧失，不能被荧光抗体染色，且组织的自发荧光很强，不能使用，在室温中这种变化更快。在低温中究竟能放置多长时间，因抗原的种类、标本和固定方法等不同而异。在4以下干燥环境中或在-20下保存，大致可保存1周至1个月左右。石蜡或碳蜡包埋的切片比冰冻切片保存时间长。标本保存一段时间后，其pH值会发生改变(偏酸)，产生阳离子，而抗体球蛋白是阴离子，结果细胞组织和抗体结合产生假阳性。为了避免这一现象，保存的标本在染色前应用pH值7680的001002M的PBS处理，改正标本的pH值，而后进行染色。上一篇 固相溶血试验(以鼻疽为例)下一篇 免疫荧光技术染色方法免疫荧光技术染色方法优尔生门户网站 2009-9-13 7:11:35 作者：优尔生免疫荧光技术染色方法 (一) 直接染色法这是荧光抗体技术中最简单、最基本的一种染色法。当某种荧光抗体直接与相应的被检抗原相遇时，则发生特异性反应，而使被检抗原与荧光抗体相结合，形成的特异性结合物在荧光显微镜照射下便发生荧光。直接染色法的优点是：特异性高、操作简便、比较快速；缺点是：一种标记抗体只能检查一种抗原。另外，该法的敏感性也较差。1染色步聚取适量经适当稀释的荧光抗体滴加于抗原上(即已经涂片及固定的载玻片上)，使其布满整个标本区。将玻片置于带盖的搪瓷盘内(底部垫以滤纸，纸上放玻片架，加适量水使滤纸浸湿，玻片数量少时可用平皿，内置23个浸湿的棉球)密盖，放37温箱染色30 min左右(温度和时间根据标本情况而定)，然后将玻片取出，以PBS冲去未结合的标记抗体液，然后置大量PBS中漂洗15min，或直接在中性或偏碱性的自来水下冲洗5min，然后浸泡于PBS中1min,干燥、封片、镜检。2结果记录荧光显微镜所观察到的荧光图象，主要以两个指标判断结果。一是形态学特征；二是荧光的亮度。在结果判定中，应将二者结合起来综合判断。荧光强度用以下符号表示：+：荧光闪亮，呈耀眼的亮绿色；+：荧光明亮，呈明显的绿色；+ ：荧光明显，呈黄绿色；+ ：荧光较弱，但清楚可见； ：极弱的可疑荧光；- ：无荧光。 (二) 间接染色法本法系利用抗球蛋白试验的原理，以荧光色素标记抗球蛋白抗体，鉴定未知抗原或抗体。染色程序分为两步：第一步，用已知抗体加到未知抗原上，作用一定时间后，水洗。第二步，加上荧光素标记的抗球蛋白抗体，如果第一步中的抗原抗体相对应，互相发生了反应，则抗体被固定，并与荧光素标记的抗球蛋白抗体结合，发出荧光。间接染色法的优点是：既能检查未知抗原，也能检查未知抗体；用一种标记的抗球蛋白抗体，能与在种属上相同的所有动物的抗体结合，检查各种未知抗原或抗体；另外，本法的敏感性较高，通常比直接染色法高510倍。缺点是：由于参加反应的因素较多，受干扰的可能性也较大，故结果判定有时较难；另外操作方法比较繁琐，需要做的对照较多，时间也较长。1染色步骤按以下染色步骤实施：标本(涂片或切片)经固定后,用吸管吸取经适当稀释的免疫血清加于标本上(如测定待检血清中的抗体时,则将适当稀释的待检血清加到已知抗原上),置染色湿盒中于37作用30min；取出玻片，用PBS轻轻冲洗，然后顺次浸泡于三缸PBS中，每缸3min，时时振荡；倒去PBS,用吸水纸吸干余留的液体；滴加相应的抗球蛋白荧光抗体,同上步骤,于37染色30min；如上以PBS浸泡3次,最后用蒸馏水洗一次以脱盐,缓冲甘油封片后置荧光显微镜检查。2结果记录同直接法。 (三) 注意事项1应设立对照试验，以排除非特异性荧光。2用荧光显微镜检查标本时，每次检查时间以1h为宜，超过15h，高压汞灯的亮度逐渐下降，荧光减弱。此外，标本受紫外线照射15min后，荧光明显减弱