孕妇外周血胎儿有核红细胞在产前诊断中的作用.doc

目前对遗传性疾病的产前诊断有数种方法。根据采样途径或诊断方法是否构成对胎儿的影响可分为侵入性产前诊断和非侵入性产前诊断。前者包括羊膜腔穿刺术、绒毛细胞吸取术及胎儿脐血穿刺等，虽然诊断精确度较高，但可导致流产等并发症，只能在高危孕妇中实施;后者的优点是既能行产前诊断又无危险性，适用于低风险的孕妇大群体筛选，尽早发现和杜绝异常胎儿，达到优生目的。许多学者致力于利用胎儿细胞进行产前诊断。利用孕妇外周血的胎儿细胞进行产前基因诊断三个关键性技术为:（1）证实母血中存在胎儿细胞和DNA。（2）建立可靠稳定的方法分离胎儿细胞和DNA。（3）应用灵敏性、特异性强的技术以微量胎儿细胞和DNA为模板诊断遗传性疾病。这是最具潜力的非侵入性产前诊断方法之一。1 孕妇外周血中胎儿细胞正常胎盘并非是完善的、细胞透不过的屏障。在人类正常妊娠当中，进入母体血液循环中的胎儿血量估计是0.10.3ml。孕妇血中胎儿细胞的主要类型包括滋养叶细胞、淋巴细胞、粒细胞、单核细胞、有核红细胞（NRBC）等 1 。其中最合适做产前诊断的胎儿细胞类型当首推胎儿有核红细胞，理由是:（1）胎儿有核红细胞是单核的，孕早期胎儿血中含量丰富但孕妇外周血中罕见;（2）其表达几种特异的抗原如运铁蛋白受体和特异的胎儿血红蛋白肽链如链、链和链，作为细胞标记而利于细胞的分类、鉴定和聚集;（3）其在孕妇外周血中的生存期短，不会持续到下一次妊娠 2 。 胎儿有核红细胞在早孕时就在母体血中出现，随着妊娠的进展而有所变化。在不同阶段，在母体血中所能检出胎儿有核红细胞的量亦不同。陈汉平等运用流式细胞术对61例孕1134周，2135岁的孕妇外周血中的胎儿细胞进行分析，结果显示在早、中、晚期妊娠时母血中都存在NRBC，孕早期NRBC含量随妊娠的进展呈上升趋势，17、18周左右达高峰，此后成下降趋势。并提出孕17、18周左右为产前诊断的最佳时间 3 。在分娩后2个月即不能检出，其中大部分在产后2h就不能测出，这表明检测过程较少受到上次妊娠遗留的胎儿DNA的假阳性的影响 4 。Ri等应用PCR法扩增了17例孕妇外周血中的单拷贝Y染色体DNA序列，在所有怀有男性胎儿的7例孕妇中，均检测出Y染色体特异性DNA序列。并证实最早的检出时间为37天，而且在第7周检测出80%，在第9周检测出100%。也对其他31例孕妇在她们进行侵入性产前诊断之前行外周血Y染色体SRY基因检测，13例怀有男性胎儿的孕妇外周血中均检测出Y染色体SRY基因，而在18例怀有女性胎儿的孕妇外周血中均未检出 5 。2 孕妇外周血中胎儿有核红细胞的富集及遗传物质的提取孕妇血有核红细胞（NRBC）含量极少，大约每1ml母血中只含520个胎儿细胞，NRBC更少，为每1ml含26个 1 胎儿细胞，必须进行分离纯化才能利于进一步分析，做产前诊断。目前，分离胎儿细胞有多种手段，主要包括密度梯度离心、磁激活细胞分类（MACS）、荧光激活细胞分类（FACS）、选择性细胞培养技术、尼龙毛柱分离法、单独溶解红细胞法等。其中密度梯度离心法是根据母血细胞与胎儿细胞的体积和内部结构等存在较大差异而推测出它们的密度也可能存在较大差异而设计的 6 。张振洪等10例孕妇外周血采用密度梯度离心法富集胎儿细胞，在性别为男性的6例中，SRY基因绝大部分是在中层细胞中扩增出来的，这提示母血中胎儿细胞大部分集中在密度梯度离心后的中层细胞里。密度梯度离心法分离出来的细胞丢失少、形态完整，但是富集的胎儿细胞纯度与产量均不够。还应改进技术如采用多重密度梯度离心以提高纯度 7 。荧光激活细胞分类（FACS）法也是较常用的，分选CD71 + 细胞，富集的胎儿细胞纯度与产量均较高，但操作步骤复杂可能导致细胞丢失;CD71并非专一与NRBC结合，CD71 + 细胞不一定是NRBC;而且所选NRBC形态略有改变，细胞膜欠完整，也会给产前诊断技术带来困难 8 。磁激活细胞分类（MACS）也是可行的。该技术的特点是在较短时间里获得较多的靶细胞，且分离后的细胞仍有活性，可供培养和流式细胞分析等。Holzgreve等利用MACS对100例孕20周左右的孕妇的外周血进行富集分离，而后进行染色体分析，检测出10例非整倍体的胎儿，而后进行羊水穿刺染色体分析，符合率为100% 9 。胎儿细胞分离后应提取胎儿遗传物质，在此基础上进行遗传病的基因诊断。Lo等首次应用煮沸法提取DNA，用PCR扩增胎儿特异性Y序列，通过电泳检测 10 。Houfflin等比较了单纯煮沸法和加用酚/氯仿的方法提取胎儿DNA，发现后者可以提高提取胎儿DNA的浓度，敏感性由50%提高到80% 11 。陈小蔓等后来应用酚提取法纯化孕妇血浆及血清胎儿游离DNA，证实了Houfflin等的结论 12 。Sekizawa等首次用PEP（primer extension preamplification）方法扩增单个NRBC的全基因组DNA并用HLA-DQ序列特异性地确定为胎源性 13 。Larsen RD等以肽核酸（PNA）探针进行荧光原位杂交（FISH）检测胎儿有核红细胞中的珠蛋白mRNA。并用Y染色体特异性PNA-FISH证实被检测的珠蛋白mRNA是来源于胎儿NRBC 14 。3 孕妇外周血中胎儿有核红细胞在产前诊断中的应用利用胎儿的NRBC的DNA或对其成分进行检测可用于一些遗传性代谢性疾病、染色体异常、基因突变等疾病中。由于富集到的胎儿细胞的量还是很少，要对提取到的DNA进行扩增，而后对相应的基因进行检测分析。目前基因检测分析方法主要是以特异性染色体DNA探针进行荧光原位杂交（FISH）和PCR技术。3.1 分子遗传学诊断3.1.1 遗传性疾病 性连锁遗传病种类繁多，若可以作出产前性别诊断，给家系提供优生指导，减少此类患儿的出生，为性连锁遗传病的产前诊断提供可能。现在用于产前诊断胎儿性别的基因是Y染色体上的睾丸决定基因（TDF），它的候选基因有3种:组织相容Y（H-Y）抗原的基因、锌指Y（ZFY）基因、性别决定Y（SRY）基因。目前认为，SRY基因是TDF的最佳候选基因 4 。张振洪用套式PCR扩增出SRY基因，对胎儿性别进行判定 7 。3.1.2 染色体异常的疾病 最具代表性的是唐氏综合征（又称21-三体综合征），是一种常见的染色体病患者，以先天性严重智力低下为主要症状。胎儿的染色体核型可以影响母体循环中胎儿DNA的数量，Parano等发现21-三体的胎儿细胞DNA较正常胎儿高6倍 15 。Zhong等研究怀有非整倍体胎儿的孕妇和怀有正常胎儿的孕妇血中胎儿DNA的数量差异，前者明显高于后者，差异有显著性（P=0.03）。而且 在怀有21-三体胎儿的孕妇外周血中DNA数量最高 16 。这项研究证实了使用孕妇血中胎儿DNA筛查胎儿非整倍染色体的可能性。Tuangsit等对5例怀有13-三体男性胎儿和5例怀有18-三体男性胎儿的孕妇进行研究，两组分别采用5例怀有整倍体男性胎儿的孕妇作为对照，采集孕妇外周血中的胎儿DNA，结果显示13-三体组的胎儿DNA平均为97.5GE/ml（29.2187.0）（P=0.016），18-三体组的胎儿DNA平均为31.5GE/ml（18067706）（P=0.244），而对照组为40.3GE/ml（3.7127.4） 1，7 。3.1.3 -地中海贫血 Saracoglu等研究怀有-地中海贫血/血红蛋白Lepore胎儿可能的3名高风险孕妇，男方均携带有HbLepore突变基因。PCR的结果2名孕妇外周血样有Lepore基因的阳性讯号，另1名孕妇无阳性讯号，均经绒毛取样（CVS）分析证实 18 。3.1.4 RHD血型不合溶血 RHD血型不合可导致胎儿和新生儿溶血造成严重贫血、心力衰竭、核黄疸甚至死亡，产前确定胎儿的RHD血型，对RHD阴性的孕妇有重要的临床意义。因此，RHD基因作为除了Y染色体之外的另一个基因位点，成为目前的研究焦点。Lo等用RHD基因的不同区段作靶序列成功地在57例RHD阴性的孕妇血浆中确定了胎儿RHD血型。其中12例在孕早期确定，成功率为83.33%（10/12），30例在孕中期、15例在孕晚期确定，成功率为100% 19 。Zhong等利用多重套式PCR技术同时在孕妇血浆中确定胎儿的两个基因位点RHD和SRY，二者的准确率均为100% 20 。3.2 妊娠相关性疾病 最近研究发现不同的妊娠并发症均有相关的胎儿DNA的增加。先兆子痫是一种常见的妊娠相关性疾病，其主要病理学因素可能是胎盘床小动脉出现硬化，滋养层细胞间纤维素沉积，并使基底膜突入绒毛。Lo等比较了孕周在3233周的20例先兆子痫和20例正常对照的孕妇，证实先兆子痫孕妇血中胎儿DNA浓度为正常组的5倍 21 。Lau等研究发现先兆子痫孕妇外周血中的胎儿DNA的清除率也明显下降。他们研究7例先兆子痫的孕妇和10例正常孕妇作为对照组，发现先兆子痫组的平均胎儿DNA在产前比对照组明显增高，（512GE/ml VS227GE/ml，P=0.017），在产后6h也有统计学意义（208GE/ml VS0GE/ml，P=0.002） 22 。胎儿有核红细胞还可利用计数对胎儿的生长发育进行诊断。Saracoglu等通过对77例孕妇包括11例急性胎儿窘迫、21例慢性胎儿窘迫和45例对照组试验，分娩时收集脐带血进行胎儿NRBC计数，结果显示慢性胎儿窘迫出生的新生儿的外周血中NRBC比急性胎儿窘迫的高许多。胎儿NRBC计数与脐带血pH值相关（r=-0.57;P0.001）。实验表明胎儿窘迫的严重性和病程可通过NRBC来预测 23 。慢性胎儿窘迫的常见原因多为孕妇全身疾病和妊娠疾病所致胎盘的缺陷。这也提示通过孕妇外周血的胎儿NRBC计数来诊断胎儿窘迫的可能性，还有待于研究。胎儿生长受限的原因复杂，主要为遗传因素、营养、妊娠病理、妊娠合并症、感染等，病理学因素可能为胎盘结构和功能的改变。朱剑文等研究了孕妇外周血及胎盘组织中胎儿有核红细胞出现频率与胎儿生长受限的关系，在9名胎儿生长受限妊娠妇女外周血中均检出NRBC，检出量从1240个/7ml不等，平均为22.6个/7ml;而正常妊娠妇女为010个/7ml，平均为5.4个/7ml（P0.001） 24 。综上所述，利用孕妇外周血胎儿细胞进行产前诊断的基础研究已取得很大进展，临床应用研究也取得了初步成功。在高风险孕妇，对染色体异常及单基因疾病胎儿已作了成功的产前诊断。这些技术的成熟将改变侵入性产前诊断的方式，而对低风险的孕妇群体，无论其年龄大小均能乐于接受检查，在此基础上结合侵入性的产前诊断使检测质量大大提高，并可降低或避免侵入性产前诊断带来的流产等并发症。对于线粒体遗传病的非侵入性的产前诊断还未见报道。由于线粒体DNA（mtDNA）是位于细胞质中，所以mtDNA的遗传方式为母系遗传，通过对线粒体DNA的序列分析可以确定是哪一种类型的基因突变。编码线粒体蛋白的核基因突变常常表现为常染色体隐性、常染色体显性和X染色体连锁性状，其相关基因可以通过定位基因克隆或候选基因克隆方法来确定和研究。胎儿幼稚红细胞中存在线粒体，这提示利用胎儿幼稚红细胞来诊断线粒体遗传病的可能，这还有待于进一步研究。【参考文献】1 陈春林, 张随学. 在体女性盆腔动脉血管网数字化三维模型构建方法及意义J. 中国实用妇科与产科杂志. /yxyy/main/index.php.2011(04) 2 徐玉静,欧阳振波,刘萍,陈春林. 磁共振成像在子宫肌瘤动脉栓塞术中的应用价值J. 中国实用妇科与产科杂志. 2011(04) 3 方驰华,苏仲和. 数字医学技术在胰腺肿瘤诊断和可切除性评估中的研究J. 实用医学杂志. /xyfm/class/. 2010(10) 4 欧阳振波,刘萍,余艳红. 女性骨盆研究进展及意义J. 中国实用妇科与产科杂志. /chuanmei/class/.2010(02) 5 刘萍,余艳红,陈春林,欧阳振波,宋小磊,王宏琢,昌仁民,王建平. 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