仪器分析复习指导.doc

2009年仪器分析课件文字版第一讲 色谱法的理论与实践1 色谱分析概论1.1 色谱分析简史 色谱法早在1903年由俄国植物学家分离植物色素时采用。后来不仅用于分离有色物质，还用于分离无色物质，并出现了种类繁多的各种色谱法。许多气体、液体和固体样品都能找到合适的色谱法进行分离和分析。目前色谱法已广泛应用于许多领域，成为十分重要的分离分析手段。但不管属于哪一类色谱法，其共同的基本特点是具备两个相：不动的一相，称一为固定相；另一相是携带样品流过固定相的流动体，称为流动相。当流动相中样品混合物经过固定相时，就会与固定相发生作用，由于各组分在性质和结构上的差异，与固定相相互作用的类型、强弱也有差异，因此在同一推动力的作用下，不同组分在固定相滞留时间长短不同，从而按先后不同的次序从固定相中流出。1.3 色谱法的特点优点 分离效率高 应用范围广分析速度快 样品用量少灵敏度高 分析和测定一次完成易于自动化不足 对分析对象的鉴别能力差。可以通过与质谱、红外等一起联用解决。1.4.1 按两相状态分类 气体为流动相的色谱称为气相色谱（GC） 根据固定相是固体吸附剂还是固定液（附着在惰性载体上的一薄层有机化合物液体），又可分为气固色谱（GS C）和气液色谱（GLC） 液体为流动相的色谱称液相色谱（LC） 液相色谱亦可分为液固色谱（LSC）和液液色谱（LLC）超临界流体为流动相的色谱称为超临界流体色谱（SFC）。随着色谱工作的发展，通过化学反应将固定液键合到载体表面，这种化学键合固定相的色谱又称化学键合相色谱（CBPC）。 1.4.2 按分离机理分类 利用组分在吸附剂（固定相）上的吸附能力强弱不同而得以分离的方法，称为吸附色谱法。利用组分在固定液（固定相）中溶解度不同而达到分离的方法称为分配色谱法。利用组分在离子交换剂（固定相）上的亲和力大小不同而达到分离的方法，称为离子交换色谱法。利用大小不同的分子在多孔固定相中的选择渗透而达到分离的方法，称为凝胶色谱法或空间排阻色谱法。最近，又有一种新分离技术，利用不同组分与固定相（固定化分子）的高专属性亲和力进行分离的技术称为亲和色谱法，常用于蛋白质的分离 1.4.3 按固定相的外形分类 固定相装于柱内的色谱法，称为柱色谱。固定相呈平板状的色谱法，称为平板色谱，它又可分为薄层色谱和纸色谱。1.4.4 按使用领域不同对色谱仪的分类 分析用色谱仪 制备色谱仪 流程色谱仪 根据以上所述，将色谱法的分类总结于图1.l中。对色谱方法两相更进一步的认识：流动相： 色谱工作时，流过色谱柱的物质。它既可以是气体，也可以是液体，还可以是超临界体。既可以是单质或单一化合物，也可以是一定比例的混合物。固定相： 色谱工作时，固定相在色谱柱中固定不动。通常其核心是一类惰性物质，如硅胶、硅藻土等。对于气固、液固色谱法来说，固定相既是惰性物质；对于气液、液液色谱法固定相=惰性物质（载体）+固定液（粘稠的液体或固体有机物）。在载体和固定液之间有物理的涂裹，现多为化学键合。固定液是固定相的一部分，在毛细管色谱柱中只有固定液而没有载体。1.7 色谱流出曲线及主要术c6d8e86f8366f04845891b3b1a35a711.pdf 第 3 页 共 18 页 2009年仪器分析课件1.7.1 流出曲线和色谱峰 如果进样量很小，浓度很低，色谱峰如果对称，可用Gauss正态分布函数表示： 式中：C不同时间t时某物质的浓度，C0进样 浓度，tr保留时间，标准偏差。1.7.2 基线 是柱中仅有流动相通过时，检测器响应讯号的记录值，即图中Ot线稳定的基线通过电子线路的衰减表面上看似“一条水平直线” 1.7.3 峰高 色谱峰顶点与基线之间的垂直距离，以h表示，如图中BA 1.7.4.1 死时间tM 不被固定相吸附或溶解的物质进入色谱柱时，从进样到出现峰极大值所需的时间称为死时间，如图 OA。因为这种物质不被固定相吸附或溶解，故其流动速度将与流动相的流动速度相近测定流动相平均线速时，可用柱长L与tM的比值计算。1.7.4.2 保留时间tR 试样从进样开始到柱后出现峰极大点时所经历的时间，称为保留时间，如图 OB它相应于样品到达色谱柱末端的检测器所需的时间 1.7.4.3 调整保留时间tR 某组份的保留时间扣除死时间后称为该组份的调整保留时间，即 tR = tR - tM 由于组份在色谱柱中的保留时间tR包含了组份随流动相通过柱子所需的时间和组份在固定相中滞留所需的时间，所以tR实际上是组份在固定相中停留的总时间保留时间通常用时间单位（如min）表示；很少用距离单位（如cm）表示。 保留时间是色谱法定性的基本依据，但同一组份的保留时间常受到流动相流速的影响，因此色谱工作者有时用保留体积、相对保留指数等参数进行定性检测。1.7.4.4 死体积 VM 指色谱柱在填充后，柱管内固定相颗粒间所剩留的空间、色谱仪中管路和连接头间的空间以及检测器的空间的总和。当后两项很小而可忽略不计时，死体积可由死时间与流动相体积流速F0（Lmin）计算： VM = tMF0 1.7.4.5 保留体积 VR 指从进样开始到被测组份在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相体积。保留体积与保留时间tR。的关系如下： VR = tRF0 调整保留体积VR 某组份的保留体积扣除死体积后，称该组份的调整保留体积，即 VR = VR- VM1.7.4.6 相对保留值2.1 某组份2的调整保留值与组份1的调整保留值之比，称为相对保留值： 由于相对保留值只与柱温及固定相的性质有关，而与柱径、柱长、填充情况及流动相流速无关，因此，它是色谱法中，特别是气相色谱法中，广泛使用的定性数据 必须注意，相对保留值绝对不是两个组份保留时间或保留体积之比 .1.7.5 选择因子 在定性分析中，通常固定一个色谱峰作为标准（s），然后再求其它峰（i）对这个峰的相对保留值此时，ri/s可能大于1，也可能小于1在多元混合物分析中，通常选择一对最难分离的物质对，将它们的相对保留值作为重要参数在这种特殊情况下，可用符号表示： 式中tR2为后出峰的调整保留时间，所以这时总是大于1的 。1.7.6 区域宽度 色谱峰的区域宽度是组分在色谱柱中谱带扩张的函数，它反映了色谱操作条件的动力学因素。度量色谱峰区域宽度通常有三种方法： 1.7.6.1 标准偏差 即0.607倍峰高处色谱峰宽的一半，如图中EF距离的一半。1.7.6.2 半峰宽W1/2 即峰高一半处对应的峰宽，如图中GH间的距离它与标准偏差的关系是： W1/2 = 2.3541.7.6.3 基线宽度W 色谱峰两侧拐点上的切线在基线上的截距，如图中IJ的距离它与标准偏差的关系是： W = 4 从色谱流出曲线上，可以得到的重要信息： 根据色谱峰的个数，可以判断样品中所合组 份的最少个数根据色谱峰的保留值(或位置），可以进行定性分析根据色谱峰下的面积或峰高，可以进行定量分析色谱峰的保留值及其区域宽度，是评价色谱柱分离效能的依据色谱峰两峰间的距离，是评价固定相(和流动相)选择是否合适的依据1.8 色谱分析的基本原理 色谱分析的目的是将样品中各组分彼此分离，组分要达到完全分离，两峰间的距离必须足够远，两峰间的距离是由组分在两相间的分配系数决定的，即与色谱过程的热力学性质有关。但是两峰间虽有一定距离，如果每个峰都很宽，以致彼此重叠，还是不能分开。这些峰的宽或窄是由组分在色谱柱中传质和扩散行为决定的，即与色谱过程的动力学性质有关。因此，要从热力学和动力学两方面来研究色谱行为。 1.8.1 两个组分完全分离的条件l 两组分的分配系数必须有差异l 区域扩宽的速率应小于区域分离的速度l 在保证快速分离的前提下，提供足够长的色谱柱。1.8.2 分配系数K和分配比k分配系数K 如前所述，分配色谱的分离是基于样品组分在固定相和流动相之间反复多次地分配过程，而吸附色谱的分离是基于反复多次地吸附一脱附过程。这种分离过程经常用样品分子在两相间的分配来描述，而描述这种分配的参数称为分配系数。它是指在一定温度和压力下，组分在固定相和流动相之间分配达平衡时的浓度之比值，即 1.8.3 分配比k 分配比又称容量因子，它是指在一定温度和压力下，组分在两相间分配达平衡时，分配在固定相和流动相中的质量比。即 k值越大，说明组分在固定相中的量越多，相当于柱的容量大，因此又称分配容量或容量因子。它是衡量色谱柱对被分离组分保留能力的重要参数。k值也决定于组分及固定相热力学性质。它不仅随柱温、柱压变化而变化，而且还与流动相及固定相的体积有关。 式中CS，Cm分别为组分在固定相和流动相的浓度； Vm为柱中流动相的体积，近似等于死体积。Vs为柱中固定相的体积，在各种不同的类型的色谱中有不同的含义。例如：在分配色谱中，Vs表示固定液的体积；在尺寸排阻色谱中，则表示固定相的孔体积。1.8.4 滞留因子Rs 分配比k值可直接从色谱图测得。设流动相在柱内的线速度为u，组分在柱内线速度为us，由于固定相对组分有保留作用，所以usu此两速度之比称为滞留因子Rs。 1.8.5 分离度 相邻两组色谱峰保留值之差与两个色谱峰峰底宽度总和之半的比值。 1.9 塔板理论 最早由Martin等人提出塔板理论，把色谱柱比作一个精馏塔，沿用精馏塔中塔板的概念来描述组分在两相间的分配行为，同时引入理论塔板数作为衡量柱效率的指标。塔板理论为半经验理论。 式中：n 理论塔板数 L 色谱柱长 H 每块塔板的高度 塔板理论假定： （i）在柱内一小段长度H内，组分可以在两相间迅速达到平衡。这一小段柱长称为理论塔板高度H。 （ii）以气相色谱为例，载气进入色谱柱不是连续进行的，而是脉动式，每次进气为一个塔板体积（Vm）。 （iii）所有组分开始时存在于第0号塔板上，而且试样沿轴（纵）向扩散可忽略。 （iv）分配系数在所有塔板上是常数，与组分在某一塔板上的量无关。 为简单起见，设色谱柱由5块塔板（n5，n为柱子的塔板数）组成，并以r表示塔板编号，r=1，2，nl；某组分的分配比k=1. 根据上述假定，在色谱分离过程中，该组分的分布可计算如下：开始时，若有单位质量，即m=1（例1mg或1g）的该组分加到第0号塔板上，分配平衡后，由于k=1，即ns=nm故nm=ns=0.5。当一个板体积（lV）的载气以脉动形式进入0号板时，就将气相中含有nm部分组分的载气顶到1号板上，此时0号板液相（或固相）中ns部分组分及1号板气相中的nm部分组分，将各自在两相间重新分配。故0号板上所含组分总量为0.5，其中气液（或气固）两相各为0.25而1号板上所含总量同样为0.5气液（或气固）相亦各为0.25。以后每当一个新的板体积载气以脉动式进入色谱柱时，上述过程就重复一次(见下表)。由流出曲线方程可推出： 式中：n-理论塔板数；tr-保留时间；w-峰底宽而理论塔板高度（H）即： 从以上两式可以看出，色谱峰W越小，n就越大，而H就越小，柱效能越高。因此，n和H是描述柱效能的指标。 通常填充色谱柱的n103，H1mm。而毛细管柱 n=105-106，H0.5mm 由于死时间tm包括在tr中,而实际的tm不参与柱内分配,所计算的n值尽管很大,H很小,但与实际柱效能相差甚远。所以,提出把tm扣除,采用有效理论塔板数neff和有效塔板高Heff评价柱效能。 l 例题1 已知某组分峰的峰底宽40s，保留时间为400s，计算此色谱柱的理论塔板数。 塔板理论用热力学观点形象地描述了溶质在色谱柱中的分配平衡和分离过程，导出流出曲线的数学模型，并成功地解释了流出曲线的形状及浓度极大值的位置，还提出了计算和评价柱效的参数。但由于它的某些基本假设并不完全符合柱内实际发生的分离过程，例如，纵向扩散不能解释造成谱带扩张的原因和影响板高的各种因素，也不能说明为什么在不同流速下可以测得不同的理论塔板数，这就限制了它的应用。 1.10.4 影响柱效率的因素因素变化柱效率担体粒度变大？填充均匀提高（H下降）载气密度提高提高（H下降）压力提高提高（H下降）流速提高在某一流速下H极小温度升高？固定液液量下降提高（H下降）粘度下降提高（H下降）填充柱的气液色谱的速率方程：毛细管柱的气液色谱的速率方程：液液分配色谱的速率方程：1.11.2 内标法 测定化合物A的有效成分含量n 称取化合物A标准品（含量为99%）0.1012克，在100mL容量瓶中用二甲基甲酰胺溶解，加入内标物为邻苯二甲酸二丁酯（500mg/L）5mL，定容至刻度。 n 称取化合物A样品0.1120克，在100mL容量瓶中用二甲基甲酰胺溶解，加入内标物邻苯二甲酸二丁酯（500mg/L）5mL，定容至刻度。n 仪器条件：灵敏度：1.5 衰减：7 纸速：4 波长：254nm，进样量皆为10mLn 测定结果：化合物A标准品平均峰面积为15780 ，内标物平均峰面积为16890 ；化合物A样品平均峰面积为13550，内标物平均峰面积为16870。求化合物A样品的有效成分百分含量。n 解： 将测得的两针试样溶液以及试样前后两针标样溶液中，化合物A与内标物峰面积之比，分别进行平均。以质量百分数表示的化合物A含量X，按下式计算：n 式中： n 标样溶液中，化合物A与内标物峰面积比的平均值； 试样溶液中，化合物A与内标物峰面积比的平均值；m1化合物A标样的质量，g； 2试样的质量，g； P标样中化合物A的质量百分含量。化合物A的百分含量：1.11.3 外标法测定化合物B的有效成分含量 称取化合物B标准品（含量为99.8%）0.1008克，在100mL容量瓶中用三氯甲烷溶解，定容至刻度。 称取化合物B样品0.2053克，在100mL容量瓶中用三氯甲烷溶解，摇匀定容至刻度。仪器条件：FID。温度（）：气化室240 柱箱200检测器 250。进样量皆为1mL。测定结果：化合物B标准品平均峰面积为33986 ；化合物B样品平均峰面积为24399。求化合物B样品的有效成分百分含量。n 解： 将测得的两针试样溶液以及试样前后两针标样溶液中，化合物B，分别进行平均。以质量百分数表示的化合物B含量X，按下式计算： n 式中： 标样溶液中，化合物B峰面积的平均值； 试样溶液中，化合物B峰面积的平均值； m1化合物B标样的质量，g；m2试样的质量，g；P标样中化合物B的质量百分含量。化合物B的百分含量：第二节 气相色谱分析考试要点： 气相色谱仪流程图。各主要部件的功用及操作注意事项。 气相色谱法的基本原理和特点。 气相色谱仪的工作过程 填充柱色谱法和毛细管柱色谱法的异同点和用途。 常见的载体和固定相种类、品牌。用途和使用注意事项。 气相色谱仪常用的检测器。性能、构造、基本原理和使用注意事项。 分流、吹扫、尾吹、程序升温、保留时间、分离度、分配系数等重要名词概念。 常用的定量计算方法及简单的计算实例。2 气相色谱分析Gas Chromatography气相色谱仪流程 气相色谱仪通常由五大系统构成： 供气系统（高压钢瓶或气体发生器 、气体净化器 压力表） 进样系统（气化室、进样辅助系统） 分离系统（色谱柱、连接密封部件） 检测系统（检测器、电子放大器）计算机控制及数据处理系统（个人电脑、工作站软件）c6d8e86f8366f04845891b3b1a35a711.pdf 第 12 页 共 18 页 2.1 供气系统u 气源 分高压钢瓶、气体发生器两大类。各有优缺点，高压钢瓶气体压力输出相对稳定，一般不需要维护；气体发生器需要耗材、维护，输出压力较低，安全性能高。高压钢瓶 可提供小于15MPa的气体压力，旋转手柄顺时针开，逆时针关。 （氢气，瓶体绿颜色红字；氮气，瓶体黑颜色黄字等）气体发生器 包括：氮氢空一体机，氢空一体机，高纯氢发生器，高纯氮发生器等。可提供00.4MPa的气体压力 （氢气发生器，电解水、氮气发生器等）u 减压阀 调节气体压力使之输出合适的压力保证气相色谱仪正常工作。载气通常为0.5MPa，其他为0.3MPa左右。主表：指示高压钢瓶内的压力；次级表：指示输出的压力。旋转手柄可调节输出的压力。顺时针大，逆时针变小直至关闭输出。u 气体净化器 内装：变色硅胶、颗粒活性炭、分子筛 注意安装，自制的出口塞石英棉。u 转子流量计 红色浮子旋转高度 保持洁净u 电子流量控制器（EFC） 气化室的；检测室的 形状:仪器的型号不同而不同 规格:大小之分 进样橡胶隔膜 性能：一般和耐高温的两种。用前要处理；有的可以用硅胶板打孔自制。 吹扫：克服记忆效应 分流：防止过载 分流比：样品气化后放空的体积与进入色 谱柱体积之比。 尾吹：克服检测器的死体积，使色谱峰形 状尖锐。2.3 分离系统2.3.1 柱温箱 分析结果重现性好 保证检测稳定性2.3.2 色谱柱2.3.2.1 填充柱: 柱管材料： 玻璃、不锈钢、铜管、铝管 形状： U形、圆形 口径：34mm 长度：0.53m2.3.2.2 毛细管柱 柱管材料: 熔融石英管 形状:圆形 口径：180 530mm 长度：15m60m2.3.3 载体 惰性硅藻土等1 外观红色2 外观白色，Gas Chrom Q，Chromsorb HP等2.3.4 固定相 化学键合固定相，交联1 非极性 甲基硅酮SE-30,二甲基硅油OV-101等2 中性 苯基甲基硅酮OV-17，氟烷基硅酮QF-1等3 极性 聚乙二醇-20M，二乙二醇丁二酸酯DEGS等2.4 检测系统 2.4.1 检测器的分类 气相色谱检测器是把载气里被分离的各组分的浓度或质量转换成电信号的装置。目前检测器的种类多达数十种。根据检测原理的不同，可将其分为浓度型检测器和质量型检测器两种： 1浓度型检测器 测量的是载气中某组分浓度瞬间的变化，即检测器的响应值和组分的浓度成正比。如热导检测器和电子捕获检测器。2质量型检测器 测量的是载气中某组分进入检测器的速度变化，即检测器的响应值和单位时间内进入检测器某组分的量成正比。如火焰离子化检测器和火焰光度检测器等。 按照检测化合物的范围和种类可分为通用型、选择性检测器。通用型检测器：热导池检测器TCD、氢火焰离子化检测器FID。选择性检测器：电子捕获检测器ECD，测含电负性的物质；焰光度检测器FPD，测含硫磷的 化合物；氮磷检测器NPD，测含氮磷的化合物。2.4.2 检测器的性能 灵敏度、检出限和最小检出量 检测器的灵敏度，亦称响应值或应答值。一定浓度或质量的试样进入检测器后，就产生一定的响应信号R。直线的斜率就是检测器的灵敏度S。 检测限与最小检出量或最低检出浓度的区别： 后者与柱效率及操作条件有关。 线性范围：指试样量与信号之间保持线性关系的范围，用最大进样量与最小检出量的比值来表示。范围愈大，愈有利于准确定量。 响应时间：指物质通过检测器时，响应值随着物质浓度变化滞后的时间。响应速度越快越好。 基流（本底电流或零电流）：没有任何样品加载到流动相中时，检测器所产生的信号的瞬间值。 稳定性：指对色谱操作条件的变化的响应，如流速、压力、温度的变化。2.5 计算机控制及数据处理系统 个人计算机 色谱数据处理器 工作站软件2.6 故障诊断与排除 无峰或峰很小色谱柱是否与进样口和检测器正确连接?进样口是否漏?1更换进样垫 2 检查进样衬管是否损坏柱是否与进样口连接？?是否使用自动进样器1检查进样针 2更换进样针推杆3样品瓶中是否有足够的样品，以便进样针能吸到样品？点火了吗？ (FID) 柱中是否有载气寻找色谱峰的方法(多数的情况是有漏或堵塞 )火点着了吗?1用一个玻璃片放在 FID 出口有水蒸汽冷凝2检测仪器的输出值- 数值是否大于 0.0？柱中是否有载气?1拆开柱到检测器一端 2用流量计（或皂沫流量计）测量有流量综合 1已点火 2柱出口有流量3检测器喷嘴可能被堵塞检查FID组件 （注意请记录零件的安装顺序）1检查喷嘴本身 -2被石墨碎屑堵塞（拆下柱子时，石墨垫的外型有变化）3用旧的进样针清除堵塞物4重新安装FID组件 5再次进样基线不好的问题(检查气源的质量)使用气体过滤器色谱柱故障的诊断与排除 峰型不好（拖尾）1. 柱过载 减少进样量或将样品稀释10倍稀释样品可以得到较好的结果2. 试一下较厚液膜的其他色谱柱前面介绍的所有内容均适用前伸峰和拖尾峰均说明是非线形的分配 即色谱柱与样品不匹配使用不同选择性的色谱柱可以解决这个问题分析过程中基线位置突然变化o 基线偏离或漂移o 基线偏离 不规律地升高或降低在整个色谱过程中基线不规律地升高或降低o 偏离或漂移是由于下列原因产生的 温度 流速o 确保在两次进样之间有足够的平衡时间o 检查体系是否有漏 主要检查进样口部分 柱前o 上次色谱过程中的残余的低挥发性流出物基线漂移o 正确地使用高纯度的载气o 色谱柱老化o 色谱柱的最高使用温度不能超过该柱所规定的最高温度极限o 进样口温度与检测器温度要高于色谱柱的最高使用温度基线噪音1色谱图的基线噪音太高2进样垫流失3密封垫的类型不对或使用时间过长，需要更换4新的密封垫在柱温箱中老化过夜，以除去易挥发性化合物5vespel 密封垫不能超过使用温度 (350 )6衬管被污染7较脏的样品每进样1520次后，更换新的衬管8气源可能被污染9选择正确的在线气体净化器 (traps)10每使用四瓶气体，至少要更换一次气体净化器检测器可能已被污染清洗检测器实验室是否有异常的气体色谱柱密封垫通用技术o 使用轻触点 - 不能过紧.o 保持清洁.o 在使用前烘焙密封垫.o 避免污染 - 指纹、油脂等.o 检查使用的密封垫是否有裂纹、碎片、或其它的损坏.柱故障的诊断与排除附加峰 有两种类型的附加峰 1 即使不进样也会出现的峰 (鬼峰) ，并且在色谱分析 过程中也会出现在真实的峰之中 2 由样品产生的附加峰鬼峰1. 柱头污染2. 烘焙色谱柱，然后做空运行（无样品）3. 进样垫流失 使用高质量的产品4. 载气不纯 使用高纯度的载气及高质量的气体净化器，并定期更换5. 载气中杂质与固定相发生反应 6. 若使用分流/无分流进样口进样口底部的密封垫可能会与样品反应柱故障的诊断与排除一、色谱峰丢失1. 色谱图中没有出现你希望得到的样品组分峰 柱故障的诊断与排除峰型不好 柱过载 将样品稀释10倍重新进样 使用较厚液膜但固定液相同的色谱柱 减少进样量 小体积进样 增加分流比2. 可能是几个未分离的色谱峰将柱温降低20再进样局部的分离可以显示其它额外样品组分使用较长的色谱柱3. 试一试不同选择性或不同极性的柱子 如将HP-1换成HP-5如将HP-5换成HP-35或HP-50+例如半挥发性的苯甲酸（色谱性能不好）二、柱故障的诊断与排除峰型很差合并的峰（未分离的峰）将柱温降低20-30在进样口的底部安装柱子的地方安装绝缘帽将进样口温度增加20-30检查样品与溶剂的选择是否正确对极性的化合物使用极性的溶剂检测器过载减少进样量或将样品稀释10倍或者使用较大的分流比稀释样品可以达到较好的效果色谱柱安装到进样口三、评定因素o 安装深度 - 柱到针的间隙 1. 按照厂方的介绍, 2. 在进样针头到柱保留1-2cm的间隙 3. 对分析物和样品基质选择适用的衬管4. 使用专用的柱切割器5. 保证所有的柱接头及其它接口不漏2.7 气相色谱的应用 石化分析 环境分析 食品分析 药物和临床分析 物化参数的测定 聚合物分析 农药残留分析2009年仪器分析课件3 液相色谱分析 高效液相色谱仪流程图。各主要部件的功用及操作注意事项。 往复式高压柱塞泵的工作原理。 液相色谱法的基本原理和特点。 液相色谱仪的工作过程 反相液液分配色谱和正相液液分配色谱。 常见的高效液相色谱柱的特点。常用的填料和品牌及使用注意事项。 液相色谱仪常用的检测器。性能、构造、基本原理和使用注意事项。 高效液相色谱仪的进样装置。 梯度洗脱等重要名词概念。 常用的流动相种类、性质和要求。高效液相色谱仪一般可分为4个主要部分：高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统、计算机控制及数据处理系统。此外还配有辅助装置：如梯度淋洗，自动进样及数据处理等。其工作过程如下：首先高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样器送入色谱柱，然后从控制器的出口流出。当注入欲分离的样品时，流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱进行分离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器送出的信号记录下来，由此得到液相色谱图。1-贮液器 2搅拌、超声脱气器 3梯度洗脱装置 4高压输液泵 5流动相流量显示 6柱前压力表 7输液泵泵头 8过滤器 9阻尼器 10六通进样阀 11色谱柱 12检测器 13记录仪(或数据处理装置) 14回收废液罐高效液相色谱仪流程示意图3.4.2 高压输液系统 由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此对流动相阻力很大，为使流动相较快流动，必须配备有高压输液系统。它是高效液相色谱仪最重要的部件，一般由储液罐、高压输液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组成，其中高压输液泵是核心部件。对于一个好的高压输液泵应符合密封性好，输出流量恒定，压力平稳，可调范围宽，便于迅速更换溶剂及耐腐蚀等要求。常用的输液泵分为恒流泵和恒压泵两种。恒流泵特点是在一定操作条件下，输出流量保持恒定而与色谱柱引起阻力变化无关；恒压泵是指能保持输出压力恒定，但其流量则随色谱系统阻力而变化，故保留时间的重现性差，它们各有优缺点。目前恒流泵正逐渐取代恒压泵。恒流泵又称机械泵，它又分机械注射泵和机械往复泵两种，应用最多的是机械往复泵。3.4.2.1 贮液器 耐腐蚀，玻璃、聚醚醚酮（PEEK）材料。0.52L，入罐前过滤。3.4.2.2 流动相u 流动相是影响分离的一个重要调节因素。一种理想的液相色谱流动相溶剂应具有低粘度，检测器兼容性好，样品容易回收和低毒等特性。u 正相高效液相色谱法流动相常以己烷做基础溶剂。当洗脱极性较强的组分时，通常用二氯甲烷、四氢呋喃来调节极性。u 反相高效液相色谱法采用的流动相多为甲醇、乙腈配合水。一般情况下甲醇水体系能够满足多数样品的分离要求。流动相选择注意事项：1.纯度：采用“ HPLC ”级溶剂 2.避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂3. 对试样有适宜的溶解度 4. 溶剂粘度要小 5. 与检测器相匹配流动相前处理 1. 过滤：0.45mm或更小孔径滤膜 目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱 柱，尤其是使用无机盐配制的缓冲液。2 .脱气 目的：除去流动相中溶解或因混合（甲醇和水）而产生的气泡 方法：超声波振荡+抽真空：5min+5min 吹氦气法（鼓泡法）：氦气在流动相中的溶解度比空气低，可以将溶解的气体驱逐出去。脱气效果好，但成本高。在0.5MPa的压力下，先以100ml/min，鼓泡15min，然后以20ml/min保持着。 在线脱气器: 膜过滤器。溶解在流动相中的气体可以从膜中被真空脱出，而液体不会从膜中出来。脱气效果最好。气泡对测定的影响： 柱流量不准 检测器基线波动 氧会使荧光猝灭脱气注意点： 每天脱气(无在线脱气器时） 混合溶剂脱气时间不能过长水 水是反相高效液相色谱法最重要的溶剂，它也是最难纯化和保持其特性的流动相之一。水的纯度至关重要，特别是在痕量分析，检测器处于高灵敏度状态时。长时间使用纯度满足不了要求的水，有时会出鬼峰。水的纯化可以采用蒸馏、离子交换等方法。水中有机物可以用高锰酸钾或通过一根C18柱去除。水中容易滋生微生物，一定要用新鲜的，最好每天换水，更换时间最长也不要超过7天。电蒸馏水或去离子水必须至少在全玻璃系统下重蒸馏一次才能上机使用。可以采用下列程序检验水的纯度：首先泵100mL水通过C18柱，然后跑一个线性梯度洗脱，流速1mL/min，10分钟流动相甲醇从0升到100%，保持15min，通过一个在线紫外检测器测定。如果在0.08AUFS档位基线漂移小于10%，几乎不出峰，即使出峰其峰高也小于满刻度值35%。18.2M。在使用电化学或其他高灵敏度检测器时，二次蒸馏设备需要采用全石英玻璃系统。乙腈 这是反相高效液相色谱常用的溶剂，实验室常用的只能满足紫外检测器的需要。这样的试剂很难符合荧光和电化学检测器的要求。甲醇 反相高效液相色谱常用的溶剂之一，其杂质主要是水。市面上能够买到紫外光谱纯的商品，但它的主要问题也是有些特性满足不了荧光和电化学检测分析。氯代烃类溶剂 在正相高效液相色谱中常用的二氯甲烷等氯代烃类溶剂中，添加稳定剂甲醇或乙醇。乙醇能够提高流动相的极性，缩短正相高效液相色谱分析中各组分的保留时间。各批次之间浓度的变化也许会影响重复性。国内市场上可能不容易买到不含稳定剂的氯代烃类溶剂，但是可以用氧化铝柱吸附的办法或者用水萃取脱掉。不含稳定剂的氯代烃类溶剂可以缓慢的分解，特别是与其他溶剂共存时。分解的盐酸会腐蚀不锈钢部件，损害色谱柱。以戊烯为稳定剂的氯代烃类溶剂可避免上述产生的问题。3.4.2.3 输液泵 要求： 泵体耐化学腐蚀。使用优质耐酸不锈钢（Cr18Ni2Mo2） 能在高压下连续工作。4050MPa。 输出流量范围宽。 输出流量稳定，重复性高。控制方式：恒流控制:恒流泵有注射型泵和往复泵，后者广泛采用。 优点：组分保留时间重现性好。 缺点：压力有脉动 ；柱塞直接与流动相接触 3；长期运载，单向阀易堵塞。 恒压控制：恒压泵。常用压力单位换算表 MPa(兆帕)(N/m2)PSI(磅/英寸2)(b/in2)标准大气压（atm）毫米汞柱(托Torr)(0,mmHg)巴(bar)公斤力/厘米3(kgf/cm3)1145.0389.8697500.621010.1973.4.2.4 梯度洗脱装置所谓的梯度洗脱，就是将两种或两种以上的不同极性的溶剂进行混合，作为流动相使用。在进样过程中，连续不断地按预先拟定的程序改变流动相的浓度和极性。由于流动相极性发生变化，使得选择性得以改善，从而提高了分辨能力，缩短了分离时间。常用的梯度洗脱有低压洗脱、高压洗脱。高压梯度装置是用高压泵分别将两种或三种不同极性的溶剂输入混合器，充分混合后进入色谱柱。多元低压梯度洗脱只需要一个高压泵，而多元高压梯度洗脱就需要多个高压泵。3.4.3 进样系统 高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多（约530cm），所以柱外展宽（又称柱外效应）较突出。柱外展宽是指色谱柱外的因素所引起的峰展宽，主要包括进样系统、连接管道及检测器中存在死体积。柱外展宽可分柱前和柱后展宽。进样系统是引起往前展宽的主要因素，因此高效液相色谱法中对进样技术要求较严。 3.4.3.1 进样器 自动进样器和手动进样器 定量管（10mL，20mL，50mL，100mL） 原理：（六通阀） 注入方式： 1）全量注入 2）部分注入 装填状态 进样状态可以用全自动或半自动的方式进多个样品 一般的设计用Rheodyne阀，气阀驱动3.4.4 分离系统 色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与固定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的其他金属。玻璃管耐压有限，故金属管用得较多。一般色谱柱长530cm，内径为45mm，凝胶色谱柱内径312mm，制备往内径较大，可达25mm 以上。一般在分离前备有一个前置柱，前置柱内填充物和分离柱完全一样，这样可使淋洗溶剂由于经过前置柱为其中的固定相饱和，使它在流过分离柱时不再洗脱其中固定相，保证分离技的性能不受影响。 柱子装填得好坏对柱效影响很大。对于细粒度的填料（20m）一般采用匀浆填充法装柱，先将填料调成匀浆，然后在高压泵作用下，快速将其压入装有洗脱液的色谱柱内，经冲洗后，即可备用。 3.4.4.1 柱箱柱温控制的优点： 1. 分析结果重现性好 2. 提高柱效 3. 降低柱压 4. 保证检测稳定性3.4.4.2 色谱柱 化学键合固定相 1 酯化键合（Si-O-R型），适用于正相色谱柱2 硅烷化键合（Si-O-Si-R型）,适用于反相色谱柱ODS柱的使用注意点： 1）柱压低于15MPa 2）柱温在40左右，最高使用温度为50 3）缓冲液pH使用范围为27 *硅胶在pH为34时稳定性最好 *碱浓度越低，流动相含水量越低，硅胶越稳定。3.3 基本原理、特点和分类基本原理 特点 分离效能高 选择性高 检测灵敏度高 分析速度快分类 吸附色谱 分配色谱 离子色谱 体积排阻色谱 定义 色谱法：利用组分在两相间分配系数不同而进行分离的技术 流动相：携带样品流过整个系统的流体 固定相：静止不动的一相，色谱柱填料(微粒硅胶或氧化铝)正相和反相分配色谱法的区别正相反相固定相极性极性大或中等极性小或中等流动相极性极性小或中等极性大或中等样品洗脱次序非极性先出来极性强先出来增加流动相极性的效果降低洗脱时间增加洗脱时间3.4.5 检测系统 在液相色谱中，有两种基本类型的检测器。一类是溶质性检测器，它仅对被分离组分的物理或化学特性有响应，属于这类检测器的有紫外、荧光、电化学检测器等。另一类是总体检测器，它对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应，属于这类检测器的有示差折光，电导检测器等。现将常用的检测器介绍如下: 紫外检测器 （包括二极管阵列检测器） 荧光检测器 示差折光率检测器 （几乎所有物质都有各自不同的折射率，因此差示折光检测器是一种通用型检测器。灵敏度可达10-7gcm-3。主要缺点是对温度变化敏感，并且不能用于梯度淋洗。 ） 电导检测器 蒸发光散射检测器3.4.5.2 衡量检测器的指标 l 灵敏度 S = R / Q R是检测器响应值的增量 Q是样品量的增量l 噪音 没有样品时检测器的最大输出信号l 漂移 检测器在一段时间内响应值的变化l 线性范围最大线性相应与最小检出限之比l 检测限样品产生三倍于噪音信号时的浓度l 信噪比S/N 注意最低检出量不是一个单纯的检测器指标。它实际上是评价整个色谱系统的指标，包括了色谱系统、分离机理、色谱柱在内的综合性指标，信噪比亦如此3.4.5.3 紫外检测器原理：基于被分析组分对特定波长紫