聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析过氧化物酶同工酶.doc

班级：植物118 姓名：凌云 学号：1101080807聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析过氧化物酶同工酶 2012.12.11研究背景： 同工酶是指能催化同一种化学反应， 但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。它们是DNA 编码的遗传信息表达的结果。最近的研究表明，同工酶与生物的遗传、生长发、代谢调节及抗性等都有一定的关系。因此，测定同工酶在理论上和实践上都有重要的意义。用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定同工酶，方法简便、灵敏度高，重现性强，测定结果便于观察、记录和保存。过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶。它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系。在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化。因此，测定这种酶的活性或其同工酶的变化情况，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。实验原理：电泳现象：带电颗粒在电场作用下向着与其电性相反的电极移动，称为电泳(简称EP )。本实验采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术，分离小麦幼苗过氧化物酶同工酶，根据酶的生物化学反映，通过染色方法显示出酶的不同区带，以鉴定小麦幼苗过氧化物酶同工酶。影响电泳的主要因素：若将带静电荷q的粒子放入电场，则该粒子所收到的引力F引可用数学式表示如下： F引=Eq （1）式中E为电场强度，单位为“伏特/厘米”，表示电场中单位距离上的电位差。如果这种情况发生在真空中，则带电粒子会朝着电极加速前进并且最后与电极相撞。但在溶液中，由于电场的牵引力F引与加速运动的粒子和溶液之间产生的阻力F引相对抗，故上述现象不会发生。根据Stokes公式，阻力的大小取决于粒子的大小和形状以及所在介质的粘度： F阻=6v （2）式中F阻是球形粒子所受的阻力，是球形粒子的半径，是溶液的浓度，v是粒子移动的速度。在溶液中，由电场而产生的加速力被阻力所对抗，因此： Eq=6v （3） 整理可得： v= Eq 6 （4）由此可以看出，粒子移动速度（v）与电场强度（E）和粒子所带电荷量（q）成正比，而与粒子的大小（）和溶液的粘度（）成反比。不难想象，非球形粒子（如DNA）在电泳过程中会受到更大的阻力，即粒子的移动速度还与粒子的形状有关。由于带电粒子的泳动速度受场强影响，使得同一带电粒子在不同电场里泳动速度不同。为了便于分析比较，常用迁移率（泳动度）代替泳动速度表示粒子的泳动情况，迁移率（泳动度）的定义是：带电粒子在单位电场强度下的泳动速度，若以m表示迁移率，则： m=v/E （5）将（4）代入（5）式得： m=q/6 （6）由上式可看出，迁移率（泳动度）m仅与带电粒子所带电荷的数量、粒子大小及形状和溶液度有关，而与电场强度无关了。由于氨基酸、蛋白质、酶等的电离度随溶液pH变化而变化，所以在实际电泳中，我们常使用有效迁移率这个概念，有效迁移率（）定义为迁移率（m）和当时条件下电离度的乘积。即： =m （7）将（6）代入（7）式： =q/6 （8）由（8）式可看出，凡能影响溶液粘度的因素如温度，影响分子带电量q及电离度的因素如pH值的改变，均会对有效迁移率产生影响。因此，电泳尽可能在恒温条件下进行，并选用一定pH的缓冲液。同时，所选用的pH以能扩大各种被分离物质所带电荷量的差异为好。这样，在外部条件基本稳定的情况下，各种成分将按其自身特有的性质在电泳中得到很好的分离。以上讨论的基本上是在溶液中进行的自由电泳的情况。而在实际应用中，为了便于分析、鉴定、保存结果或制备的需要，我们往往使用适宜的载体。电泳时应避免选用高电渗物质作支持介质。适宜的支持介质是电泳技术成败的关键。最后要考虑选用离子强度适宜的溶液，一般最适的离子强度在0.02-0.2之间。在稀溶液中，离子强度I可用下式计算： I=0.5MiZi （9）式中：Mi为离子的克分子浓度，Zi为离子的价数。聚丙烯酰胺凝胶的形成与特点：这种凝胶是由丙烯酰胺单体和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺，在催化剂的作用下聚合而成的。Acr和Bis 在它们单独存在或混合在一起时是稳定的，且具有神经毒性，操作时应避免接触皮肤，但在具有自由基团体系时，它们就聚合，引发产生自由基团的方法有两种，即化学法和光化学法。化学聚合的引发剂是过硫酸铵，催化剂是N,N,NN-四甲基乙胺（TEMED）。在催化剂TEMED作用下，由过硫酸铵（Ap）形成氧的自由基，从而引起聚合作用。TEMED在低pH时失效，会使聚合作用延迟，冷却也可使聚合速度变慢。一些金属抑制聚合，分子氧阻止链的延长，妨碍聚合作用，这些因素在实际操作时应予以控制。光聚合以光敏感物核黄素作为催化，痕量氧存在下，不太稳定，所以用它制备大孔痕的浓缩胶较为合适，采用化学聚合形成的凝胶孔径较小，而且重复性好，常用来制备分离胶。聚丙烯酰胺的基本结构，为丙烯酰胺单位构成的长链，链与链之间通过甲叉桥联在一起。链的纵横交错，形成三维网状结构，使凝胶具有分子筛性质，网状结构还能限制蛋白质等样品的扩散运动，使凝胶具有良好的抗对流作用。此外，长链上富含酰胺基团，使其成为稳定的亲水凝胶。该结构中不带电荷，在电场中电渗现象极为微小。这些特点，使得聚丙烯酰胺特别适于作区带电泳的支持介质。聚丙烯酰胺凝胶的质量主要由凝胶浓度和交联度决定。每100ml凝胶溶液中含有的单体（Acr）和交联剂（Bis）总克数称为凝胶浓度。用T%表示。凝胶溶液中，交联剂占单体和交联剂总量的百分数称为交联度，用C%表示，改变凝胶浓度和交联度，可获得不同密度、粘度、弹性、机械强度和孔径大小的凝胶，以便适应各种样品的分离。一般常用7.5%浓度的聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质，可骼2.4%的分离核酸。但根据蛋白质与核酸分子量不同，适用的浓度也不同。凝胶系统： 本实验采用不连续的聚丙烯酰胺凝胶系统，分离小麦苗过氧化物酶的同工酶，系统的不连续性表现在以下几个方面：（1）凝胶板由上、下两层胶组成，两层凝胶的孔径不同。上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。（2）缓冲液离子组成及各层凝胶的pH不同。本实验采用碱性系统。电极缓冲液为pH8.3的Tris-Gly缓冲液，浓缩胶为pH6.7的Tris-HCl缓冲液。而分离胶为pH8.9的Tris-HCl缓冲液。（3）由于pH不连续，在电场中形成了不连续的电位梯度。在这样一个不连续的系统里，存在三种物理效应，即电荷效应、分子筛效应和浓缩效应。在这三种效应的共同作用下，待测物质被很好地分离开来。下面以本实验要分离的小麦苗过氧化物酶同工酶为例，分别说明三种效应的作用： （1）电荷效应：各种酶蛋白按其所带电荷的种类及数量，在电场作用下向一定电极，以一定速度泳动。（2）分子筛效应：分子量小，形状为球形的分子在电泳过程中受到阻力较小，移动较快；反之，分子量大、形状不规则的分子，电泳过程中受到的阻力较大，移动较慢。这种效应与凝胶过滤过程中的情况不同。（3）浓缩效应：待分离样品中的各组分在浓缩胶中会被压缩成层，而使原来很稀的样品得到高度浓缩。其原因如下：A.由于两层凝胶孔径不同，酶蛋白向下移动到两层凝胶界面时，阻力突然加大，速度变慢。使得在该界面处的待分离酶蛋白区带变窄，浓度升高。B.在聚丙烯酰胺凝胶中，虽然浓缩胶和分离胶用的都是Tris-HCl缓冲液，但上层浓缩胶为pH 6.7，下层分离胶为pH 8.9。HCl是强电解质，不管在哪层胶中，HCl几乎都全部电离，Cl布满整个胶板。待分离的酶蛋白样品加在样品槽中，浸在pH8.3和Tris-甘氨酸缓冲液中。电泳一开始，有效泳动率最大的Cl迅速跑到最前边，成为快离子（前导离子）。在pH6.7条件下解离度仅有0.11的甘氨酸（pI = 6.0 ）有效泳动率最低，跑在最后边，成为慢离子（尾随离子）。这样，快离子和慢离子之间就形成了一个不断移动的界面。在pH6.7条件下带有负电荷的酶蛋白，其有效泳动率介于快慢离子之间，被夹持分布于界面附近，逐渐形成一个区带。由于快离子快速向前移动，在其原来停留的那部分地区成了低离子浓度区，即低电导区。因为电位梯度V、电流强度I和电导率S之间有如下关系：V=I/S所以在电流恒定条件下低电导区两侧就产生了较高的电位梯度。这种在电泳开始后产生的高电位梯度作用于酶蛋白和甘氨酸慢离子加速前进，追赶快离子。本来夹在快慢离子之间的酶蛋白区带，在这个追赶中被逐渐地压缩聚集成一条更为狭窄的区带。这就是所谓的浓缩效应。在此区带中，各种酶蛋白又按其电荷而分成不同层次，在进入分离胶前被初步分离，形成若干条离得很近但又不同的“起跑线”。当酶蛋白和慢离子都进入分离胶后，pH从6.7变为8.9，甘氨酸解离度剧增，有效迁移率迅速加大，从而赶上并超过所有酶蛋白分子。此时，快慢离子的界面跑到被分离的酶蛋白之前，不连续的高电位梯度不再存在。于是，此后的电泳过程中，酶蛋白在一个均一的电位梯度和pH条件下，仅按电荷效应和分子筛效应而被分离。与连续系统相比，不连续系统的分辨率大大提高，因此已成为目前广泛使用的分离分析手段。8.样品的检出及分析鉴定和保存仪器试剂：材料：小麦幼苗仪器：电泳仪一套（稳压电源及垂直板电泳槽） 北京六一仪器厂 微量进样品，100l 上海医用激光仪器厂试剂：2%琼脂、分离胶缓冲液pH8.9、浓缩胶缓冲液pH6.7、过硫酸铵溶液、电极缓冲液pH8.3、pH4.7乙酸缓冲液、样品提取液、0.5%溴酚蓝溶液、联 大茴香胺染色液、TEMED(四甲基乙二胺)实验步骤：1. 贮液配制（已配好）2. 凝胶的制备（1） 将贮液由冰箱取出，待与室温平衡后再配置工作液（2） 安装电泳槽。安装时，注意旋紧螺丝时，需均衡用力，以免夹碎玻璃片（3） 用2%的琼脂糖封底，以防漏胶（4） 按下表所示配制分离胶贮液号24156名称分离胶缓冲液分离丙胶H2OTEMED过硫酸铵用量（ml）1.32.76.00.0400.7在小烧杯中混匀后，立即灌胶，灌胶时，将电泳槽略微倾斜，用于扶稳，将小烧杯尖端抵在长玻璃片顶端中央某点，小心估倒入两玻璃片之间，灌至距短玻璃片顶端2厘米左右即可，放平电泳槽，立即用滴管在胶的上层小心轻缓地覆盖约2-3毫米厚的水层；灌注水层时要均匀轻缓，以防在胶顶部产生漏洞，影响结果，刚加水时，可看出界面，后逐渐消失，等到再出现界面时，表明分离胶已聚合，再静置一会儿，便可将水倒出，可用滤纸条从一侧略微吸浸，注意不要碰毁胶面，然后准备灌注浓缩胶。（5）按下表所示配制浓缩胶贮液号35156名称浓缩胶缓冲液浓缩丙胶H2OTEMED过硫酸铵用量（ml）0.51.02.20.020.3配制均匀后，立即灌胶，操作同分离胶的灌注，当胶面达到距短玻璃片0.5厘米左右即可，然后立即插入样品槽模板（梳子）。明确聚合完成后，在电泳槽内倒入电极缓冲液，然后小心拨出梳子，准备点样。3. 样品的制备（实验前已完成）4. 点样 向样品液中滴加1至2滴溴酚蓝溶液做为前沿指示，然后用微量进样品小心吸取样品液加到样品槽内。上样量：叶片样液和根部样液均以梯度上样：5l、15l、30l、50l5. 电泳接好电源线(注意电极!)。打开电源开关，调节电流，初始时控制在15mA左右，当前沿进入分离胶后，可调节电流到30mA 左右，待前沿指示染料下行至距胶板末端1-2厘米处，即可停止电泳。6.剥胶、染色及记录结果 垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳结束之后，将垂直板从电泳槽上取下，小心地将两块玻璃板分开，并小心地将凝胶置于大培养皿中，进行染色反应（浓缩胶可以去掉）。过氧化物酶在分解过氧化氢的过程中产生自由氧基，能使联大茴香发生颜色反应，产生褐色的化合物，所以用联大茴香胺染色液浸泡过的凝胶板上，有过氧化物酶同工酶蛋白质带的部位可以看到褐色的谱带。 染色过程如下： （1）向大培养皿中倒入约50mlpH4.7乙酸缓冲液，将胶板淹没，室温浸泡6-7分钟。 （2）用漏斗回收乙酸缓冲液，加入联大茴香胺染色液，将胶板淹没，室温下浸泡20分钟，在此期间会出现过氧化物酶同工酶的谱带，观察记录酶谱。实验现象： 结果分析：全模式根部电泳共出现了5条酶带，由上向下可编号为1、2、3、4、5，叶部电泳共出现4条酶带，与根部对比缺少4号酶带。1、2、3号酶带靠近负极，4、5号酶带靠近正极。对比如下：酶带编号根部叶部1颜色深，带幅宽颜色浅，带幅窄2颜色深，带幅宽颜色较浅，带幅一致3颜色很浅，带幅窄颜色较深，带幅宽4颜色浅，带幅窄无5颜色较深，带幅宽颜色浅，带幅窄总体：小麦幼苗根部同工酶总含量高于叶部，上方的同工酶含量根部少于叶部，下方根部多余叶部。分析：1、2、5带迁移率相同，可以看作小麦幼苗的特征谱带，但明显这3者在叶片和根部的含量和活性是不同的。与各营养器官执行的功能有直接联系。4号带在根部有，叶部却没有。反映了小麦生长初期的代谢特点。根据5条带迁移情况，可判断5种过氧化氢同工酶的分子量12345.（设带电量相同）小麦根部的POD同工酶分子量小，形状更接近球形，主要进行脂肪的-氧化，产生乙酰辅酶A，经乙醛酸循环，由异柠檬酸裂解为乙醛酸和琥珀酸，加入三羧酸循环.小麦叶部的POD同工酶分子量较大，主要参与光呼吸作用，将光合作用的副产物乙醇酸氧化为乙醛酸和过氧化氢。思考题：1、凝胶的化学聚合与光聚合有何不同？答：化学聚合的引发剂是过硫酸铵 (NH4)2S2O3，催化剂是N，N，N,N-四甲基乙二胺。在催化剂TEMED的作用下，由过硫酸铵形成的自由基又使单体形成自由基，从而引起聚合作用。TEMED在低pH时失效，会使聚合作用延迟；冷却也可使聚合速度变慢；一些金属抑制聚合；分子氧阻止链的延长，防碍聚合作用。这些因素在实际操作时都应予以控制。光聚合以光敏感物核黄素（即VB2）作为催化剂，在痕量氧存在下，核黄素经光解形成无色基，无色基被氧再氧化成自由基，从而引起聚合作用。过量的氧会阻止链长的增加，应避免过量氧的存在。光聚合形成的凝胶孔径较大，而且随着时间的延长而逐渐变小，不太稳定，所以用它制备大孔径的浓缩胶较为合适。采用化学聚合形成的凝胶孔径较小，而且重复性好，常用来制备分离胶。2、两个电泳槽中的电极缓冲液用过一次后，是否可以混合后再用？为什么？答：不能。因为电极缓冲溶液的缓冲能力与组成缓冲溶液的组分浓度和pH值有关，在电泳过程中水会被电离生成氢气和氧气，两个电泳槽的电极缓冲液用过一次后，缓冲液里离子的浓度会增大，造成缓冲液的缓冲能力发生变化，离子强度过大，会影响到蛋白质的活性，使电泳速度减慢，条带不清晰。所以不能混合后再使用。3、样品中加入40%蔗糖溶液的作用是什么？答：增加样品比重，使得样品能够沉到加样孔底部，而不会漂出来，防止样品扩散，从而可以使样品