实验一质粒DNA的提取纯化与琼脂糖凝胶电泳.doc

实验一、质粒DNA的提取纯化与琼脂糖凝胶电泳一、实验目的掌握质粒DNA提取的基本原理与实验技能，同时熟悉DNA琼脂糖凝胶电泳的基本原理与实验技能，进而了解质粒和核酸的基本性质以及琼脂糖凝胶电泳的特性。同时，掌握微量移液器、凝胶成像系统、紫外投射仪等实验仪器的使用方法。二、实验原理 利用SDS使细胞膜裂解，同时在碱作用下细菌的线形染色体DNA变性，而质粒DNA（共价闭合环状DNA，cccDNA）的二条链不会相互分开，当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA片段难以复性，从而与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起，而质粒DNA双链又恢复原状，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解状态存在于液相中，通过离心将可以将质粒DNA提取出来。DNA制备膜可选择性地吸附DNA，从而可快速地纯化质粒DNA。琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段大小范围较广，不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA片段。实验室中常规实验，一般用琼脂糖水平凝胶电泳装置进行DNA电泳。DNA在琼脂糖凝胶电泳中的快慢与DNA分子大小、琼脂糖浓度、DNA分子构象、电流电压和离子强度等多种因素有关。DNA的显色原理为溴化乙啶（EB）或其它染料可嵌入堆积的碱基对之间，在紫外灯下发荧光。但需注意EB是一种强诱变剂！三、实验材料、仪器与试剂（一）、实验材料含有质粒pBS的DH5a菌株（二）、实验仪器微量移液器， 台式高速离心机，恒温振荡摇床， 高压蒸汽消毒器(灭菌锅)，冰箱，琼脂糖凝胶电泳系统、凝胶成像系统，紫外投射仪等。 （三）、实验试剂与配制1、 小量质粒DNA提取试剂盒2、 LB液体培养基: 蛋白胨（tryptone）10g, 酵母提取物（yeast extract）5g, NaCl 10g, 用NaOH调至pH7.2-7.5。高压下蒸汽灭菌20分钟。3、 LB固体培养基：每升液体培养基加12g 琼脂粉，高压下蒸汽灭菌20分钟。4、 氨苄青霉素（Amp）母液：配成50mg/ml水溶液，-20 下保存备用。5、 TE缓冲液：10mol/L TrisCl (pH8.0)， 1mmol/L EDTA(pH8.0). 高压蒸气灭菌15分钟, 储存于4 冰箱。6、 琼脂糖7、 5TBE缓冲液：Tris. 54g, 硼酸27.5g, 加入20ml 的0.5mol/L EDTA(pH8.0), 定溶至1000ml.8、 6上样缓冲液：0.25% 溴酚兰, 40%(w/v)蔗糖水溶液。9、 溴化乙啶（EB）溶液母液：将EB配制成10mg/L，用铝箔或黑纸包裹容器，储于温室即可。10、 DNA电泳分子量标准（DNA marker）: Lambda DNA/EcoRI+HindIII Marker或其它MARker。四、操作步骤（一）、质粒DNA的提取纯化第一次使用时，将试剂盒携带的RNaseAl全部加入到S1溶液中，混合均匀，4保存。1. 细菌的培养和收集：将含有质粒pBS的DH5a菌株接种在LB固体培养基（含50mg/ml Amp）中，37培养12-24小时。用无菌牙签挑取单菌落接种到5ml LB液体培养基（含 50mg/ml Amp）中，37培养约12小时至对数生长后期。2. 取1.5ml在LB培养基中培养过夜的菌液，12000rpm离心1min，弃尽上清； 3. 用0.25ml已加入RNaseAl的S1溶液悬浮细菌沉淀，悬浮需均匀，不应留有小的菌块；4. 加0.25ml S2溶液，温和并充分地上下翻转混合均匀使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液。此步骤不宜超过5 min；5. 加入0.5ml 4预冷的S3溶液，温和并充分地上下翻转混合均匀，直至形成紧实的凝集块，室温静置2min。最高速度(12000rpm)离心5 min；6. 吸取步骤5中的离心上清并转移到DNA制备管(置于2ml离心管中)，3600rpm离心l min。如制备管中有液体残留，适当提高离心速度，再离心1 min，弃滤液；7. 将制备管置回离心管，加0.5ml Wl溶液，3600rpm离心 30s，弃滤液；8. 将制备管置回离心管，加0.7ml W2溶液，3600rpm离心30s；以同样的方法再用0.7ml W 2溶液洗涤一次。弃滤液；9. 将制备管移入离心管中，12000rpm离心1 min；10. 将制备管移入新的1.5 ml离心管中，在DNA制备膜正中央加60l水或洗脱液，室温静置lmin。 12000rpm离心l min洗脱DNA。（二）、质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳1. 稀释缓冲液的制备：用蒸馏水将5TBE缓冲液配制成0.5TBE稀释缓冲液.2. 1琼脂糖凝胶制备：称取0.5g琼脂糖，置于200ml 三角烧瓶中，进入50ml的0.5TBE稀释缓冲液，放入微波炉或电炉加热至琼脂糖全部熔化，取出混匀。3. 胶板的制备：将二端封闭的电泳槽置于水平支持物上，插上样品梳子。在冷却至50-60的琼脂糖胶液中加入EB溶液至终浓度为0.5mg/ml, 即10mg/ml的母液加2.5ul，混匀。小心地倒入电泳槽中至一定高度。待胶液完全凝固后拔出梳子。然后向槽内加0.5TBE稀释缓冲液至液面刚好没过胶板表面。4. 加样：取2-5ml样品加1ml 的6上样缓冲液，用移液枪混匀（在Parafilm膜上操作），小心加到样品槽中。同时加DNA分子量标准对照。5. 电泳：从负极到正极，60-80V, 电流40mA以上。 当溴酚兰条带移动至距凝胶前沿约2cm时，停止电泳。6. 观察和拍照：在波长为254nm的紫外灯下，观察DNA电泳带并估计其分子量大小。同时可用加红色滤光片和近摄镜片的相机拍照（光圈5.6下暴光10-120秒）。 五、问题与思考1. 质粒DNA提取纯化的原理乙醇纯化方法相比有什么优点？2. DNA染色的原理3. 质粒D