ESC的可塑性及定义.doc

胚胎干细胞的可塑性是指cell的分化能力本报讯 (记者 王颖刚 黄向东)最近，由国家“863”干细胞研究首席科学家赵春华教授领导的课题组，进行了一系列有关干细胞分化及跨系转化分子调控机制的研究后证实，在一定条件下原始干细胞可向其他组织细胞分化，可分化成骨、软骨、脂肪、肌肉、肝组织及神经细胞等。此发现为干细胞修复与干细胞移植的临床应用提供了理论基础和关键技术平台。据介绍，人体干细胞因为其在心脑血管疾病、恶性肿瘤和组织损伤修复等多种疾病的治疗方面有着广阔的应用前景而倍受人们的重视。随着干细胞生物学研究的不断深入，人们发现某些成体组织不但能再生而且可在一定外界环境下实现跨系统甚至跨胚层分化转变成其他组织系统的细胞，称为可塑性。但是有关干细胞的可塑性机制还远未被阐明。赵春华等在国际上最早提出原始干细胞亚群学说，认为人体发育过程中存留着具有多系分化能力的原始干细胞群体，储存在多种组织器官中，应需参与组织细胞再生与修复。科研人员日前已从胰腺、骨髓、肝脏、皮肤、骨骼肌、肺等多种人体组织中分离出原始干细胞，并证实在适当的诱导条件下原始干细胞可向其他组织细胞分化成骨、软骨、脂肪、肌肉、肝组织及神经细胞等。如从骨髓和皮肤等来源的原始干细胞经超致死量射线照射后，配合G-CSF等细胞因子可以重建受体小鼠的造血功能；体外可实现向脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、内皮细胞、肝脏样上皮细胞、神经细胞及造血细胞分化；体内移植后向小肠、肝、肺、造血、皮肤等多种组织器官定向分化等。原始干细胞亚群学说，从人体病理生理角度上讲更符合自体修复、自我更新的生理规则。按照这种思路，只要掌握原始干细胞的特异性标记及转化调控分子机制，就可以从某一组织中分离出成体干细胞并诱导分化形成其他组织细胞，避免胚胎干细胞应用的伦理问题和免疫排斥障碍。 (文章出处：中国医学论坛报)骨髓干细胞的可塑性及其在栓塞性疾病中的应用2007-09-21 18:48:29来自:生物01陈24【摘要】骨髓干细胞是成体干细胞的一种，在实验条件控制下可以分化为成肌细胞、成骨细胞、心肌细胞和神经细胞等，这种生物学特性被称为可塑性(plasticity)。20世纪末骨髓干细胞可塑性的发现以及相关技术的研究进展为栓塞性疾病的治疗开辟了新途径，有望成为其新治疗手段之一。【关键词】 可塑性, 骨髓干细胞； 栓塞性疾病血管栓塞是急性心肌梗死、脑梗死、血栓闭塞性脉管炎、糖尿病足等栓塞性疾病的发病原因。多年来其治疗方法无实质性进展，目前临床上针对这些疾病的主要治疗手段，如药物溶血栓、血管分流移植和介入手术等均难达到理想效果。20世纪末骨髓干细胞可塑性的发现以及相关技术的研究进展为栓塞性疾病的治疗开辟了新途径，有望成为其新治疗手段之一。骨髓干细胞（bone marrow stem cells, BMSC）是成体干细胞的一种，由造血干细胞（hematopoietic stem cells, HSC）、间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSC）和内皮祖细胞(endotheial progenitor cells, EPC)组成。骨髓干细胞在实验条件控制下可以分化为成肌细胞、成骨细胞、心肌细胞和神经细胞等，这种生物学特性被称为可塑性(plasticity)。人们对成体干细胞可塑性还没有统一的定义，一般理解为：干细胞除定向分化为其所在组织器官的特化细胞外，在一定条件下还能分化为与其所在组织不同的其他组织类型细胞。1 骨髓干细胞移植在心肌梗死治疗中的应用骨髓干细胞在心肌梗死中的应用是目前研究最为深入的领域之一。Orlic等1将经萤光标记的骨髓干细胞注射到心梗动物模型的梗死边缘区，9 d后新生的心肌组织约占心肌梗死部位存活心肌的68%。Fukuda 等2将标记EGFP(enhanced green fluorescent protein,强化绿色荧光蛋白)的转基因小鼠骨髓细胞移植给经致死剂量照射的心梗小鼠模型，8周后全骨髓细胞移植组心梗区EGFP+的心肌细胞超过了5 000/只；把克隆纯化的EGFP+MSC移植到经致死剂量照射的心梗小鼠模型，在心肌缺血区也发现了EGFP+actinin+的细胞。Deb 等3在8位接受女性心脏移植的男性患者的心肌组织中发现18%的心肌细胞、20%冠状动脉和14%的毛细血管Y染色体阳性，在排除细胞融合造成的混乱之后，Deb 等认为是患者的自体骨髓干细胞迁移到被移植的心脏中分化成为新的心肌细胞、冠状动脉和毛细血管。直接把自体MSC经冠状动脉移植到急性心梗或慢性心肌缺血病人的心脏，也能起到改善病人心功能的效果4，5。骨髓干细胞移植改善梗死后心脏功能的机制还不是十分清楚。外源性的MSC可以归巢到正常或梗死的心肌组织，但是MSC在正常的心肌组织中并不具有分化成心肌细胞和内皮细胞的生物学特性6。故有人认为并非MSC等细胞能转化成为心肌细胞和血管内皮细胞，而是MSC本身可以调节心肌细胞凋亡和心室重构，导致了患者心脏功能改善。Xiaohua 等7在骨髓干细胞移植心梗模型中检测到其型、型胶原蛋白、TIMP1（tissue inhibitor of matrix metalloproteinase,基质金属蛋白酶组织抑制因子1）、TGF1(transforming growth factor,转化生长因子1)等细胞外基质mRNA表达增加。他们认为MSC能够选择性地降低细胞外基质基因的表达，抑制心肌重构，改善心梗模型心功能。有人发现MSC对梗死区血管新生的直接或间接作用也促进了心肌修复和心脏功能改善8，9。也有人认为MSC与宿主细胞建立了电机械耦合直接参与宿主心脏收缩10。2 骨髓干细胞移植在脑梗死治疗中的应用传统观念认为脑组织缺血梗死以后中枢神经系统的神经元细胞难以通自身恢复或再生加以修复，这是脑梗死损伤致残的根本原因。随着干细胞和组织工程的兴起，近年来有不少研究者开始进行骨髓干细胞向神经细胞分化的研究。Mezey 等11在不能产生自体髓系和淋巴系血细胞的小鼠模型体内移植入骨髓细胞，观察到这些细胞在体内可迁移到大脑并表达神经特异性抗原，他们认为骨髓细胞可能是神经元细胞再生的来源之一。此后许多研究均证实在体外可诱导MSC向神经元样细胞分化。用粒细胞集落刺激因子（granulocyteolonystimulating factor, GCSF）作为动员剂，动员骨髓干细胞向缺血性脑梗死模型的梗死部位迁移，发现GCSF治疗组的脑梗死体积明显小于对照组，病理损伤也较轻，术后48 h在脑梗死灶发现CD 34+单个核细胞浸润，以及带有CD 34+椎形细胞生长。由于脑组织中无CD 34+细胞，因此推断GCSF动员了骨髓中的CD 34+细胞进入梗死部位并向神经元样细胞分化12。Yao 等13把人MSC在体外扩增并用参芪扶正液诱导30 min后注射到大脑中动脉栓塞大鼠脑部,所有模型鼠都存活6周以上，且肢体的运动功能提高，触觉、感知觉减退情况改善，免疫组化显示移植后MSC表达NSE （neurone specific enolase, 神经元特异性烯醇酶）、NF（neurofilament, 神经微丝）、GFAP（glial fibrillary acidic protein,神经胶质酸性蛋白）等人类特异性的抗原。Bang 等14把30例大脑中动脉栓塞合并严重神经功能缺陷的病人随机分为两组：A组静脉注射自体MSC（1108个/人），B组作为对照接受常规治疗，结果MSC移植组病人在移植后612个月中Barthel指数和Rankin评分持续稳定地好转。这些研究证明骨髓干细胞不仅能够迁移到梗死脑组织而且能改善脑功能。目前对干细胞促进梗死后脑组织功能恢复的机制只有一些假说。一种假说认为可能是干细胞替代损伤细胞整合入组织重建神经环路，促进了功能恢复。另一种假说认为骨髓干细胞与宿主脑组织的相互作用促进干细胞分泌一些具有促使下丘脑神经元细胞存活、生长和分化作用的因子如IL6、MCSF等, 这些因子促进神经元前体细胞生长分化迁移，使脑组织可塑性上调，促进功能恢复。Kurozumi等15用腺病毒载体将BDNF(脑源性神经营养因子)基因转染人MSC，并用于治疗大脑中动脉栓塞大鼠，结果MSCBDNF治疗组大鼠无论是脑梗死的体积还是脑功能的恢复都优于单用MSC治疗的对照组,说明神经营养因子对MSC移植治疗效果有积极的影响。3 骨髓干细胞髓移植在下肢缺血性疾病治疗中的应用下肢缺血性疾病包括动脉硬化性闭塞症、糖尿病足、血栓闭塞性脉管炎等，它们有一个共同的病理过程：血管管腔进行性狭窄，远端肢体供血不足。Esato 等16用自体骨髓细胞移植治疗8例患有慢性动脉疾病的患者，其中2例完全治愈，另外6例不同程度缓解。此后又有人先后发表了运用自体骨髓单个核细胞治疗动脉硬化性闭塞症和糖尿病足的病例报告17，18。但是无论是骨髓细胞还是骨髓单个核细胞都是混合细胞群，从以上病例报告中无法知道在这些混合细胞群中究竟是何类细胞亚群在对疾病起治疗作用。TateishiYuyama等19给25位下肢缺血性疾病的患者局部注射自体骨髓单个核细胞，给另外22位患者局部注射外周血单个核细胞，前者治疗效果优于后者，故此他们认为可能是骨髓单个核细胞群中的内皮祖细胞及其分泌的多种血管生成因子在治疗过程中发挥作用。Saigawa等20发现CD 34+细胞移植数量与下肢缺血性疾病治疗效果呈正相关,由于CD 34+细胞主要在造血干细胞和内皮祖细胞上表达,故他们也认为是造血干细胞、内皮祖细胞及其分泌的细胞因子在治疗下肢缺血性疾病时起作用。4 存在的问题及展望利用骨髓干细胞的可塑性治疗栓塞性疾患的研究目前还处于起步阶段，鉴于各个国家和实验室的条件不同以及实验研究人员知识结构的差异，即使是进行干细胞可塑性研究的学者对这一问题的认识也不尽相同。况且在干细胞可塑性研究的道路上本身也存在一系列问题有待解决，比如：干细胞的识别、分离、体外培养、是否存在癌变的可能、可塑性机制等。另外在临床实验中还应该注意：干细胞归巢的高效性和靶向性，分化的细胞是否具有组织细胞的功能，非靶点组织的异常血管增生，促进肿瘤及糖尿病视网膜病变的恶化等副作用等等。但是骨髓干细胞移植也有细胞来源不受限制、新生组织细胞和毛细血管可以实现功能上的融合等特点，为临床治疗栓塞性疾病提供了一条除介入、血管旁路移植以外的另一条新的非创伤性治疗途径。总之，骨髓干细胞用于栓塞性疾病的治疗无论在理论上还是在实践中均有其他传统治疗方法不可比拟的优势,值得进一步的研究和探讨。胚胎干细胞干细胞 (stem cell) 是指一类具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞, 在特定的条件下可以分化为不同的功能细胞, 形成多种组织和器官. 骨髓起源的干细胞即骨髓干细胞主要有三种: 造血干细胞、骨髓基质干细胞和多能前体细胞. 骨 髓干细胞具有可塑性 (plasticity), 即在一定的条件下能转化为不同于其组织来源的细胞.目前有四种机制来解释骨髓干细胞可塑性: (1)多能组织干细胞在出生后可以存在于体内多种组织和器官中, 它们的增殖与分化与各自的局部环境有关; (2) 成体许多组织内余存一种稀有数量的原始干细胞, 其类似于胚胎干细胞, 始终保持着胚胎干细胞的特性, 在不同的条件刺激下能分化为内胚层、中胚层、外胚层多种组织细胞; (3) 组织干细胞可以经历去分化或转分化的过程, 经过基因重组, 转化为不同组织来源的细胞; (4) 细胞融合改变细胞特性. 目前体内外试验均证实了骨髓干细胞向肝细胞的转化. 骨髓干细胞在体内或体外转化为肝细胞, 为临床应用开辟了新的道路. 关键词:干细胞; 造血干细胞; 骨髓基质干细胞; 多能前体细胞; 肝细胞; 可塑性 施晓雷, 丁义涛. 骨髓干细胞的可塑性及其转化为肝细胞的研究进展. 世界华人消化杂志 2005;13(24):2813-2817 /1009-3097/13/2813.asp 0 引言 1998年, 当科学家第一次从胚胎中分离出人多能干细胞, 并随后发现它能分化为体内几乎所有的细胞以后, 人们对于干细胞注入了极大的热情. 通常认为: 干细胞是指一类具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞, 在特定的条件下可以分化为不同的功能细胞, 形成多种组织和器官. 最新对于干细胞的定义, 科学家们列出了四个标准1,2: (1) 干细胞能够进行多次细胞分裂, 完成自我更新, 维持细胞数目的稳定; (2) 同一个干细胞能够分化为多种细胞种类. 如造血干细胞能够分化为所有的血细胞; 神经干细胞能分化为神经元细胞, 星形细胞和少突神经胶质细胞3; 基质干细胞可以分化为成纤维细胞、脂肪细胞、骨骼肌细胞等4; 但是有些成人干细胞只能分化为一种成熟的细胞, 如角膜干细胞. (3) 组织受损后, 移植的干细胞能够修复受损组织5-7, 如造血干细胞对骨髓完全抑制患者造血功能的重建. (4) 即便在组织未有损伤的状况下, 干细胞在体内也能转化为其来源的组织细胞. 干细胞根据其来源的种类, 组织及其分化成熟细胞的种类的不同, 分成不同的亚群. 如按细胞发育阶段的不同, 可以分为: 胚胎干细胞和成人干细胞; 按潜能大小可以分为: 全能干细胞和多能干细胞. 胚胎干细胞是全能干细胞; 成人干细胞属于多能干细胞. 胚胎干细胞虽然具有全能性, 但由于涉及伦理等问题, 所以人们把兴趣更多转向成体干细胞. 在成体干细胞中, 研究最多的是骨髓干细胞. 1 骨髓干细胞种类 目前已经被承认的干细胞主要有三种: 1.1 造血干细胞 1963年Becker et al 8分离了造血干细胞, 对造血干细胞的存在最可靠的试验是它能重建重度骨髓抑制患者的造血功能, 这是因为造血系统的重建需要移植的造血干细胞的自我更新, 和能分化为所有成熟的血细胞. 在小鼠和人中, 已经有多种方法用来分离和标记造血干细胞. 在小鼠中, 最初的标记物为Lin-, 进一步对Lin-细胞中的造血干细胞进行纯化的方法有在Lin-细胞中排除Hoechst和rhodamine染料阳性的细胞9, 在Lin-细胞中进一步筛选CD34+的细胞10或sca-kit-thylow的细胞11; Lin- CD34-中部分细胞也能重建造血系统12. 在人类, CD34+CD38+的细胞和能排除染料Hoechst的SP细胞富集造血干细胞13. SP细胞也在其他组织如骨骼肌中存在. 故有人认为SP细胞是骨髓和骨骼肌等共有的组织特异性干细胞14, 而另一部分人认为SP细胞是骨髓源性的干细胞, 定居于其它组织中15-17. 1.2 骨髓基质干细胞 骨髓基质干细胞是骨髓中另一种干细胞, 缺乏特异的表面标记物, 目前报告的基质干细胞的表面抗原有Stro118-20, CD13, CD49, CD29, CD44, CD71, CD90, CD106和CD12421. 由于缺乏特异的表面标记物, 在不同的实验室有不同的技术对其进行分离, 如免疫磁珠分离法、贴壁培养法. 在不同的实验室, 骨髓基质干细胞体外培养扩增的方法也不一样, 如不同的实验室使用不同的细胞因子, 如PDGF-BB、LIF、FGF4、FGF2等进行扩增. 由于不同的实验室对骨髓基质干细胞有不同的分离和培养方法, 获得的细胞功能一致性有待研究, 因此对其全能性或多能性有不同的发现, 如一些报告认为基质干细胞在体外能分化为神经原细胞, 而有的试验则认为不能分化为神经原细胞22. 1.3 多能前体细胞 一种具有高度可塑性的骨髓源性的干细胞多能前体细胞能够在小鼠, 大鼠及人的骨髓或其他组织细胞培养中获得23,24. 和骨髓基质干细胞一样, 它在体外贴壁生长, 但是和基质干细胞不同的是, 多能前体细胞在体外在相对差的营养条件下无限期地生长. 在体外, 特异性的生长因子能够诱导多能前体细胞分化为外中内各胚层细胞, 在体内, 多能前体细胞也显示了其广泛的分化潜能. 2 骨髓干细胞的可塑性 在过去的几年中, 一系列的研究表明成人干细胞的组织特异性的理论可能不正确. 因此提出了成人干细胞可塑性的定义: 成人干细胞在一定的条件下能转化为不同于其组织来源的细胞. 研究成人干细胞可塑性最多的是骨髓干细胞. 通过细胞表面标志或细胞功能活性分离出造血干细胞, 造血干细胞不仅能重建造血细胞, 而且能分化心肌细胞25-27、骨骼肌细胞28,29、内皮细胞30-32、肝细胞33-38、胆管上皮细胞38、消化道上皮细胞、肺上皮细胞等39多种细胞. 大多数文献认为骨髓基质干细胞在恰当的刺激下能转化为脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞40-42; 骨骼肌细胞43; 星形细胞、神经元细胞44-46; 心肌细胞47,48等细胞. 但有些文献否认其能转化为神经元细胞22、心肌细胞49. 还有文献认为: 其不仅可以转化为基质细胞, 还可以转化为肝细胞50等内胚层细胞. 骨髓多能前体细胞, 其表达胚胎干细胞的遗传标志, 体外培养条件类似于胚胎干细胞, 且能高度扩增; 在体外它不仅能分化成基质细胞, 而且能分化为内脏中胚层、神经外胚层细胞和肝细胞等内胚层细胞23. 3 骨髓干细胞可塑性机制 目前有四种机制来解释骨髓干细胞可塑性: (1) 多能组织干细胞在出生后可以存在于体内多种组织和器官中, 它们的增殖与分化与各自的局部环境有关. 如造血干细胞不仅存在于骨髓, 而且可以循环于外周血, 寄居于体内多种器官如肌肉组织内. 对造血系统被破坏的小鼠进行肌细胞移植后, 小鼠造血功能恢复, 是由于肌肉组织内的造血干细胞的作用引起的51. 骨髓中包含有卵圆细胞52, 对肝损害的小鼠进行骨髓移植后, 肝脏再生的原因是骨髓中的卵圆细胞在肝内转化为肝实质细胞. (2) 成体许多组织内余存一种稀有数量的原始干细胞, 其类似于胚胎干细胞, 始终保持着胚胎干细胞的特性, 在不同的条件刺激下能分化为内胚层、中胚层、外胚层多种组织细胞23. Suzuki et al53在小鼠胎肝中分离出一种细胞, 在体外能够扩增, 不仅能形成肝脏和胆道上皮细胞, 而且能形成胰腺和胃肠道上皮细胞. (3) 组织干细胞可以经历去分化或转分化的过程, 经过基因重组, 转化为不同组织来源的细胞54-57. 细胞的基因信息可以重组, 经过基因重组, 体细胞能够转化为多种不同的细胞. 从视网膜神经中提取少突胶质细胞, 在体外无血清, 低密度的培养条件下, 获得神经干细胞的功能和特征55. Shen et al 56发现胰腺上皮细胞能够转化为肝细胞的表型, 尽管对这种肝细胞的功能未做评价. (4) 细胞融合是最近对干细胞可塑性的又一种解释58,59. 有人将小鼠骨髓细胞和胚胎干细胞共培养后, 导致了细胞的融合. 将小鼠骨髓细胞和胚胎干细胞59, 或小鼠神经干细胞和胚胎干细胞共培养后60, 可以获得转分化的骨髓细胞或神经干细胞, 它们表现胚胎干细胞的功能和特征. 尽管在体外的研究中, 细胞之间的转化并不需要成人干细胞和胚胎干细胞或其它细胞共培养, 而且新的细胞也不是四倍体23,61. 但是到目前没有研究能够否认体内的细胞可塑性现象可能是由于细胞的融合. 骨髓细胞和其他细胞融合后, 形成异核体, 改变了基因表达方式, 转变为其他细胞的表型. 4 骨髓干细胞向肝细胞转化的研究 对于骨髓干细胞向肝细胞转化的研究, 是目前研究领域的热点问题, 主要包括了体内研究和体外研究. 4.1 体内试验 Peterson et al 33最早对骨髓干细胞向肝细胞转化做了研究, 他们用CCl4做大鼠肝衰模型, 并以2-AAF阻断受体鼠自身肝细胞的增殖, 通过三种途径追踪移植的骨髓细胞: (1) 将雄性大鼠的骨髓移植到受致死量照射的同系雌鼠体内后, 用DNA探针检测Y染色体的sry区来分辨受体肝脏中供体来源的细胞; (2) 将二肽基肽酶阳性 (DPPIV+) 的雄性大鼠的骨髓移植到DPPIV-的同系雌鼠体内, 检测受体肝内表达DPPIV的细胞; (3) 将表达L21-6抗原的Lewis大鼠作为受体, 不表达该抗原的同种异体Brown-Norway大鼠作为供体进行全肝移植, 检测移植肝中L21-6+细胞. 通过以上三种途径证实肝卵圆细胞的骨髓源性. Theise et al 34对没有急性肝衰的情况下, 同种异性小鼠间进行骨髓移植, 移植后2-6 mo, 用白蛋白mRNA和Y染色体的双FISH证实, 在移植存活的小鼠肝脏中有来源于骨髓的成熟肝细胞, 比例大约为2%. 进一步的试验分选出骨髓中CD34+Lin-的细胞具有相同潜能. Theiseet al 36对临床移植男性骨髓的女性患者和移植女性肝脏的男性患者的肝脏标本进行研究发现: 约4-43%的肝细胞和4-38%的胆管细胞来源于骨髓干细胞的横向分化, 而这种细胞的转化量有随肝脏损伤的程度和时间的增加而增加的倾向. Alison et al 35用同样的方法证实骨髓源性的干细胞可以转化为肝细胞, 尽管转化的细胞只有0.5-2%. Lagasse et al 37的研究发现, 型酪氨酸血症的模型大鼠经过纯化的造血干细胞 (hematopoietic stem cell, HSC)移植, 其肝脏生化功能有不同程度的恢复, 病情也基本得到缓解. Krause et al 39通过静脉输注单个造血干细胞后, 发现它除了可以分化为皮肤、肺、肾、小肠等上皮细胞外, 也能分化为肝脏实质细胞. 4.2 体外试验 日本学者Oh et al 52最早在体外对骨髓干细胞转化为肝细胞进研究. 他们建立已HGF为主的诱导体系研究, 对骨髓细胞进行体外诱导3 wk, 研究中发现了表达AFP mRNA, ALB mRNA的细胞, CK8 mRNA及CK18 mRNA的肝细胞样细胞, 同时他们通过RT-PCR检测发现大鼠骨髓细胞中存在表达AFP和c-met的细胞, 故认为骨髓中可能包含一些表达AFP的肝脏组细胞, 这些细胞在HGF的诱导下可转化为肝细胞. 但是这群细胞仅表达的是部分肝细胞的标记物, 因此只能说为肝细胞样细胞. 后来, 他们进一步对诱导体系进行改进, 以HGM为培养体系, 加入HGF和EGF作为诱导因子, 在试验过程中发现了肝细胞形态样细胞的出现, 而且在RNA水平检测到成熟肝细胞标记物TO和TAT的表达62, 从结果看, 表达成熟肝细胞标记物的那类细胞可以认为是肝细胞. Avital et al 63用磁分选仪从人和大鼠的骨髓中分离出一种Thy-1+/2m-的干细胞, 命名为骨髓来源的肝脏干细胞, 将其在体外培养, 7 d后可以转化NH3为尿素, 并有肝细胞的特异性标志-白蛋白及CAM5.2的表达, 以及白蛋白C/EBP及HNF-1mRNA的表达, 培养后的骨髓来源的肝脏干细胞通过透射电镜可观测到肝细胞所特有的超微结构, 最重要的, 研究发现这类细胞不仅具有肝细胞的形态特征, 而且还具有肝细胞的部分合成和代谢功能. Verfailie研究小组在骨髓中筛选和培养出多能前体细胞, 建立以FGF-4和HGF为主的诱导培养体系, 发现获得的细胞不仅具有肝细胞的形态和超微结构, 表达AFP, ALB, CK18等肝细胞标志, 而且还具有合成糖原, 尿素, 蛋白多种肝细胞的功能64. Fiegel et al 38通过筛选的造血干细胞, 建立HGF为主的诱导体系, 研究中发现了表达CK19 mRNA和ALB mRNA的细胞; 而Wang et al 50同样以HGF为主建立诱导体系, 对骨髓基质干细胞进行诱导, 诱导后发现表达AFP mRNA和ALB mRNA的细胞. 纵观所有的体外试验研究, 不难看出: 在体外, 通过建立恰当的诱导培养体系, 促使骨髓干细胞向肝细胞的定向分化. 而诱导培养体系的建立是关键, 需要模拟肝脏体内发生发育的机制. 但是, 肝脏的发生发育是极其复杂的过程, 体内的发生发育条件和机制必然有别于体外, 如何寻求到这种差别, 也是研究的重要突破口. 而对肝细胞复杂功能的鉴定, 也是试验主要的部分. 5 临床应用前景 骨髓干细胞在体内或体外转化为肝细胞, 为临床应用开辟了新的道路. 我国是个肝病大国, 终末期肝病的最为有效的治疗手段是原位肝移植. 但是肝移植本身存在着许多问题65,66 . 如器官短缺, 肝脏移植手术复杂, 术后需要服用大量的抗免疫排斥药物、移植肝和患者的长期存活还远没有到达满意的程度等. 因此, 寻求简便、安全、有效的肝移植替代疗法是临床迫切需要解决的问题, 肝细胞移植和生物人工肝是有效的治疗终末期肝病的方法67-70. 两种疗法的核心是合理的肝细胞来源和肝细胞良好的生物代谢功能. 但是肝细胞来源困难限制了这两种疗法的发展和使用. 骨髓干细胞在体外转化为肝细胞, 因此可以利用终末期肝病患者自身来源的骨髓干细胞系, 在体外产生的有功能的肝细胞, 不仅可以突破伦理学、免疫学的障碍, 而且具有来源可靠、取材方便等优点, 作为肝细胞移植和生物人工肝细胞的最好来源. 就骨髓干细胞向肝细胞转化而言, 必须要解决的问题是如何控制好骨髓干细胞向肝细胞的定向分化, 其核心是建立有效安全的诱导培养体系; 如何提高骨髓干细胞能转化为肝细胞的转化率. 骨髓干细胞在体内转化为肝细胞, 因此也可以直接进行骨髓干细胞的移植治疗终末期肝病. 分离骨髓干细胞, 在体外能够适当扩增; 通过何种途径最有效的解决干细胞在肝脏内的定植和分化, 是骨髓干细胞移植所要解决的问题. 总之, 骨髓多能干细胞的存在具有巨大的科研和临床价值, 对骨髓干细胞的生物性状, 细胞功能及运用的研究需要不断深入, 最终的目标是能够用于临床, 治疗诸如终末期肝病等疑难疾病. 6 参考文献 1 Verfaillie CM, Pera MF, Lansdorp PM. Stem cells: hype and reality. HematolH pylori 诱导P53蛋白表达. 1,2,3,4: 700, 900, 1 100, 1 300 mg/L H pylori. 3 讨论 细胞凋亡是一种多基因调控的自身程序性细胞死亡, 有关人体H pylori感染伴随细胞凋亡已经有许多报道5-10, 多数结果显示感染H pylori后细胞凋亡指数显著增加, 推测细胞凋亡可能是细胞增生过度的一种代偿性机制, 可作为潜在的癌前反应. Chen et al 5报道H pylori感染患者细胞增殖指数和细胞凋亡指数显著高于非感染患者, 在根除H pylori感染成功的患者, 细胞凋亡指数可恢复正常8-10. 在体外研究中, 不仅在培养的胃上皮细胞中加入H pylori能诱导细胞凋亡11-16, 而且在分离出的单核细胞或巨噬细胞中H pylori也能诱导细胞凋亡17-19. 我们将H pylori超生提取液在一种新建立起的具有分泌胃蛋白酶原的永生细胞系 (OUMS-37) 中诱导细胞凋亡, 与以往报道结果一致. 初期研究认为全菌接触细胞是诱导凋亡的条件之一, 以后研究表明H pylori的脂多糖成份以及H pylori的CagA和VacA状态也与细胞凋亡有关20-24. 一组前瞻性研究显示只有CagA阳性菌感染才伴随胃黏膜上皮细胞凋亡增加21, 但Peek et al25报道CagA+ VacA s1 阳性菌感染伴随细胞增殖系数的增加, 而细胞凋亡无显著改变, 推测这种不伴随细胞凋亡的过度增殖可能是CagA+ VacA s1阳性菌致病的机制之一. 有关H pylori VacA毒素状态与细胞凋亡相关性研究报道较多, 多数研究认为VacA毒素本身能诱导细胞凋亡, 采用基因重组22或VacA阳性菌株培养上清液23,24提取获得的VacA均在胃黏膜上皮细胞系中成功诱导细胞凋亡, 本研究H pylori虽然为VacA阳性菌株, 但鉴于VacA毒素一般存在于细菌的培养液中, 从菌体提取的超声粉碎物中VacA含量是非常低的, 故本文诱导细胞凋亡是非依赖VacA毒素的. 本研究还显示, H pylori诱导细胞凋亡不需全菌黏附, 进一步研究显示菌体超声提取液通过100 加热10 min后其诱导凋亡作用减弱或消失, 提示可能是菌体超声提取液中的活性蛋白成份起到作用, 该结果与shibayama et al 26报道一致. 关于H pylori诱导细胞凋亡的基因调控机制仍在研究之中.体外研究中Kurosawa et al27报道细胞凋亡伴有P53和bax表达增强, Zhang et al28报道P53阳性时细胞凋亡作用更强, Cho et al 22报道细胞凋亡伴有P53, P21和bax表达增强, 而Ashktorab et al报道细胞凋亡伴有P53和P14表达增强29, Unger et al在体内研究也证实了以上观点30. Choi et al 31结果显示H pylori诱导细胞凋亡伴bcl-2表达下调. 一般认为bcl-2家族由一组高度同源蛋白组成, 经bcl-2家族成员或其他蛋白之间的互相作用来调节细胞内信号传导, 进而调节细胞凋亡效应通路之下游共同的调定点. 在bcl-2家族中, bax, bak, bclxs等促进细胞凋亡, 而bcl-2,bfl-1, bclxl等则抑制凋亡. 在肿瘤研究过程中也表明, 野生型P53可诱导bcl-2表达的减少和bax表达的增加, P53是上游调控基因, bcl-2和bax是下游调控基因, bcl-2和bax的比例决定细胞是否存在还是凋亡. 本研究显示, H pylori呈现剂量依赖性地诱导野生型P53表达, 而且bax mRNA表达逐渐增强, bcl-2 mRNA表达逐渐减弱, 与H pylori诱导细胞凋亡结果一致, 支持以上结论. 本结果说明, H pylori超声提取物可在体外诱导鼠胃黏膜上皮细胞凋亡, 其机制可能通过在转录水平上调野生型P53和凋亡促进基因bax表达, 并下调凋亡抑制基因bcl-2表达, 说明H pylori在干扰胃黏膜细胞增殖和细胞凋亡间的平衡中发挥重要因素. 致谢: 感谢日本冈山大学医学部细胞生物部门难波教授惠赠大鼠OUMS-37细胞系; 日本冈山大学医学部细菌科横田副教授惠赠幽门螺杆菌菌株H pylori上调bax mRNA表达, 下调bcl-2 mRNA表达. 1, 2, 3, 4: 700, 900, 1 100, 1 300 mg/L H pylori. 图 3H pylori诱导大鼠胃黏膜上皮细胞凋亡. M: DNA分子质量标准; 1, 2: 对照组; 3, 4: H pylori处理组;H pylori超声提取液浓度为900 mg/L, 作用时间24 h. 图 2要 目的: 研究幽门螺杆菌 (H pylori) 在大鼠胃黏膜上皮诱导细胞凋亡中的作用, 并初步探讨其中凋亡相关基因表达的情况, 为胃癌发病机制提供依据. 方法: H pylori超声提取液来自Sydney SS-1 H pylori菌株. 大鼠胃黏膜细胞OUMS-37为永生化细胞, 当细胞生长至60%融合时, 加入不同浓度的H pylori超声提取液, 同时设置空白, 于培养的24-48 h收集细胞进行形态观察. Westhern blotting检测P53蛋白表达, Northern blotting检测bax、bcl-2 mRNA的表达. 结果: 细胞经H pylori作用48 h后在高倍镜下观察到细胞核碎裂成大小不等的块状, 表现出细胞凋亡如细胞皱缩, 胞浆嗜碱性, 核染色质固缩致密, 核染色质断裂, 形成大小不等的胞内核小体, 部分细胞核膜消失, 核染色质聚集中细胞中央, 呈现分裂期的形态学等形态学特征, 对照组未出现以上特征性改变. 培养细胞经过H pylori作用后提取DNA, 经15 g/L琼脂糖凝胶电泳, 在紫外线灯下观察呈现不连续的梯状结构电泳条带. 培养细胞经过H pylori作用后, Westhern blotting显示P53 蛋白表达随H pylori超声提取液浓度而升高, Northern blotting显示bax mRNA 表达随H pylori浓度而增加, bcl-2 mRNA表达随H pylori浓度而降低. 结论: H pylori超声提取液可在体外诱导鼠胃黏膜上皮细胞凋亡. 其机制可能通过上调野生型P53蛋白和凋亡促进基因bax mRNA表达, 并下调凋亡抑制基因bcl-2 mRNA表达. 提示H pylori感染可通过干扰胃上皮细胞增殖与凋亡之间的平衡在胃癌病因学中发挥作用. 关键词: 幽门螺杆菌; 细胞凋亡; 胃上皮; 细胞; P53; bax; bcl-2; 表达 姜海行, 聂海明, 邓德海, 覃山羽, 陶霖, 黄振宁. 幽门螺杆菌体外诱导大鼠胃黏膜上皮细胞凋亡. 世界华人消化杂志 2005;13(24):2838-2841 0 引言 细胞增殖和细胞凋亡间的平衡是多细胞生物体维持自身稳定的重要因素, 当两者发生失平衡时, 将导致细胞恶性病变. 体内外研究显示H pylori感染可能是胃癌发生的重要因素1,2, 尽管世界卫生组织将H pylori定为I类致癌源3, 但确切机制尚未阐明. 我们在一种新建立的大鼠永生化细胞系 (immortalized cell lines) OUMS-37 4研究H pylori在胃黏膜上皮诱导细胞凋亡中的作用, 并初步探讨其中凋亡相关基因表达的情况, 为胃癌发生的机制提供理论依据. 1 材料和方法 1.1 材料 bcl-2, bax cDNA探针由日本冈山大学医学部细胞生物部门迁俊也惠赠. P53单抗为Santa Cruz产品; Rediprimer随机引物标记系统购自Amersham Pharmacia公司. H pylori菌株Sydney SS-1由日本冈山大学医学部细菌科横田副教授惠赠, Hela细胞空泡试验证实为VacA阳性. H pylori在Brucella broth培养基 (Difco, 美国) 微氧环境下振荡中培养7 d后收获, 以6 000 g离心30 min, 弃上清, 用20 mL冰PBS (pH7.4)洗涤2次, 然后将其置于超声粉碎仪 (Astrason W-380, INC) 破碎细菌20 min, 在4 以20 000 g离心20 min, 收集上清, 经0.4 m滤纸过滤, 测定蛋白质浓度后, 置-80 保存. 1.2 方法 大鼠胃黏膜细胞OUMS-37由日本冈山大学医学部细胞生物部门难波教授惠赠. 将1.5105个细胞接种于35 mm培养皿中, 培养基为含100 mL/L小牛血清的DMED液 (Nissui, 日本), 在37 , 50 mL/L CO2饱和湿度的恒温培养箱内培养, 当细胞生长至60%融合时, 更换培养基并加入浓度700, 900, 1100, 1300 mg/L的H pylori超声提取液, 同时设置空白对照组, 于培养的48 h收集细胞进行形态观察和其他相关基因检测. 细胞经H pylori处理后定时用胰酶消化收集, 细胞离心涂片, 甲醇室温固定, Wright-Giemsa染色3 min, 高倍镜下观察. 用胰酶消化收集每组6106细胞, PBS缓冲液洗涤2次, 细胞溶于500 L含5 mmol/L Tris-HCL, 20 mmol/L EDTA和50 g/L TritonBX-100溶液中, 置于冰上30 min, 离心提取上清液, 上清液经酚/氯仿/异戊醇 (25241)提取和酒精沉淀, RNA酶消化, 重新提取和沉淀. DNA淀物溶解于10 L TE缓冲液 (pH8.0) 中, 以50 g/L琼脂糖凝胶电泳, DNA条带在紫外线灯下观察摄片. 1.2.1 Northern blotting分析 采用硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取方法提取细胞总RNA, RNA定量后再取20 g, 经甲醛-琼脂糖凝胶电泳分离, 应用虹吸迹法将RNA转移至Hybond N+尼龙膜 (Amersham, UK) 上. 杂交液含5SSC, 500 g/L甲酰胺, 1Denharts溶液, 20 mol/L磷酸钠 (pH6.8), 5 mol/L EDTA, 2 g/LSDS及100 mg/L 热变性蛙精DNA, bcl-2及bax探针浓度为30 g/L, 探针cDNA用P-dCTP随机引物反应标记, 于42 旋转杂交24 h, 洗膜后凉干, 置-80 曝光7 d. 1.2.2 Western blotting分析 取上述刺激细胞, 以每107细胞加入60 L细胞裂碎液10 min (150 mol/L NaCl, 1 mol/L EGTA, 1 mol/L EDTA, 10 g/L Triton-100, 1 g/L CHAPS, 2 mg/L aprotinin, 2 mg/L leupeptin)12 000 g离心15 min, 取上清, 以Braford法测定蛋白质浓度后, 每孔蛋白含量为40 g, 煮沸变性5 min, 经150 g/L SDS-PAGE电泳, 过夜, 然后电转移到Hybond ECL硝酸纤维膜 (Amersham, UK) 上, 100 g/L脱脂奶/PBST (含0.1% Tween20) 溶液封闭1 h, 加入11000 P53 单抗, PBS-T洗涤后以11000 Bio-HRP (Amersham, UK) 二抗与膜孵育1 h, PBS-T洗涤5次, 采用ECL系统曝光显迹. 2 结果 细胞经H pylori (400 mg/L) 处理48 h后, 主要形态变化为细胞固缩、胞质嗜碱性, 核染色质固缩致密, 或者核染色质断裂, 形成大小不等的胞内核小体, 部分细胞核膜消失, 核染色质聚集中细胞中央, 胞质略嗜酸性, 呈现分裂期的形态学表现. DNA沉淀物溶解于10 L TE缓冲液 (pH8.0) 中, 经15 g/L琼脂糖凝胶电泳, 在紫外线灯下观察呈现不连续呈梯状结构电泳条带, 对照组未见梯状条带(图1). 2.1 Northern blotting bax mRNA表达 随H pylori超声提取液浓度而增强, bcl-2 mRNA表达随H pylori浓度而减弱 (图2). 2.2 Westhern blotting P53蛋白表达 随H pylori超声提取液浓度而增强 (图3). 图 1其发病率逐年增高3, 而且研究表明其是隐源性肝硬化的重要病因4,5, 甚至可发展为肝癌6-8,36-38, 但其发病机制尚不十分明确9. 研究认为氧应激和脂质过氧化在NASH发病中占有重要地位1,10,11,18. 目前临床上药物治疗效果尚不理想1. 我们通过高脂饮食建立NASH大鼠模型, 动态检测氧化和抗氧化指标并应用复方中药进行干预, 观察实验性NASH肝组织的氧化损伤, 探讨复方中药通过抗氧化作用防治NASH. 1 材料和方法 1.1 材料 雄性SD大鼠50只, 体质量15010 g, 购自大连医科大学实验动物中心. 复方中药 (西洋参5 g、黄芪10 g、泽泻10 g、山楂10 g、白术10 g、车前草10 g、柴胡5 g、丹参8 g, 8味中药复合而成) 由大连210医院中药局按常规剂量上药水提为流浸膏, 参照人体用量, 按系数折算出大鼠用量, 加蒸馏水稀释成灌胃溶液 (含生药290 g/L). 胆固醇购自上海伯奥生物工程公司, 猪油自备. 超氧化物歧化酶 (SOD)、丙二醛 (MDA)、一氧化氮 (NO)、诱导型一氧化氮合酶 (iNOS)、总抗氧化能力 (T-AOC)、谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-PX)、还原型谷胱甘肽 (GSH) 等试剂盒购自南京建成生物工程公司. 1.2 方法 大鼠普通饲料喂养1 wk后, 随机分为6组 (n10). 正常组普通饲料喂养; 模型、组喂高脂饲料(880 g/kg普通饲料+100 g/kg猪油+20 g/kg胆固醇); 中药治疗、组分别在喂饲高脂饲料9 wk、13 wk予复方中药5 mL/(kgd) 灌胃, 每日1次, 其他组以相同剂量蒸馏水罐胃; 饮食治疗组在喂饲高脂饲料13 wk改为普通饲料喂养. 各组大鼠自由进食、进水, 分笼 (每笼5只) 饲养于202 、明暗各12 h的动物实验室内. 12 wk末处死正常组、模型组、治疗组大鼠; 剩余3组大鼠继续喂养至16 wk末处死. 方法为禁食12 h, 乙醚麻醉, 下腔静脉采血后处死, 迅速取出肝脏, 按常规制备血清、肝匀浆、肝组织石蜡切片标本, 肝组织于-70 低温保存. (1) 测定体质量, 肝比重和Lees指数; (2) 采用全自动生化分析仪测定血清ALT, AST, 全血GSH-PX (DTNB直接法); (3) 肝匀浆测定MDA含量 (改进后的硫代巴比妥酸荧光法), SOD活性 (改良的盐酸羟胺法), T-AOC, NO, iNOS, GSH (按试剂盒说明操作); (4) 肝脏病理学检查, 光镜下评估脂肪变性程度. 统计学处理 计量资料以meanSD表示, 各组间实验数据采用两样本均数的t检验; 等级资料采用秩和检验. 2 结果 2.1 大鼠体质指标变化 模型, 组, 饮食组大鼠均呈明显腹型肥胖状态. 模型, 组及饮食组体质量, 肝比重, Lees指数和和正常组相比显著增高 (P0.05, P0.01); 中药组肝比重, Lees指数模型组相比显著下降 (P0.01, P0.05), 中药组肝比重, Lees指数和模型组相比显著下降 (P0.05, P0.01, 表1). 2.2 血清ALT、AST及全血GSH-PX变化与正常组比较 模型, 组及饮食组ALT, AST显著增高 (P0.01), 模型, 组GSH-PX显著下降 (P0.01), 饮食组GSH-PX也降低 (P0.05); 中药组ALT, AST和模型组比降低 (P0.01, P0.05), GSH-PX增高 (P0.05); 中药组ALT, AST和模型组比显著下降 (P0.05, P0.01), GSH-PX显著增高 (P0.05, 表2). 2.3 肝MDA, NO, iNOS, SOD, T-AOC及GSH变化 与正常组比较, 模型组MDA显著增高, SOD, GSH下降明显 (P0.05); 模型组MDA, iNOS, NO显著增高 (P0.01, P0.05); 模型组SOD, T-AOC, GSH增高(P0.01); 中药治疗组GSH显著降低 (P0.05); 中药治疗组SOD显著降低 (P0.05), MDA增高明显(P0.01); 饮食治疗组S