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分子克隆技术实验报告题 目：分子克隆技术实验报告姓 名：周仁杰学号2008305201816班 级：08级张之洞班指导教师：李香花 练兴明中国武汉二一一 年 四 月分子克隆技术将M812载体上的水稻DNA片段亚克隆至pUC19载体上摘要： 利用碱裂解法抽提质粒pUC19和M812载体上的水稻DNA片段，在用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量后，将亚克隆载体pUC19与外源DNA进行限制性内切酶消化，然后回收目的片段。载体与外源DNA连接后，将DNA重组分子导入感受态细胞大肠杆菌菌株DH5a,均匀涂布到AMP抗性培养基上让其生长,筛选出转化子。关键词： 质粒载体 克隆 重组转化 琼脂糖凝胶电泳前言： 质粒是携带外源基因进入宿主细胞、扩增或表达外源基因的主要载体，它在基因操作中具有重要作用。质粒的分离与提取是最常用、最基本的实验技术。质粒的提取方法很多，大多包括3个主要步骤：细菌的培养、细菌的收集和裂解、质粒DNA的分离和纯化。本实验以碱裂解法为例，介绍质粒的抽提过程。带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。电泳的种类多，应用非常广泛，它已成为分子生物学技术中分离生物大分子的重要手段。琼脂糖凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点，已成为分离和鉴定核酸的常用方法。在pH值为8.08.3时，核酸分子带负电，在电泳时由负极向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构像不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入荧光染料（如EB）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。DNA重组技术包括载体及外源DNA片段的酶切消化、目的片段的获得及纯化、母的片段与克隆载体的体外连接、重组子的筛选和鉴定等内容。DNA片段的克隆技术是分子操作的核心部分。而其中，载体的作用尤为重要，载体必须具备三个条件：1.包含一个复制子，载体在受体细胞中能大量繁殖，其携带的外源基因才能在受体细胞中得到大量扩增；2.有一到多个限制内切酶的单一识别与切割位点，便于外源基因的插入；3.具有选择性的遗传标记(如抗生素抗性标记等)以此知道它是否已进入受体细胞，并据此标记将携带载体的细胞从其他细胞中分离出来。本实验采用CaCl2法制备感受态细胞：利用冰冷的CaCl2处理对数生长期的细胞，可以诱导其产生短暂的“感受态”，易于摄取外源DNA。转化效率为106 107转化子/mg DNA。 质粒的转化是指将质粒或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。将连接产物转化到感受态细胞中，实现重组克隆的增殖，便于后续分子操作。材料及方法：1.实验材料1携带pUC19质粒载体的大肠杆菌菌液2携带含有水稻DNA片段的M812载体的大肠杆菌菌液。3大肠杆菌菌株4培养基：携带pUC19质粒载体的大肠杆菌和携带含有水稻DNA片段的M812载体的大肠杆菌德培养先采用含相应抗生素的LA培养基，后采用LB培养基。大肠杆菌菌株DH5a采用LB培养基。大肠杆菌在37培养。5抗生素：氨苄青霉素，100g/ml；卡那霉素，50g/ml。2. 实验步骤2.1 质粒的制备 1. 吸取携带两种载体的大肠杆菌菌液各1.5ml菌体，12000g 1min,倒掉菌液；吸取1.5 ml菌液，再次收集菌体，尽量将菌液倒干净；2. 加入300ml 溶液 I，振荡打匀，重新悬浮细胞，震荡混匀（注意：应彻底打匀沉淀或碎块）； 3. 加入300ml 溶液II，轻柔颠倒混匀，放置至清亮，一般不超过5分钟（最好不超过2分钟）； 4. 加入300ml 溶液III颠倒混匀，放置于冰上10分钟，使杂质充分沉淀；5. 12000 g离心10分钟；6. 吸取800ml 上清液（注意：不要吸取到飘浮的杂质）至另一Eppendorf管中，加入2/3体积的异丙醇，室温下放置5分钟；7. 12000 g 常温离心15分钟；8. 倒尽上清，加500 ml 75乙醇浸洗除盐，（放置片刻后倒去上清；或离心5分钟）9. 加40ml 灭菌超纯水或TE溶解；10. 质粒的质量检测，-20保存。2.2 DNA的琼脂糖凝胶电泳1. 将洗净、干燥的制胶板放入制胶槽中，水平放置在工作台上，调整好梳子的高度；2. 称取0.24 g琼脂糖于30 ml 0.5TBE中，在微波炉中使琼脂糖颗粒完全溶解，冷却至温热时倒胶；3. 凝胶凝固后，小心拔去梳子；4. 将DNA样品与上样缓冲液混合后将样品依次加入点样孔中（上样缓冲液含甘油或蔗糖，利于DNA样品沉入点样孔中；含有电泳指示剂，以指示电泳的进程）；5. 将制胶板放入电泳槽中，加入电泳液，打开电泳仪，使核酸样品向正极泳动（注意点样孔在电泳槽的负极一端）；6. 电泳完成后切断电源，取出凝胶，放入0.5 g/ml的溴化乙锭（EB）中浸泡1015 min，在紫外透射仪上观察电泳结果并照相记录；2.3 外源DNA片段在质粒载体中的克隆 2.3.1载体pUC19和外源DNA的限制性酶切及酶切效应检测：（50 ml反应体系，用1.5ml tube，冰上操作） DNA 35 mlBamH I (10u/l) 1 mlKpn I (10u/l) 1 ml 10buffer 5 mlddH2O 8 ml37oC水浴中反应12小时，分别取5 ml 酶切产物用0.81.2%凝胶检测酶切效果 2.3.2 pUC19载体酶切产物的纯化1.加入ddH2O 150 ml （扩大体积），加入200l氯仿/异戊醇（24:1），颠倒混匀后离心10 min； 2.吸出上清，加1/10体积3M NaAc和两倍体积乙醇，-20放置15分钟以上；3.12000 rpm 4冷冻离心15分钟；4.倒去上清，用75乙醇浸洗沉淀，风干后BAC DNA溶于10 ml ddH2O，pUC18 DNA溶于20 ml ddH2O（1.5ml tube中）；2.3.3 M812载体酶切产物挖胶回收（柱式DNA胶回收试剂盒）： 1. 通过琼脂糖凝胶将目的DNA 带与载体带分开；2. 紫外灯下用干净的刀片切下含目的DNA 带的胶块放入1.5ml离心管中；（注意：不含DNA 的胶尽可能切除，在长波长的紫外灯下切胶，并尽量缩短DNA 暴露在紫外光下的时间）3. 按400l/100mg 胶的比例加入Binding Buffer II , 50-60C 水浴中10分钟，使胶融化，每2-3分钟混匀一次；（注意若胶的浓度较大需增加Binding Buffer II 的比例、增加融胶的时间，若胶块体积较大也需增加融胶的时间）4. 将融化的胶溶液转移到套放在2ml收集管内的UNIQ-10 柱中，放置2分钟，8000rpm离心1分钟；5. 取下UNIQ-10 柱，倒掉收集管内的废液，将UNIQ-10 柱放入同一个收集管内，加入500l Wash Solution ,8000rpm 室温离心1分钟；6. 重复5步一次；7. 取下UNIQ-10 柱，倒掉收集管内的废液，将UNIQ-10 柱放入同一个收集管内，12000rpm 室温离心15秒；8. 将UNIQ-10 柱放入一个新的1.5ml 离心管内，在柱子膜中央加40l Elution Buffer 或水（pH7.0），室温或37C 放置2分钟；（提高洗脱温度到55C-80C有利于提高DNA 的洗脱效率）；9. 12000rpm室温离心1分钟，离心管中的溶液即为回收的DNA 片段。2.3.4 连接反应（10l体系）： 外源DNA 4 ml目的载体DNA 4 ml10 buffer 1 mlT4 ligase (1U/ml) 1 ml 16 C 水浴保温过夜2.4 感受态细胞的制备及质粒的转化2.4.1 CaCl2感受态细胞的制备1. 前夜接种受体菌（DH5a），挑取单菌落于LB培养基中37摇床培养过夜（约16小时）；2. 取1ml过夜培养物于100ml添加有20mM MgCl2的LB培养基中，在37摇床上剧烈振荡培养约2.5-3小时（300rpm）；3. 将0.1M CaCl2溶液置于冰上预冷；以下步骤需在超净工作台和冰上操作4. 吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟；5. 4下4000rpm冷冻离心10分钟；6. 再吸取1.5ml菌液，重复操作4、5；7. 弃去上清，加入100ml预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置20分钟；8. 4下4000 rpm冷冻离心10分钟；9. 弃去上清，加入100ml预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮； 10. 细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂（15%20%甘油）后超低温冷冻贮存备用（70）。2.4.2转化1. 制备选择性培养基平板：在融化的250 ml LA培养基中加入250 ml Amp，250 ml X-gal，25 ml IPTG，混匀后倒入灭菌培养皿中；2. 取出3管制备好的感受态细胞，放在冰上融化；3. 每管感受态细胞中加入约20ng质粒DNA，3管分别加连接产物、标准超螺旋质粒DNA（阳性对照）及不加入任何DNA（阴性对照），用移液器轻轻吸打均匀，在冰上放置1分钟；4. 电转化仪输出电压选择1800V（1mm转化杯)，电击时间5毫秒；5. 将要转化的混合物加入预冷的1mm转化杯中，将转化杯插好，立即按下按钮电击；6. 立即加入1ml SOC或LB 培养基于转化杯中重悬细胞；7. 将细胞转入合适的培养管中37 培养1小时；吸取合适体积的菌液涂布已倒好的选择培养基平板上；37 培养过夜，观察结果。结果及讨论1.抽提质粒1 2 3 4 5 6 7 8 91 2 3 4 5 6 7和质粒酶切 图1 琼脂糖凝胶电泳检测质粒质量；其中 图2 琼脂糖凝胶电泳检测质粒酶切效果,其中1带 1 带为marker,24为pUC19, 57为M812 对照; 24为酶切后的M812; 5带为Marker；68为酶切后的pUC19; 9为未酶切的pUC19 图1中2-7均有三条带，分别为超螺旋、开环和线性质粒。最前面的是超螺旋，带最亮，证明M812质粒提取质量较好。5-7点样孔附近有亮带，可能来自于染色体DNA或者残留少量蛋白质。图2是质粒经Bamh1和Kpn1双酶切后的酶切检测效果图， 4的M812酶切结果符合预期，最前面DNA片段是从M812中切下的水稻外源DNA，而2、3观察不到酶切下来的外缘片段。通过条带4可知反应体系和酶切时间没有太大干扰，条带2、3可能在配制反应体系时没有加入内切酶或者招受污染导致内切酶失活。在pUC19的酶切结果电泳中，条带9比条带6-8稍靠前，说明酶切的6-8的超螺旋结构被破坏，酶切很成功。2.转化结果（照片遗失） 结果较好，阴性对照无菌落，缺乏相应的抗性基因，所以无法存活。阳性对照均为蓝斑，有相应抗性基因，但显色基因没被外援片段切断，所以存活显蓝色。在进行连接反应时，3个样品中加的均是挖胶回收到的成功分离的外源片段，蓝白斑均有。转化率不低，但是连接率较低。估计是反应体系存在一定问题或者本身外源片段连接率就不高。在涂板过程中可能玻璃棒未完全冷却，导致部分细菌死亡。转基因水稻外源基因拷贝数检测（Southern杂交技术）摘要：通过Southern杂交技术来检测转基因植物中插入的外源基因的拷贝数。本次试验首先用CTAB法提取水稻总DNA，经纯化检验DNA质量后，用相应的限制性内切酶进行处理，用凝胶电泳技术分离并得到不同大小的片段的DNA。将这些DNA片段原位转移到尼龙膜上与地高辛标记的探针进行杂交，通过相应的显色反映来判断转基因水稻外源基因的拷贝数。关键词： southern杂交 凝胶电泳 地高辛探针标记1. 前言Southern杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量的方法。主要包括带测定核酸分子的转移并结合到一定的故乡支持物上，和待测核酸分子与标记的探针进行杂交两个过程。利用Southern杂交法可进行克隆基因的酶切、图谱分析、基因组中某一基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性片断长度多态性分析（RFLP）等。将外源片段转入水稻基因组中，可以通过分子杂交技术检测转基因水稻外源基因拷贝数。抽提待测水稻的总DNA，然后用相应的限制性内切酶进行酶切，可以将总DNA分成大小不同的片段。利用凝胶电泳技术，可以通过分子筛效应使不同大小的DNA片段分离。而毛细作用可以使这些原本固定的琼脂糖凝胶特点位点的DNA片段原位转移到尼龙膜上。再用已经被地高辛标记的外源基因片段或其同源片段做为探针，在尼龙膜上进行杂交。如果转基因水稻中含有外源基因，就会与探针发生特异性结合，然后同过相应的显色过程就会很明显的在尼龙膜上体现。显色的位点越多，颜色越浓，就表明转基因水稻外源基因拷贝数越大。在此次抽提植物总DNA的方法选取CTAB法。CTAB(十六烷基三甲基溴化铵）是一种非离子去污剂，CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1-0.5mM NaCl）下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经离心弃上清后，CTAB-核酸复合物再用7075%酒精浸泡可洗脱掉CTAB。由此可以得到纯度较高的转基因水稻总DNA。选用地高辛是由于地高辛的安全性，与同位素相近的灵敏性及无生物素的内源干扰性。很适合此次的实验。2. 材料及方法：2.1 实验材料及试剂转基因水稻新鲜幼嫩叶片液态氮 CTAB（1.5）；氯仿/异戊醇（24:1）；酒精（75%）；NaCl（0.5mM）；DiG-high Primer HCl（0.125mM）；变性缓冲液（NaOH/NaCl）；中和缓冲液（Tris/NaCl）；转膜缓冲液(20SSC)杂交液：Washing buffer；Dilution of Blocking solution； Detection buffer；TE buffer；Blocking solution；Blocking solution；Color-substrate solution.2.2 实验步骤2.2.1植物总DNA的快速少量抽提（CTAB法）1. 采取新鲜幼嫩叶片在研钵中用液态氮冷冻，研磨成细粉；2. 取约0.4g左右细粉于1.5ml离心管，加入1ml预热至95C以上的1.5CTAB，混匀； 3. 65C水浴中放置30分钟，每隔5分钟上下颠倒混合数次 (DNase变性，促进内溶物释放)；4. 12000rpm离心5分钟；5. 吸取600ml上清于新的1.5ml离心管，加入等体积氯仿/异戊醇（24:1），上下颠倒数次，至下层有机相呈深绿色6. 12000rpm离心5分钟；7.吸取450ml上清于新的1.5ml离心管，加入两倍体积95乙醇和1/10体积3M NaAc，混合后室温放置10分钟；8. 12000rpm离心3分钟；9.弃去上清。用500ml 75乙醇浸洗沉淀5分钟，除去离子及CTAB残余，离心3分钟，弃上清,自然干燥；10. 加入50ml TE（含20mg/ml RNaseA），放于4C溶解；11. 充分溶解后，测定并调整浓度至250 ng/ml（Southern分析常用浓度）2.2.2 琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量1. 用胶带将洗净、干燥的制胶板的两端封好，水平放置在工作台上；2. 调整好梳子的高度；3. 称取0.24 g琼脂糖于30 ml 0.5TBE中，在微波炉中使琼脂糖颗粒完全溶解，冷却至温热时倒胶；4. 凝胶凝固后，小心拔去梳子，撕下胶带；5. 将电泳样品与上样缓冲液混合后将样品依次点入加样孔中；6. 将制胶板放入电泳槽中，加入电泳液，打开电泳仪，使核酸样品向正极泳动（注意点样孔在电泳槽的负极一端）；7. 电泳完成后切断电源，取出凝胶，放入0.5 g/ml的溴化乙锭（EB）中浸泡1015 min，在紫外透射仪上观察电泳结果并照相记录。2.2.3 总DNA酶切及结果检测1.根据所测DNA质量结果确定酶切的反应体系，进行酶切处理 DNA 10 ml Hind (10U/l) 1 ml 10buffer 2 ml ddH2O 7 ulTotal 20 ml 37酶切过夜 2.根据确定的酶切反应体系完成酶切，注意在添加试剂的过程中最后加入酶试剂3.加上样缓冲液终止酶切，也可65加热10min 使酶变性失活。 4.电泳检测酶切效率：每样品1/10量上样，电泳检测。2.2.4琼脂糖凝胶电泳1. 胶浓度0.7-0.8%；2. 胶厚度 5mm (250ml胶)；3. 点入所有的DNA；4. 指示剂量稍大，长时间指示；5. 点样顺序：marker，阳性对照，阴性对照，本组样品；6. 电泳电压：大电泳槽40V，12小时，1-1.5V/cm；7. 指示剂约移动10-11cm时结束电泳；2.2.5 探针效率检测1. 将探针DNA和control DNA按照相应比例稀释；（见实验指导书P29）2. 从每管中取1ul点膜；3. 紫外铰链3-5min；4. 将膜放入装有20ml Maleic acid buffer的塑料器皿中，室温2min；5. 将膜放入10mlBlocking solution中室温温育30min；6. 将膜放入10mlAntibody solution中室温温育30min；7. 用10mlWashing buffer洗2次，每次15min；8. 在10ml Detection buffer平衡2-5min;9. 将膜放入2ml新配置的Color substrate solution中暗室条件下显色，显色过程中不要摇动；10. 当斑点显示出来后，用50mlddH2O洗膜5min，照相，比对。2.2.6 转膜1. 凝胶的预处理:电泳槽中移出凝胶置于塑料板上，用切胶板把胶切成适当大小，切去右上角（最后一个样品的最前端）作为电泳方向记号把凝胶翻面，放入加有足量的0.125M的 HCl玻璃盘中，轻轻摇动约10min，使电泳指示剂溴酚蓝变为黄色为止（脱嘌呤）。倒去HCl溶液，加蒸馏水漂洗凝胶倒去蒸馏水，加入足量变性缓冲液（NaOH/NaCl）淹没凝胶，轻轻摇动变性30min。倒去变性缓冲液，加蒸馏水漂洗倒去蒸馏水，加入足量的中和缓冲液（Tris/NaCl）淹没凝胶，轻轻摇动30min中和。倒去中和液，蒸馏水漂洗 20SSC 中平衡10 min以上2. 另一玻璃盘中加入足量的转膜缓冲液(20SSC)，放上洗净的玻璃板，用2张滤纸放在玻璃板上，两端浸入转膜液中搭制盐桥3. 在盐桥滤纸上洒些转膜液，立即将胶放在盐桥上，胶的四周用塑料片与胶紧紧相连，防止短路（即放置吸水纸与盐桥相接）4. 小心将膜覆盖在凝胶上5. 膜上放2张滤纸，滤纸上放6cm厚的吸水纸，放上玻板，其上压约350g的重物，转膜过夜6. 转膜完毕，将膜小心取下，2SSC 短暂漂洗，用两张滤纸包住膜，紫外交联5分钟，做2次，80固定2 h或120 30min7. 用EB染胶以检测转移效果2.2.7 Southern杂交DNA的地高辛标记和检测1. 将500ng 模板DNA用无菌去离子水补足至8 l。2. 沸水浴或干浴98 C 10分钟，使DNA变性成单链并迅速冰浴冷却。3. 充分混匀DiG-high Primer （1#管），并取2 l至变性DNA管，混匀并离心。4. 37 C温育1小时或过夜（最大到不超过20小时）。5. 停止反应，65 C加热10分钟。3. 结果及讨论：3.1总DNA检测1 2 3 4 5图4总DNA酶切结果图 3.水稻总DNA电泳检测结果图3中条带1、5为maker，2-4三条带的亮度较弱，但是仍能分辨出条带。说明提取出的总DNA量较少，浓度较低。可能由于点样时DNA样品不够多，染色不够充分，或者DNA的质量不够好，也可能在实验的过程中酶的作用或者机械损伤被降解破坏了DNA分子等。图4中可以看出条带分布在一定的范围内。表示由于限制性内切酶的作用，DNA片段被切成不同大小的片段，酶切比较彻底。左1条带点样孔有亮带可能是蛋白质没有去除干净。3.2探针标记效率检测（照片遗矢） 实验组第3个浓度梯度（从高到低）与对照组第3个相当，但是实验组第四浓度梯度基本看不见。说明探针浓度为理想浓度的1/3。3.3.转膜后凝胶检测在实验中，我们肉眼可以观察到染色后的带型，但是比较模糊，照片中几乎不能辨别。分析其原因是染色背景太深，加上与DNA分子杂交的探针量不充足，探针的效率不高。实验中，HCl的浓度可能偏低而导致脱嘌呤不充分也会影响实验结果。 图5 杂交图表达检测摘要：用Trizol法从转基因水稻叶片中抽提RNA，然后进行反转录PCR(RT-PCR)，以mRNA 反转录生成的cDNA可作为PCR的模板进行扩增，最后进行凝胶检测。以扩增后cDNA电泳条带来指示转基因水稻中GUS基因表达的情况。 关键词：RNA提取；反转录；聚合酶链式反应；基因表达1. 前言Trizol 试剂是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相的快速抽提总RNA的试剂，在匀浆和裂解过程中，能在破碎细胞、降解细胞其它成分的同时保持RNA的完整性。在氯仿抽提、离心分离后，RNA处于水相中，将水相转管后用异丙醇沉淀RNA。用这种方法得到的总RNA中蛋白质和DNA污染很少，可以用来做Northern,RT-PCR,分离mRNA，体外翻译和分子克隆等。由于目前PCR技术只能扩增DNA模板，对RNA模板不能直接扩增，所以需要对抽提出来的RNA进行RT-PCR。RT-PCR 为反转录RCR（reverse transcription PCR）的缩写。逆转录PCR，或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。RT-PCR比Northern杂交更灵敏，对RNA的质量要求较低，操作简便，它是在转录水平上检测基因时空表达的常用方法。2. 材料及方法2.1 实验材料水稻幼嫩叶片2.2 实验步骤2.2.1 植物RNA的提取1. 液氮磨样，每管分装0.1克样品；2. 每管加1毫升Trizol 试剂（样品体积不超过Trizol 试剂体积的10），迅速混匀（若样品较多可先将混好的样品置于冰上）；室温下净置510分钟以利于核酸蛋白质复合体的解离；3. 加200 l的氯仿，用手剧烈摇荡15秒，室温下静置5分钟左右；4. 2-8 ，12000g 离心10-15分钟；将水相（上清）转入一新离心管，加0.5ml 异丙醇室温下沉淀10分钟；5. 2-8 ，12000g 离心15分钟；6. 弃上清，加1ml 75乙醇清洗RNA，振荡片刻后（务必使沉淀悬浮起来，以确保洗涤干净），7500g 离心5分钟，小心弃上清；7. 室温静置515分，使RNA沉淀恰好干燥，加入20 l DEPC水溶解保存于-70 。8. 取2 l 琼脂糖电泳检测RNA质量。2.2.2 RNA的琼脂糖凝胶电泳1. 用乙二醛/甲酰胺对RNA进行预变性，然后进行琼脂糖凝胶电泳2. 用甲醛和二甲基亚砜对RNA进行预处理，在含6或2.2mol/L甲醛的凝胶中电泳3. 检测 0.5TBERT-PCR 2.2.3 RT-PCR (Reverse transcription PCR) 2.2.3.1 RNA制备1. 利用Trizol 试剂 抽提植物总RNA 2. 用DU640稀释总RNA至1 mg / ml. 3. 将下列试剂在0.5 ml离心管混合:Total RNA 3ml (2-5mg) RNase-free DNase I 1ml (u / ml) 10 DNase I buffer 1 mladd DEPC-treated ddH2O 5 ml 37 温育15 min,然后 70 10 min. 2.2.3.2 逆转录酶反应1. 加1 ml 500 mg / ml oligo (d