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1 简介在分子生物学的发展史上，聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）的发明可以说是一个里程碑。它使得极其微量的基因片段呈指数倍的增长，从而使其可以被现有分子生物学中广泛使用的检测手段对其进行深入的分析。PCR的整个操作流程也相对比较简单，易于推广。而实时荧光检测技术在PCR中的应用又将PCR过程和产物检测过程合二为一，缩短了实验时间，减少了PCR产物污染的可能性，并可以实现靶DNA的PCR定量检测。MyiQ实时荧光定量PCR仪就是一台综合了PCR技术和实时荧光检测技术的检测仪器。它由iCycler热循环仪、MyiQ光学模块和MyiQ分析软件三部分组成。其中iCycler热循环仪内部设有96个反应孔，可以进行PCR及其它热循环基因扩增技术（如LCR、3SR等）。用户可以根据各自的需要调节反应的各个参数如保温的温度和时间、升/降温速度、热循环次数等，整个热循环系统的精确性、均一性等性能都是十分出色的。MyiQ光学模块的作用是在iCycler热循环仪进行PCR反应时进行实时荧光信号的收集。它可以同时收集96个反应孔中的单色荧光信号。这些数据可以用来进行PCR定量、熔点曲线等分析。MyiQ分析软件则是实现人机对话的关键，用户可以通过该软件设置反应条件、样品信息，又可以将实验中收集的数据进行分析从而得到可靠的实验结果。图1.1 MyiQ实时荧光定量PCR仪1.1 MyiQ 光学模块特性MyiQ光学模块包括两个组成部分：激发系统和检测系统。激发系统内有以下组件：一个风冷扇、一个50瓦卤素灯、一块热滤片（由红外线吸收玻璃制成）、一块激发滤光片、一套分光系统（由两块镜片组成，将单道光源分为96道光源从而实现96孔同时检测）。激发系统位于MyiQ光学模块的右前角，卤素灯所发出的光线由右至左垂直穿过热滤片和激发滤光片，然后通过分光系统分成96道光线射入iCycler热循环仪的96个反应孔中。激发滤光片发射滤光片CCD检测器样品孔图1.2 光学检测系统工作原理检测系统的体积越占整个MyiQ光学模块的2/3，包括一块单色发射滤光片和一套350，000像素的CCD检测器。CCD检测器可以定量的检测各个反应孔内荧光强度。注意：系统软件所需的电脑配置见附录B。 尽量避免灰尘等微小颗粒沾染到镜片或透镜上。警告：用户不可自行擦拭MyiQ光学模块内的任何光学镜片和透镜，这有可能严重破坏光学系统。如MyiQ光学模块发生问题，请联系伯乐公司。1.2 MyiQ 系统的连接MyiQ系统连接共需要4根连接线（见图1.3）。圆型9针电源线：MyiQ 光学模块的电源线。注意：为避免光学系统短路，请用户在连接该线前将电源开关关闭（“O”位），同时操作过程中请保持双手干燥。并口线：通过这根25针并口线（雄端）可将MyiQ光学模块和电脑连接起来。电脑上要有一个兼容IE1284的8位双向并行接口或EPP型并行接口。MyiQ系统通过该连线将收集到的数据传入电脑。微型电话插头接线：在MyiQ 光学模块有两个微型电话插头接口，一个连接电源，一个连接CCD检测器。该连线就是将这两个接口连接起来。其作用是一旦发现CCD检测器发生光溢出，系统内部立刻产生信号通过CCD检测器的接口端传输到电源接口端，强制切断电源，起到一个保护作用。串口线：通过该接线将iCycler热循环仪和电脑连接起来。圆型9针电源线并口线微型电话插头接线电源开关图1.3 MyiQ连接侧视图2 MyiQ实时荧光定量PCR仪操作速成2.1 简介：MyiQ实时荧光定量PCR仪可以最多同时检测96个样品，系统在PCR反应过程中的信号收集时段内得到各孔的荧光信号，系统软件通过这些数据点绘制出荧光强度变化曲线。在反应结束后，用户可以通过系统软件分析这些数据曲线，从而得到所需的数据结果。MyiQ系统每次运行都需要用户在系统软件中设置两个文件：反应程序文件（Protocol file，后缀名.tmo）和反应板设置文件（Plate Setup file，后缀名.psm）。而实验中收集的数据会被系统储存为光学数据文件（Optical Data file，后缀名.odm）此外，MyiQ的每次运行还需要孔间差异因子（Well Factor）的数据。这个数据的作用是消除反应的孔间差，使得最终的结果更为准确。用户最好在每次运行前都进行一次孔间差异因子数据的更新，当然如果用以前实验中统计的数据，也是可以的。具体的内容详见5.4.2。2.2 MyiQ软件操作速成：2.2.1 总揽1. 接通电源，打开系统软件。在反应运行前，MyiQ光学模块必须预热30分钟以上。2. 选择或创建一个反应程序文件（Protocol file）。3. 选择或创建一个反应板设置文件（Plate Setup file）。4. 以选定的反应板设置文件运行选定的反应程序文件。以下情况请使用反应板内部矫正来获得孔间差异因子：伯乐 iQ SYBR Green SupermixSYBR Green 中含有10nM的荧光素每个反应孔中的探针含量相同以下情况请使用孔间差异矫正板来获得孔间差异因子：SYBR Green 中不含有荧光素每个反应孔中的探针含量不同终点检测不同荧光强度的探针注意：反应板加样操作规程在96孔薄壁反应板（96-well Thin Wall plate，产品序列号 223-9441）内加入PCR反应试剂和待测样本。完成后在反应板上盖一块光学级封带（Optical Quality sealing tape，产品序列号 223-9444），用扁平齿的封带涂抹器将其涂抹光滑。注意，无论带不带手套，都不要让手指接触到封带表面。完成后撕去封条四周的白条。如果不用96孔薄壁PCR反应板，而是用单独的PCR反应管或八连管时，请在加完样品后盖上相匹配的盖子。注意，为防止放入的PCR反应管被压碎，在使用绿色抗凝环（green anticondensation ring）时至少放8个反应管；如果没有使用该环，则至少要加14个反应管。2.2.2 选择或创建一个反应程序文件（Protocol file）选择一个已有的反应程序文件1. 在软件的Library模块中点击“View Protocol”窗口切换键，在这个窗口中可看到所有已保存的反应程序文件列表。2. 点击所需的反应程序文件。3. 点击“Run with Selected Plate Setup”键即可以选定的反应板设置文件运行该反应程序文件。创建或修改一个反应程序文件1. 用户在软件的Workshop模块中创建或修改一个反应程序文件。有三种方式可以进入该模块：在Library模块的“View Protocol”窗口中选中一个反应程序文件后点击“Edit this Protocol”键（修改这个反应程序文件）；在Library模块的“View Protocol”窗口中点击“Create a New Protocol”键（创建一个新的反应程序文件）；在软件界面上直接选择选择Workshop模块，然后“Edit Protocol”窗口切换键。2. 此时界面上会呈现一个表示反应程序文件具体内容的表格，用户可以点击“Insert Cycle”（插入循环）、“Delete Cycle”（删除循环）、“Insert Step”（插入步骤）、“Delete Step”（删除步骤）等键来插入/删除循环或步骤。3. 点击表格“Repeats”列某一表格即可修改循环的次数，点击表格的“Dwell Time”（保温时间）列的某一表格即可修改某一步骤的保温时间，点击表格的“Setpoint”（保温温度）列的某一表格即可修改某一步骤的保温温度。4. 在“Show Options”文件框中选择本次运行的属性（如梯度测试或熔点曲线测试等）5. 选择在哪个（些）步骤收集荧光信号。6. 在“Protocol Filename”栏中输入该文件的文件名，然后点击“Save this Protocol”键保存。7. 点击“Run with Selected Plate Setup”即可以选定的反应板设置文件运行该反应程序文件。创建一个梯度测试（Gradient）的反应程序文件1. 在“Show Options”文件框中中选择“Gradient”选项，此时表格中会多出抬头为“Gradient”的一列。2. 在表格中想要开始梯度测试的步骤的Gradient格打钩。3. 然后在该步骤的“Setpoint”格设置温度（最低温度），在“Ranger”格中设置测试梯度的跨度（默认为10oC）。4. 步骤3的操作也可以在界面的梯度测试显示框中进行修改，而系统会自动对反应程序文件的表格进行同步修改。5. 在“Protocol Filename”栏中输入该文件的文件名，然后点击“Save this Protocol”键保存。创建一个熔点曲线（Melt-Curve）的反应程序文件1. 在软件的Library模块中点击“View Protocol”窗口切换键，在这个窗口中查看到所有已保存的反应程序文件列表。2. 按照用户需要在“Protocol Files”文件框中选择以下反应程序文件：只做熔点曲线循环：MeltCurve.tmo文件先扩增再做熔点曲线循环：2StepAmp+Melt.tmo文件3. 点击“Edit this Protocol”进入Workshop模块对选定反应程序文件进行修改。4. 和设置其他反应程序文件一样对在表格上对热循环参数进行修改。5. 选择进行荧光收集的步骤，界面上会以绿色相机的图标表示。6. 在“Protocol Filename”栏中输入该文件的文件名，然后点击“Save this Protocol”键保存。2.2.3 选择或创建一个反应板设置文件（Plate Setup file）选择一个已有的反应板设置文件1. 在软件的Library模块中点击“View Plate Setup”窗口切换键，在这个窗口中可看到所有已保存的反应板设置文件列表。2. 在“Plate Setup Files”文件框中选择要查看的反应板设置文件。3. 点击“View Quantities/Identifiers”窗口切换键查看样品的类型、含量、标识（样品名称）等参数。4. 点击“View Plate Setup”窗口切换键，点击“Run with Selected Protocol” 可以选定的反应程序文件运行该反应板设置文件。修改或创建一个反应板设置文件1. 用户在软件的Workshop模块中创建或修改一个反应板设置文件。有三种方式可以进入该模块：在Library模块的“View Plate Setup”窗口中选中一个反应程序文件后点击“Edit this Plate Setup”键（修改这个反应板设置文件）；在Library模块的“View Plate Setup”窗口中点击“Create a New Plate Setup”键（创建一个新的反应板设置文件）；在软件界面上直接选择选择Workshop模块，然后“Edit Plate Setup”窗口切换键。2. 在“Fluorophore”文件框中选择使用的荧光基团。3. 点击样品对应类型的图标。4. 选择本次反应所使用的反应孔。5. 用户可以在“Sample Identifier”文件框中键入样品的标识（名称）。6. 如果要设置标准品，请点击“Standard”图标。7. 点击所使用反应孔，在随后出现的文件框在中定义这个标准品的浓度、标识、计量单位。选择标准品所使用的反应孔；选择计量单位；打开“Define a dilution series”文件框（定义标准品梯度），在“Starting concentration”文件框中输入标准品的起始浓度，在“Series Identifier”文件框中输入各标准品的标识（名称）；在“Dilution factor”文件框中输入相邻两个标准品间相差的倍数，然后再选择“Increasing”（升序排列）或“Decreasing”（降序排列）；当然，用户也可以直接在每个标准品选择好所使用的反应孔直接在“Standard Quantity”文件框中输入这个标准品的浓度，在“Sample Identifier”文件框中输入这个标准品的标识（名称）。8. 在“Plate Setup Filename”栏中输入该文件的文件名，然后点击“Save this Plate Setup”键保存。9. 点击“Run with Selected Protocol” 可以选定的反应程序文件运行该反应板设置文件。2.2.4 数据分析PCR定量当PCR反应开始后，软件界面就会切换到PCR定量模式，开始收集荧光数据。在反应结束后，也可以打开这个界面查看数据。1. 在软件的Library模块中点击“View Post-Run Data”窗口切换键，在这个窗口中可看到所有已保存的数据文件列表。2. 双击想要查看的数据文件。3. 系统此时会自动切换到Data Analysis 模块的“PCR Quantification”窗口。默认显示为Base Line Subtracted模式。4. 根据用户的设定，系统会自动计算出每个样品的Ct值。Auto Calculated 软件根据系统默认的设置计算Ct值；User Defined 用户可以修改计算Ct值的参数后再计算。5. 此时界面上的表格中会显示出每个样品的名称和Ct值。6. 点击“Select Wells”选择要进行分析的反应孔或删除不要进行分析的反应孔。图象选项1. 用户可以点击“Log View”键将分析结果的表达模式转换成Log模式。2. 右击曲线图，会弹出一个对话框，用户可以在这里调节另外一些图象选项。3. 点击“Define Trace Style”可以修改各曲线的颜色和标识。点击选中要修改的曲线；在“Select Color”中选择要调换的颜色；点击“Preview”可查看修改后的曲线图；点击“Apply”完成修改。4. 用户在这个界面中可以选择复制或打印数据或图象。PCR定量报告1. 点击“Report”键就可以得到报告。2. 用户可以挑选报告需要的内容。3. 保存或打印该报告。4. 点击“Report Viewer”键可继续分析数据。标准曲线如果在一次运行中用户设置了PCR标准品，那实验结束后Data Analysis 模块的PCR Standard Curve就会由灰（不可用）变黑（可用）。1. 在Data Analysis 模块中点击“PCR Standard Curve”窗口切换键，用户可以在这里查看标准曲线斜率、PCR效率等信息。2. 界面上还有一个表格显示所有标准品的的分析结果，包括Ct值、定量结果等。3. 点击“Reports”键即可获得标准曲线的报告。数据保存1. 在Data Analysis 模块中点击“View/Save Data”窗口切换键，用户可以在这里查看实验分析的结果。2. 点击“Reports”键即可获得报告。3. 点击“Save ODM File”键，此时弹出的“Autosave to ODM”对话框中用户可以查看分析参数设置（Data Analysis Setting）、分析结果（Modified Well Data）和熔点曲线数据（Melt Peak Data）。注意这些也会被储存到odm文件中，确定后即完成保存。用户可以在这个窗口中修改一些样品的属性。1. 点击一个样品孔，在随后弹出的对话框中可以修改这个样品的类型、标识等属性。2. 点击“Apply Change”可完成修改，点击“Restore Original Definitions”可取消修改。2.2.5 数据分析熔点曲线当用户在反应程序文件中设置了熔点曲线（Melt Curve）的属性后，即可在数据分析中分析得到熔点曲线的结果。1. 在软件的Library模块中点击“View Post-Run Data”窗口切换键。2. 选择要分析的数据。3. 如果该数据所使用的反应程序文件中包括有PCR扩增的部分，则系统会自动切换到Data Analysis 模块的“PCR Quantification”窗口，此时应点击“Melt Curve”窗口切换键切换到该窗口。4. 数据会以“Fluorescence vs Temperature”模式或“-dF/dT vs Temperature”模式表示。Fluorescence vs Temperature：该模式显示随着温度的升高或降低荧光曲线的变化；-dF/dT vs Temperature：该模式显示了荧光强度对于温度变化的一阶导数对于温度变化的曲线。5. 在“-dF/dT vs Temperature”模式中曲线的峰顶所对应的温度会在“Peak Description”表格中。同时该表格中还有样品标识、熔点温度等信息。6. 在“-dF/dT vs Temperature”模式中会有一根蓝色的峰阈值线，只有超过了这条线的峰系统才会识别。7. 用户可以根据自己的需要修改这条峰阈值线。8. 点击“Apply Change to Melt Peaks”键可完成修改，点击“Undo All Melt Peak Change”键就取消修改。9. 用户也可以根据需要自行删除峰（主要是针对出现一个以上峰的样品）。在表格中点击需要删除峰的行，选择“Delete Melt Peaks”选项来删除峰；点击“Apply Change to Melt Peaks”键即可完成删除。10. 如果用户要修改熔点曲线的起始温度或结束温度的话，选择“Edit Melt Peak begin/end temps”选项。点击表格中的“Begin Temp（起始温度）”或“End Temp（结束温度）”列；拖动橙色的温度变化条来调节温度；点击“Apply Change to Melt Peaks”键即可完成修改。11. 点击“Reports”键即可获得熔点曲线的报告。2.2.6 孔间差异矫正板操作何时要更新孔间差异矫正板产生的孔间差异因子终点法无法使用反应板内部矫正的情况，如使用没有荧光素的SYBR Green I或者各孔荧光素浓度不同（详见2.3）当影响荧光收集的环境因素发生了改变（如反应管用盖子代替了封条、反应液体积和以前不用等）当MyiQ光学模块被移动之后实验试剂及耗材伯乐iCycler iQ孔间差异因子稀释液（iCycler iQ External Well Factor Solution，产品序列号 170-8794）96孔薄壁反应板（96-well Thin Wall plate，产品序列号 223-9441）光学级封带（Optical Quality sealing tape，产品序列号 223-9444）微孔板封板器（Microplate Tape Applicator，产品序列号 170-8736 ）校正遮光框（Mask）1. 用ddH2O把10孔间差异因子稀释液稀释10倍。2. 把稀释后的孔间差异因子稀释液加到96孔薄壁反应板中，注意每个反应孔都要加同样体积的稀释液。然后用光学级封带将反应板封起来，并用封板器涂平。3. 把加完样的反应板放入MyiQ 实时荧光定量PCR仪中，打开软件，进入Run-Time模块的“Imaging Service”窗口。4. 点击“Optimize Bias”键（系统偏差矫正）。5. 点击“Calibrate”键（聚焦），然后再点击“Open”键。6. 点击“Make an Exposure”键，进行一次曝光。窗口上会显示出一幅反应板图象。如果图象中粉红色像素发生减少，则必须重新点击“Make an Exposure”键，重复这一过程直至粉红色像素不再减少。7. 点击“Show Mask”键。8. 点击“Optimize Mask Positions”键（优化遮光框位置），优化完成后，点击“OK”键。9. 点击“Save Optimized Masks”键保存优化数据。孔间差异矫正板数据收集10. 点击“Collect Persistent Well Factor”键，系统会自动转换到“Run-Prep”窗口。11. 在“Sample Volume”中输入反应液体积。12. 点击“Begin Run”键，系统会自动转换到“Thermal Cycler”窗口。13. 完成后，系统会自动弹出一个窗口提示其孔间差异因子数据已经更新完毕。2.3 孔间差异因子（Well Factor）在采用荧光实时法对PCR反应进行检测的过程中，反应管之间的差异对结果的准确性有一定的影响，这就是所谓的孔间差异因子（Well Factor）。为了获得更科学更真实的结果，MyiQ在PCR反应开始前必须获得孔间差异因子的数据，以便于对每个反应管中荧光信号强度进行矫正。一般矫正孔间差异因子的方法有两种，一是用孔间差异矫正板（Persistent Well Factors），二是反应板内部矫正（Experimental Plate）。用户可以根据图2.2来选择本次实验应该使用何种方法。如果要采用反应板内部矫正的方法，其前提是在每个反应管中必须含有相同浓度同种成分的荧光基团。比如，在一块反应板的每个反应管中都加入50nM荧光素，就可以使用反应板内部矫正。但如果某管中和其他管成分不同，比如某管中荧光素含量为100nM而其他反应管内为200nM的话，这种方法就不可行了。此时只能使用孔间差异矫正板的方法，详见5.4.2C。如果选择使用反应板内部矫正，系统软件会在用户设定的PCR热循环文件开始前先插入执行一个内容为95oC加热90秒的文件。这样用户在设置PCR热循环文件的时候就要考虑到这一点，在预变性段中要减去相应的时间。比如，您本来的设定是95oC预变性10分钟，这一来您就要改成95oC预变性8.5分钟。详见5.4.2B。如果在实验中采用如SYBR Green I等能与DNA结合的荧光染料，那么就不能使用反应板内部矫正。因为在PCR反应的靶DNA预变性过程中，这样的荧光信号强度比较弱，统计所得的孔间差异因子的数据偏差较大。解决这个问题的方法有两种，一是采用孔间差异矫正板；二是在PCR主反应液中加入伯乐 iQ SYBR Green Supermix。加入这种稀释液后，在95oC下SYBR Green I等的荧光信号强度会增加，这样用反应板内部矫正也能得到较准确的孔间差异因子的数据。图2.2 孔间差异因子数据收集方法的选择3 MyiQ系统软件简介3.1 ：MyiQ软件界面的构成用户在使用MyiQ软件进行一次实验时要编辑两个文件，一个叫反应程序文件（Protocol），其主要的内容包括PCR热循环的程序和荧光信号收集步骤的设置，系统将其保存为后缀为“tmo”的文件，具体设置见5.1；另一个叫反应板设置文件（Plate Setup），其作用是设置本次反应孔的样品信息，系统将其保存为后缀为“psm”的文件，具体设置见5.2。用户通过本软件可以很方便地进行各种设置。图3.1 默认的软件界面MyiQ的软件界面分为4个功能模块，分别是“Library”模块、“Workshop”模块、“Run Time Central”模块和“Data Analysis”模块。在界面的左侧就是这几个模块的切换键。通过这些模块，用户可以很方便使用MyiQ进行各项实验。如图3.1，这是用户刚打开软件时的默认界面，“Library” 模块的“View Protocol”窗口。3.1.1 ： Library 模块 Protocol Library是对管理已保存的反应程序文件、反应板设置文件、实验数据记录的模块。用户可以在其中实现以下功能：浏览已保存的反应程序文件浏览已保存的反应板设置程序文件浏览反应板设置文件中各反应管的标识和对应的模板量（标准品）。将数据记录切换到Data Analysis模块中进行分析。将已保存的反应程序文件切换到Workshop模块中进行修改。将已保存的反应板设置程序文件切换到Workshop模块中进行修改。以已保存的PCR热循环文件和反应板设置文件开始一次实验。3.1.2 ：Workshop 模块Workshop是设置反应程序文件和反应板设置文件的模块。用户可以在其中实现以下功能：修改已保存的反应程序文件修改已保存的反应板设置文件新建反应程序文件并将其保存新建反应板设置文件并将其保存以新建或修改好的反应程序文件和反应板设置文件开始一次实验。3.1.3 ：Run-Time Central 模块实验时当用户在Workshop模块的“Run Prep”窗口中确认完反应的各项设置后，系统自动转到Run Time Central模块。该模块实际上就是用来实时监测反应的各项参数，包括反应开始时间、预计结束时间、实时温度变化曲线等。在该模块中用户可以实现以下功能：查看实验的开始时间和剩余时间查看实验当前执行的步骤暂停、终止或继续反应在实验中增加/删除循环或步骤收集孔间差异矫正板产生的孔间差异因子数据校正遮光框位置3.1.4 ：Data Analysis 模块有两种进入Data Analysis模块的方法：一是在实验中，当系统开始收集实验数据时，Run-Time Central模块就会自动打开Data Analysis模块；二是您可以在Library模块中打开一个实验数据记录，系统会自动切换到Data Analysis模块。在该模块中用户可以实现以下功能：实时监控荧光数据浏览实验数据记录设置数据分析参数建立标准曲线进行终点法分析确定未知样品的初始模板量对实验数据进行统计分析查看、打印分析结果报告3.2 ：软件操作说明顺序我们把4个模块分开一一说明。3.3 ：常用术语以下是我们在本说明书中使用的一些软件术语：“窗口”（window）指当前软件界面上除了左面的模块切换键及上端选项栏的主体部分；“窗口切换键”（tab）指在窗口上面的选项框，点击其可在各窗口之间实现切换；“文件框”（box）分为以下几种：“text box”指可以输入文字的文件框，“field box”指仅可以查看的文件框，“dialog box”指需要选择的文件框。“键”（button）指界面上形状作成按键状，点击后会实现一定功能的图象。3.4 ：热循环参数（Thermal Cycling Parameters）反应程序文件中最主要的内容就是设置热循环参数。在MyiQ中一个PCR热循环文件可以最多包含9种不同的循环，每种循环最多可以有9个步骤。在步骤设置中，至少要设置保持温度（Setpoint Temperature）和保持时间（Dwelling Time）；在循环设置中，除了其各步骤设置外，至少还要设置其循环次数。一种循环最多重复600次。3.4.1保持温度和时间调控范围MyiQ的PCR热循环的温控范围是4.0100.0oC，保持时间的调控范围是1秒到99分钟59秒（99:59）。零保温时间（Zero Dwell Time）：如果某步骤保持时间设置为0秒，那么MyiQ会先将温度调节到该步骤设置的温度，然后立刻执行下一个步骤。3.4.2 反应文件选项在MyiQ的软件中，用户还可以对反应的文件进行很多高级选项的设置，详见5.1。永久保温模式（Infinite Hold）：一旦某个步骤被设置成该模式，则系统会一直保持该步骤设定的温度直到人为地结束该程序。梯度测试（Gradient）：在任一步骤中都可以将其设置成有125oC温度梯度变化。熔点曲线（Melt Curve）：可在一定温度范围内检测样品的熔点曲线。自动增加/降低保持温度（Increment/Decrement Temperature）：我们可以举个例子说明这个设置的作用。比如PCR热循环文件有一个步骤是55oC，30秒。而通过这个设置，用户可以使这个步骤每过一个循环温度上升（或下降）0.1oC。升降温速率（Ramping）：该项指的是执行PCR热循环文件时的加热/冷却速度。循环名称（Cycle Description）：定义文件中循环的名称。步骤名称（Step Process）：定义循环中步骤的名称。4 Library 模块在Library模块中，用户可以浏览已保存的反应程序文件、反应板设置文件、数据记录等。在该模块中也有修改、运行反应程序文件和反应板设置文件的选项。一旦用户选择了这些选项，系统会自动切换到 Workshop模块，详见第5章。在Library模块顶端，有四个窗口切换选择键，点击它们可进入不同的窗口。这些窗口分别是：View Protocols：查看已保存的反应程序文件（tmo文件），见图4.1和图4.2。View Plate Setup：管理已保存的反应板设置文件（psm文件），见图4.2和图4.3。View Quantities /Identifiers：显示选定反应板设置文件的详细信息，见图4.4。View Post-Run Data：查看实验数据记录，见图4.5。4.1 View Protocols窗口当用户进入MyiQ软件后，其默认的显示窗口就“View Protocol”窗口（见图4.1）。用户可以在该窗口下查看所有已经保存在硬盘或其他移动存储器（如光盘等）的反应程序文件。当用户选中哪个反应程序文件后，该文件的具体内容就会在窗口的下方显示出来。如图4.1，在窗口上半部的各文件框显示的是各反应程序文件的存储路径的有关信息：左上的文件框可选择目标反应程序文件所在的驱动器，如图4.1所示，该目标反应程序文件存储在C盘；左下的文件框用来选定目标反应程序文件的存储路径（必须在上面文件框选定的驱动器中），如图4.1所示，该目标反应程序文件存储路径为C:Program FilesBio-RadMyiQUser1；上述两个文件框右边的一个文件框（Protocol Files）显示所有选定路径下所有的反应程序文件（tmo文件），用户可对其进行选择；在上述几个下面的文件框，左面的“Viewing Protocol”显示当前的反应程序文件的文件名，右面“Selected Plate Setup”显示是已选好的反应板设置文件。在窗口的右上部是4个功能按键，依次是：Edit this protocol：点击该键，系统自动切换到Workshop模块的“Edit Protocol”窗口对当前反应程序文件进行修改；Create a new protocol：点击该键，系统自动切换到Workshop模块的“Edit Protocol”窗口，用户可以新建一个反应程序文件；Run with selected plate setup：点击该键，系统自动切换到Workshop模块的“Run Prep”窗口，用户可以以当前的反应程序文件（配合“View Plate Setup”中选定的反应板设置文件）进行实验；Print this protocol：打印窗口下端记录当前反应程序文件内容的表格。图4.1 View Protocols 窗口窗口的下半部显示的是当前反应程序文件的具体内容，主要由一张曲线图和一个表格组成（见图4.1）。在曲线图中，横坐标（X轴）代表反应温度，纵坐标（Y轴）代表反应时间。用户可把鼠标指针放在该图上右击，在弹出的对话框中可以选择对曲线图执行复制、打印等操作。在图中各部分代表的含义如下所述：曲线图顶端的抬头框中显示各循环的循环次数；抬头框下面的数字代表各步骤的保持温度（对应曲线X轴），再下面的数字代表保持时间（对应曲线Y轴）；某个步骤下面有个照相机形状图标代表系统在该步骤收集荧光信号（如图4.1中，60oC，0:30 下方）。黄色的照相机图标表示对这次本实验进行定量分析；绿色的照相机图标表示收集熔点曲线数据。如果图中曲线变粗（见图4.2），代表执行了梯度测试（Gradient），其相应的参数可见下方的表格。图4.2 View Protocols 窗口显示一个梯度测试的反应程序文件在曲线图下方的表格中，用户可以查看到这个反应程序文件的所有具体设置，包括一些在曲线图中无法显示的内容，如升/降温速率、梯度测试的起始温度、跨度等。用户对各个循环、各个步骤的说明也会显示在该表格中。此外，如果用户选择做梯度测试的话，在表格的右部（见图4.2）会出现一个数据条，显示在设置的温度跨度中每一个检测点的温度。如果在一个文件中不止一个温度梯度步骤，用户可以选择任一在数据条中显示。4.2 View Plate Setup窗口用户可以在该窗口下查看所有已经保存在硬盘或其他移动存储器（如光盘等）的反应板设置文件。当用户选中哪个反应板设置文件后，该文件的具体内容，如各孔样品类型、使用的荧光染料等就会在窗口的下方显示出来。图4.3 View Plate Setup窗口这个窗口的布局与“View Protocols”窗口十分相似，在窗口上半部的各文件框显示的是各反应板设置文件的存储路径的有关信息：左上的文件框可选择目标反应板设置文件所在的驱动器，如图4.3所示，该目标反应设置文件存储在C盘；左下的文件框用来选定目标反应板设置文件的存储路径（必须在上面文件框选定的驱动器中），如图4.3所示，该目标反应板设置文件存储路径为C:Program FilesBio-RadMyiQUser1；上述两个文件框右边的一个文件框（Plate Setup Files）显示所有选定路径下所有的反应板设置文件文件（psm文件），并对其进行选择；在上述几个下面的文件框，左面的“Viewing Plate Setup”显示当前的反应板设置文件的文件名，右面“Selected Protocol”显示是已选好的反应程序文件。在窗口的右上部是4个功能按键，依次是：Edit this plate setup：点击该键，系统自动切换到Workshop模块的“Edit Plate Setup”窗口对选定反应板设置文件进行修改；Create a new plate setup：点击该键，系统自动切换到Workshop模块的“Edit Plate Setup”窗口，用户可以新建一个反应板设置文件；Run with selected protocol：点击该键，系统自动切换到Workshop模块的“Run Prep”窗口，用户可以以当前的反应板设置文件（配合“View Protocol”中选定的反应程序文件）进行实验；End Point Analysis Run：Edit：点击该键，系统自动切换到Protocol Workshop模块的“Edit Plate Setup”窗口对选定反应板设置文件进行修改，详见5.2；Custom：点击该键，系统自动切换到Protocol Workshop模块的“Edit Plate Setup”窗口，用户可以新建一个反应板设置文件，详见5.2；Run：点击该键，系统自动切换到Protocol Workshop模块的“Run Prep”窗口，运行一次终点法的实验。在窗口左下方是96孔模拟布局图，显示的是各反应孔的设置情况。右下方的“Plate Setup Notes”文件框显示的是用户对当前反应板设置文件的说明。4.3 View Quantities and Identifiers窗口在该窗口中用户可以查看当前反应板设置文件各孔的一些详细设置信息（见图4.4），包括各孔的样品类型、样品标识（名称）、使用荧光染料种类、标准品浓度等。点击“Copy to Clipboard”键可将窗口中显示的表格复制到剪贴板中，便于用户将其粘贴到其他文档中去，当然用户也可以用Ctrl-C和Ctrl-V的快捷键完成该操作。点击“Print Spreadsheet”则可打印该表格。 图4.4 View Quantities/Identifiers 窗口4.4 View Post-Run Data窗口用户可以在该窗口下查看所有已经保存在硬盘或其他移动存储器（如光盘等）的数据记录文件。如图4.1，在窗口上半部的各文件框显示的是各反应程序文件的存储路径的有关信息：图4.5 View Post-Run Data 窗口左上的文件框可选择目标数据记录文件所在的驱动器，如图4.5所示，该目标反应程序文件存储在C盘；左下的文件框用来选定目标数据记录文件的存储路径（必须在上面文件框选定的驱动器中），如图4.5所示，该目标反应程序文件存储路径为C:Program FilesBio-RadMyiQUser1；上述两个文件框右边的一个文件框（Data Files）显示所有选定路径下所有的反应程序文件（odm文件），用户可对其进行选择；在上述几个下面的文件框，从上到下依次是：“Selected Data File”显示的是当前数据记录文件的文件名，“Protocol used in file”显示的是这次实验所使用的反应程序文件的文件名，“Plate Setup used in file”显示的是这次实验所使用的反应板设置文件。下方的“Data Run Notes”文件框显示的是用户对该数据记录的说明。4.4.1 打开数据记录如果要打开某个数据记录文件，在“Data Files”文件框中选中这个文件后点击“Analyze Data”键或双击这个文件名。5 Workshop 模块在Workshop模块中，用户可以新建、修改反应程序文件、反应板设置文件。5.1主要叙述如何新建、修改反应程序文件，5.2主要叙述如何新建、修改反应板设置文件。在Workshop模块有4个窗口，他们分别是：Edit Protocol：新建和修改反应程序文件，用户也可以通过该窗口开始一次运行；Edit Plate Setup：新建和修改反应板设置文件，用户也可以通过该窗口开始一次运行；View Quantities/Identifiers：显示反应板设置文件的详细信息；Run Prep：当用户在“Edit Protocol”窗口点击“Run with Selected Plate Setup”键或在“Edit Plate Setup”窗口点击“Run with Selected Protocol”键后，系统会自动切换到该窗口，对实验的一些细节进行确认后，点击“Begin Run”键后开始运行实验。5.1 Edit Protocol 窗口用户在这个窗口可以新建反应程序文件，也可以修改原有的反应程序文件，见图5.1。图5.1 Edit Protocol 窗口如图5.1，对于反应程序文件的修改主要是通过调整窗口下方的表格内的各项参数来实现的。整个窗口主要包括以下的组成部分：Protocol Filename文件框：该文件框显示是当前反应程序文件的文件名。用户可以在该文件框内修改文件名称，改完后点击旁边的“Save this Protocol”键保存。如果用户在该文件框输文件名时没有加“tmo”的后缀，系统会在保存的时候自动加上。Selected Plate Setup：该栏显示的是已选中的反应板设置文件。Save this Protocol键：点击该键后会将保存用户对当前反应程序文件所做的所有修改（详见5.1.6）。温度-时间曲线图：在该界面上部大约占整个窗口面积1/3的是PCR热循环文件的温度时间曲线图。横坐标代表保持时间（X轴），纵坐标代表保持温度（Y轴）。该图与下方的表格内容相对应。Show Options文件框：该文件框内有一些PCR反应设置的高级选项。Select Data Collection Step（s）文件框：通过该文件框设置荧光信号收集步骤（详见5.1.4）。文件表格：窗口下方是显示反应程序具体内容的表格（详见5.1.2）。Insert Cycle键：插入循环键。Insert Step键：插入步骤键。Delete Cycle键：删除循环键。Delete Step键：删除步骤键。曲线图的具体内容见5.1.1，表格及其他的具体设置见5.1.25.1.5，文件保存见5.1.6。5.1.1 曲线图在窗口上端的曲线图显示的是PCR热循环文件的情况（见图5.1）曲线图顶端的抬头框中显示各循环的循环次数。抬头框下面的数字代表各步骤的保持温度（对应曲线X轴），再下面的数字代表保持时间（对应曲线Y轴）。由于显示面积有限，有时候不是每个步骤的保持温度、保持时间都显示在这张图上。用户可以按住电脑键盘“Ctrl”键，点击鼠标左键拖曳，可放大曲线图上的某个区域的横坐标，从而看清某些原先看不到的步骤的保持温度和时间。点击曲线图内任意处即可复原。某个步骤下面有个照相机形状图标代表系统在该步骤收集荧光信号。黄色的照相机图标表示对这次本实验进行定量分析；绿色的照相机图标表示收集熔点曲线数据。把鼠标指针放在曲线图内任意处右击，系统会弹出以下对话框：图5.2 曲线图右击弹出文件框Copy Graph：将该曲线图复制到剪贴板中，从而用户可将其粘贴到其他文档中去。Print Graph：打印曲线图5.1.2 文件表格中的保持温度和保持时间设置Edit Protocol窗口下部的表格显示了反应程序文